全 文 ：收稿日期:2007-10-08
基金项目:国家林业局948项目(2001-24)
作者简介:周蕴薇,博士后在站,副教授,硕士生导师,研究方向:园林植物育种,E-mail:zhouyunwei@hotmail.com
通讯作者:戴思兰,教授,博士生导师,研究方向:园林植物育种,E-mail:silandai@sina.com
双向电泳技术是目前蛋白质组学研究的关键技术,包括蛋白质的提取、等电聚焦(Isoelectrofocusing,
IEF)、SDS-PAGE和凝胶染色等步骤。自 1975年 P.H.O’Farel建立该技术以来,第一向已从载体两性电解
质 pH梯度(CarierAmpholytepHGradient)等电聚焦发展到固相 pH梯度(ImmobilizedpHGradient,IPG)等
电聚焦,使双向电泳技术的分辨率和重复性得到了很大提高[1]。这一技术在生物蛋白质研究中得到了广泛
的应用,目前已成为分离蛋白的有效手段。其在微生物和动物蛋白质研究方面的应用较多,在植物特别是
木本植物蛋白的研究方面应用的相对较少。由于木本植物组织中的色素、酚和醌等次生代谢物质较细菌和
草本植物中的多,所以双向电泳技术在木本植物的应用上受到很大的限制,且电泳分析通常很难获得满意
的结果。
山茶(CameliajaponicaL.)是中国的传统名花,为常绿阔叶树种,抗寒育种对于扩大其栽培范围具有重
要意义,且已有了不少品种[2]。但是,传统的抗寒育种方法周期长,通过双向电泳分析山茶低温诱导前后蛋
白质图谱的差异,寻找到与低温相关的蛋白质,并进一步分离相关基因,这对揭示山茶的抗寒机理及加速
其抗寒育种进程都具有重要意义。但山茶富含酚类、脂类和醌类等次生代谢物质,双向电泳有一定的难度,
国内外未见报道。以 3年生青岛居群(俗称“耐冬”)山茶的叶片为材料,利用固相 pH胶条,初步建立了山
茶叶片可溶性蛋白的双向电泳技术体系,以期为进一步的山茶低温诱导蛋白的研究奠定基础。
山茶叶片可溶性蛋白双向电泳技术的建立
周蕴薇 1,2 董文珂 1 刘艳萍 2 戴思兰 1
(1北京林业大学园林学院,北京 100083;2东北林业大学园林学院,哈尔滨 150040)
摘 要: 建立了山茶低温诱导蛋白研究中叶片蛋白双向电泳技术体系.采用固相pH胶条在IPGphor TM等电
聚焦系统上进行等电聚焦,在EtanTM DaltⅡ高通量电泳仪上进行SDS-PAGE电泳,以银染法染色,得到了分离效果
良好的蛋白质双向电泳图谱。讨论了蛋白沉降方法、蛋白提取液的组成及其他技术环节对蛋白图谱的影响。
关键词: 山茶 叶片蛋白 双向电泳
ImprovementinTwo-dimensionalGelElectrophoresisofProteins
intheCameliajaponicaLeaf
ZhouYunwei1,2 DongWenke1 LiuYanping2 DaiSilan1
(1ColegeofLandscapeArchitecture,BeijingForestryUniversity,Beijing100083;
2ColegeofLandscapeArchitecture,NortheastForestryUniversity,Haerbin150040)
Abstract: Thispaperreportedtheimprovementin2-Dgelelectrophoresisproteomeofthecold-inducedproteinsofthe
leafofCameliajaponica.AnIPGphorTMunitwithimmobilepHgradientstripswasusedinandtheEtanTMDaltⅡsystemin
SDS-PAGE.The2-Dgelwasstainedbymethodsofsilver,andthebeterseparatingproteinpaterncouldbegainedbythis
method.Theefectofproteinsedimentationmethod,compositionofproteinextractionbuferandotherparametersonprotein
paternwerediscused.
Keywords: Cameliajaponica LeafproteinsTwo-dimensionalgelelectrophoresis
2008年第2期
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告·
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第2期
1 材料与方法
1.1 试验材料
实验材料为 3年生青岛居群山茶的扦插苗,取叶片用于实验。
1.1.1 设备与试剂 试验设备:HitachiSCR20BC低温高速离心机(日本,Hitachi)、UV-2450紫外分光光度计
(日本,Shimadzu)、AmershamBioscience公司的IPGphorTM等电聚焦系统、EtanTMDaltⅡ垂直板电泳系统和
灌胶模具。
试验试剂:pH3~10和 pH4~7的线性 IPG胶条 (长 18cm)、3-[(3-胆酰胺丙基)-二乙胺]-丙磺酸
(CHAPS)、苯甲基磺酰氟(PMSF)、乙二氨四乙酸(EDTA)、二硫苏糖醇(DTT)、尿素(Urea)、碘代乙酰胺
(idoacetamide)和矿物油(购于 AmershamBiosciences公司)。
1.1.2 溶液配方 样品提取试剂:A)10%三氯乙酸(TCA)和 10mmol·L-1DTT溶于丙酮中;B)丙酮(用时
加入 10mmol·L-1DTT)、1mmol·L-1PMSF和 2mmol·L-1EDTA;C)90%丙酮 (用时加入 10mmol·L-1DTT)、
1mmol·L-1PMSF和 2mmol·L-1EDTA。
全蛋白抽提液:8mol·L-1尿素、4%(W/V)CHAPS、0.5%IPG缓冲液 (pH3.0~10或 pH4~7)、20mmol·L-1
Tris-base(pH8.5)、10mmol·L-1DTT、1mmol·L-1苯甲基磺酰氟(PMSF)和 2mmol·L-1EDTA,溶于双蒸水。
可溶性蛋白提取液 I:25mmol·L-1Tris-HCl、10mmol·L-1KCl和 20mmol·L-1MgCl2;可溶性蛋白提取液 I:
7mol·L-1尿素、2mol·L-1硫脲(thiourea)、4%NP-40、0.5%两性电解质(pH3.5~9.5)和 20mmol·L-1Tris-HCl
(pH8.5)。
肿胀液:8mol·L-1尿素、2%(W/V)CHAPS和适量溴酚蓝 (bromophenolblue),双蒸水定容,使用前每
2.5ml肿胀液加入 7mgDTT。
平衡液:1.5mol·L-1Tris-HCl(pH8.8)、6mol·L-1尿素、87%甘油(V/V)、2%SDS(W/V)和适量溴酚蓝,双
蒸水定容,-20℃保存。平衡液 A:使用前向平衡液中加 1%DTT;平衡液 B:使用前向平衡液中加入 2.5%碘
代乙酰胺。
SDS凝胶缓冲液:1.5mol·L-1Tris-HCl(pH8.8),4℃保存。SDS-PAGE电极缓冲液(pH8.3):25mmol·L-1
Tris-base、192mmol·L-1甘氨酸和 0.1%(W/V)SDS。
替换液:50ml甘油、25ml凝胶缓冲液和适量溴酚蓝,双蒸水定容至 100ml。
考马斯亮蓝染色液:0.1%考马斯亮蓝 G-250、25%乙醇、8%冰醋酸和 67%双蒸水。
脱色液:25%乙醇、8%乙酸和 67%双蒸水。
琼脂糖封胶液:100mlSDS-PAGE电极缓冲液(pH8.3)和低熔点琼脂糖 0.5%,加热溶解,以 2ml为单位
分装,室温保存。
银染试剂:参见郭尧君(1999)的方法。
1.2 实验方法
1.2.1 蛋白质提取 全蛋白质的提取:取 3年生扦插苗叶片用于实验,-70℃冻存。称量样品 1g(鲜重);加
入样品鲜重 10%的 PVP(polyvinylpyrolidone,聚乙烯吡咯烷酮)于-20℃预冷研钵中将冷冻的样品研磨至粉
末状,转移至预冷的 10ml离心管中,加入鲜重样品 10倍体积的溶液 A悬浮,于-20℃沉降 1h,4℃、35000r/
min离心 15min,弃上清;沉淀用鲜重样品 10倍体积的溶液 B重悬浮,混匀于-20℃静置 45~60min,4℃、
35000r/min离心 15min,弃上清;沉淀用鲜重样品 10倍体积的溶液 C重悬浮,混匀于-20℃静置 45~60min,
4℃、35000r/min离心 15min,弃上清;沉淀用鲜重样品 10倍体积的溶液 B重悬浮,混匀于-20℃静置 45~
60min,4℃、35000r/min离心 15min,弃上清。沉淀于真空干燥机中干燥,约 30min(以干燥程度为准,时间越
短越好);除尽有机溶剂;按 10mg干粉末加 200μl蛋白抽提液的比例,将样品与蛋白抽提液充分混匀;冰浴
超声 10min(超声 2s、间隔 4s),40000r/min离心 30min,弃沉淀,上清为所需的蛋白溶液;用改良的 Bradford
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法测定蛋白溶液的浓度。
可溶性蛋白质的提取:称量样品 2g(鲜重),入预冷的研钵中研磨成粉末(研磨时加少许 PVP),转至已
有 10ml可溶性蛋白提取液 I的 50ml离心管中。加入终浓度 1mmol·L-1/minSF和 1mmol·L-1EDTA混匀,
5min后加入终浓度为 10mmol·L-1DTT,震荡摇匀,于冰上放置 30min。4℃、20000r/min离心 30min,转上清
于另一离心管中(测定上清体积)。向管中加入 6倍体积的 10%的 TCA(丙酮配制,0.007%DTT),-20℃沉
淀 2~3h,4℃、11000r/min离心 30min,弃上清。沉淀用 2倍体积(第一次离心后上清体积)丙酮(含 0.007%
DTT)沉淀 1h,4℃、11000r/min离心 30min,弃上清。重复上一步骤 2次。沉淀用 2倍体积 90%丙酮洗,沉淀
30min,4℃、11000r/min离心 30min,再重复一次。沉淀用 2倍体积丙酮洗,沉淀 30min,4°C、11000r/min离
心 30min。沉淀真空干燥约 5min,除尽有机溶剂。按 10mg干粉末加 100μl可溶性蛋白抽提液Ⅱ的比例,加
入 1mmol·L-1/minSF、2mmol·L-1EDTA和 10mmol·L-1DTT,超声 5min,充分溶解 1h,10℃、40000r/min离心
15min,上清为所需的蛋白溶液;用改良的 Bradford法测定蛋白样品的蛋白浓度。蛋白样品溶液小量分装,-
80℃保存。
1.2.2 等电聚焦 实验采用 18cm长的 IPG胶条。考马斯亮兰染色法的蛋白质上样量为 1mg,银染上样量
200μg和 150μg。根据定量结果取适量的蛋白质,加 1mol·L-1DTT到终浓度 50mmol·L-1需要的体积,补加
IPG缓冲液到终浓度 0.2%或者 0.5%的体积,加 Rehydration缓冲液到该胶条的上样体积 350μl。充分混匀
10℃、14000r/min离心 5min,取上清液。取出胶条室温下平衡放置 10min,沿着聚焦盘中槽的边缘从左至右
线性加入样品,用镊子轻轻去除预制 IPG胶条上的保护层。将 IPG胶条胶面朝下置于聚焦盘中样品溶液
上,除去胶面与样品液之间的气泡。缓慢的加入矿物油,盖上胶条槽的盖子。先以无电压泡胀 8h,然后以
50V低电压泡胀 4h后进行等电聚焦。泡胀与聚焦参数见表 1。
一般无电压泡胀与低电压 50V泡胀的时间加起来为 12h,无电压泡胀能够使小分子蛋白进入胶内,低
电压泡胀能够使大分子量蛋白容易进入胶内。如果某些样品达不到设置的 8000V/h,以总伏小时数能够达
到设置值为等电聚焦完成标准。
1.2.3 胶条平衡及 SDS-PAGE 拿出适量平
衡液融化平分到平衡管中,一半加入 1%
DTT,一半加入 2.5%碘代乙酰胺,充分溶解。
等电聚焦完成后,关掉电源,用镊子夹出胶
条,胶面朝上放在湿润的滤纸上,用另外一张
湿润的滤纸覆盖在胶面上,轻轻吸去上面的
油。使胶条支持膜紧贴平衡管壁放进含 DTT
的平衡液中进行还原,低速摇床上放置
15min,把胶条取出来转入含碘代乙酰胺的平
衡管中,烷基化打开的二硫键,低速摇床上放置 15min。
在灌胶模具上灌制 12%SDS分离胶凝胶,水饱和正丁醇封胶,凝胶聚合 1h以上,凝胶要避免产生气
泡。小心将已平衡好的第一向胶条放置在胶面上,支持膜紧贴长玻板,轻轻压紧,胶条与胶面之间不要有气
泡,胶条碱端加入分子量 marker,覆盖一层 0.5%琼脂糖固定胶条开始电泳,示踪溴酚蓝迁移至距离凝胶底
边 1.5cm停止电泳。
1.2.4 染色和脱色 电泳结束后,pH3~10的胶条采用采用考马斯亮蓝染色法染色。染色 6h后脱色。pH4~
7的胶条采用银染法染色。胶图用 UMAXPowerLook2100型扫描仪以 300dpi进行扫描。
2 结果与分析
以全蛋白质提取方法,分别以 pH3~10和 pH4~7的长 18cm的胶条进行实验。
表 1 IEF参数(20℃,18cm胶条,每一胶条最大电流 50mA)
周蕴薇等:山茶叶片可溶性蛋白双向电泳技术的建立 129
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第2期
采用 pH3~10的胶条电泳,1mg蛋白质上样,考马斯亮蓝染色并脱色后,只得到约 20个蛋白点。而且蛋白质
点都集中在 pH4~7的范围内,多为酸性蛋白,碱性蛋白几乎没有(图 1)。
根据 pH3~10的胶条的实验结果,用 pH4~7的胶条电泳,200μg蛋白质上样,银染方法染色后,分离结
果明显改善,得到蛋白质点近 500个,蛋白质点较均匀的分布于整个 pH梯度内。但在 pH5附近有较深的
背景,还有一部分蛋白没有分开(图 2)。
采用可溶性蛋白质的提取方法,pH4~7的胶条电泳,150μg蛋白质上样,银染方法染色,分离效果良
好,而且背景很浅。得到近 400个蛋白质点(图 3)。
图 1 山茶叶片全蛋白质 2-D电
泳图谱
pH3~10的 IPG胶条,上样蛋白
量为 1mg,凝胶浓度 12%,考染
图 2 山茶叶片全蛋白质 2-D电
泳图谱
pH4~7的 IPG胶条,上样蛋白量
为 200μg,凝胶浓度 12%,银染
图 3 山茶叶片可溶性蛋白质 2-
D电泳图谱
pH4~7的 IPG胶条,上样蛋白量
为 150μg,凝胶浓度 12%,银染
3 讨论
3.1 蛋白沉降方法
TCA/丙酮沉降法是植物蛋白常用的一种提取方法,该法能将样品中的大部分色素、脂类、核酸和盐等
除去,并能抑制蛋白酶的活性,特别是能浓缩特殊的碱性蛋白质,如核糖体蛋白质,但由于沉降后部分蛋白
质不能重新溶解从而导致丢失[3]。山茶叶片中含有大量的酚类、色素、脂类和糖类等对等电聚焦有严重影响
的物质,能否除去这些物质直接影响双向电泳效果。在山茶叶片全蛋白的提取过程中采用了 TCA/丙酮沉
降法,获得的双向电泳胶图在酸端 pH5处有一条纵向的条带难以去除(图 2)。表明有可能存在影响电泳效
果的物质未能完全去除。为了改善双向电泳体系,提取了叶片的可溶性蛋白,并采用了三氯甲烷沉淀法。此
法在 SDS-PAGE电泳中没能显示出清晰的条带。为进一步优化体系,用 TCA/丙酮沉降法提取可溶性蛋白,
去除了酸端的条带,获得了较清晰的蛋白点(图 3)。TCA不利于蛋白的抽提,使用浓度不宜过高,在后面的
丙酮处理中,应尽量除去。另外,在提取可溶性蛋白的过程中,增加了丙酮清洗的次数,对于去除杂质起到
了重要的作用。
3.2 蛋白提取液组成
影响双向电泳分离效果的关键因素是蛋白样品的制备,除了蛋白沉淀方法直接决定双向电泳效果之
外,蛋白提取液的组成也是决定双向电泳成功与否的重要因素。目前国内外常用的蛋白质提取液(9mol·L-1
尿素、2%~4%CHAPS、1%DTT和 2%V/V载体两性电解质)还是基于 O’Farel的尿素裂解液修改而成[4]。
由于蛋白质表达的动态变化很大,并且不同蛋白质的分子量、等电点和溶解性存在很大的差异,细胞或组
织中蛋白的提取液组成应依据参考文献,根据材料的种类、取样部位及发育时期等进行适当调整。
蛋白提取液的主要成分应包括变性剂、表面活性剂、还原剂、蛋白酶抑制剂和载体两性电解质几种重
要的组成成分。其中变性剂用于最大限度的增加蛋白的溶解性,要求不能对等电聚焦和染色有影响,即不
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能带电荷。尿素是较理想的中性增溶剂,它能很好的增加蛋白质的溶解度,破坏蛋白质的高级结构,另一种
增溶剂硫脲可以部分地替代尿素,硫脲与尿素一起,能增加疏水膜蛋白的溶解性,获得更多的蛋白质点[5,6],
一般是 2mol·L-1的硫脲与 5~7mol·L-1尿素结合使用。2mol·L-1的硫脲尿与 7mol·L-1的尿素结合使用适合
山茶叶片可溶性蛋白质的提取。
蛋白质在去折叠后,会暴露出大量的疏水性基团,在蛋白提取液中需要至少 1种表面活性剂来溶解疏
水基团。常用的有阴离子去污剂 SDS,非离子去污剂 TritonX-100、NP-40及两性离子去污剂 CHAPS、ASB-
14、C8和 SB3-10等。SDS可以有效地增加大多数蛋白质的溶解性并抑制蛋白酶的活性,但不利于稳定等电
聚焦中蛋白质的等电点,易导致聚焦失败。非离子型去污剂和两性离子去污剂能在不破坏蛋白质结构,保
持生物活性的情况下改善蛋白质的溶解度[7],但是必须选择合适的浓度,浓度太低不能改善蛋白质的溶解
性,浓度太高会使蛋白带变宽,影响分辨率和引起纹理现象。CHAPS是最近常用的两性离子去污剂[8],浓度
为 2%~5%。在山茶全蛋白提取过程中应用了 4%(W/V)CHAPS;可溶性蛋白提取的过程中,应用了浓度为
4%的 NP-40,很好地提高了山茶叶片蛋白质的溶解性。
在变性剂和表面活性剂的作用条件下,加入还原剂可使已变性的蛋白质展开更完全,溶解更彻底。一
般使用 β-巯基乙醇、DTT和二硫赤藓糖醇(DTE)等还原剂[9],DTT和 DTE本身带有电荷,在等电聚焦时会
迁移到 pH范围以外,从而使某些蛋白质的二硫键重新配对使溶解度降低而重新沉淀下来。非离子型还原
剂如三丁基膦(TBP)2mmol·L-1能增加蛋白质的溶解性[10],并可帮助蛋白质从第一向转移到第二向。采用
DTT作为还原剂。
蛋白酶抑制剂能够暂时或者永久性的破坏蛋白酶的活性,减少蛋白质被降解和修饰的可能性。常用的
蛋白酶抑制剂包括 FMSF、EDTA、Cocktail等[11]。PMSF可抑制丝氨酸蛋白酶和巯基蛋白酶,EDTA可抑制金
属蛋白酶。Cocktail是多种蛋白酶抑制剂的混合物;可溶性蛋白酶抑制剂 FMSF和 EDTA。由于 FMSF在水溶
液中半衰期很短,而且遇 DTT失效,所以 PMSF需新鲜加入,充分混匀,约 5min后加入 DTT。
3.3 其他技术环节
样品在冷冻条件下,易破碎,且蛋白不易降解。山茶叶片中色素、酚类物质含量很高,研磨应在液氮条
件下迅速进行,并加入适量 PVP,充分研磨,形成粉末后,迅速移入蛋白提取液中,以最大限度的去除酚类
物质的影响及有效的抑制蛋白酶的活性。采用本研究的研磨与提取方法,1g叶片约能提取 3mg蛋白质。固
相 IPG胶条,具有 pH梯度稳定、重复性好、分辨率高、上样量大和操作简便等特点。本实验首先选用 pH3~
10的宽范围 IPG胶条做预试验,实验结果显示,只得到了 50个蛋白质点,蛋白点多集中于酸端,之后改用
pH4~7的 IPG胶条,蛋白质点达到 400~500左右,2-D图谱得到明显的改善。用于 2-D蛋白质检测的常用
方法是考马斯亮蓝染色法、银染法和荧光染色法。考马斯亮蓝染色灵敏度较低,检测限为 0.2~0.5μg。银染
灵敏度很高,检测限为 0.1ng。应用考马斯亮蓝染色法的上样量在 1mg,获得了较清晰的蛋白质点。在全蛋
白的双向电泳实验中,18cm固相胶条银染的上样量为 200μg,在可溶性蛋白的双向电泳实验中,18cm固相
胶条银染的上样量为 150μg。过高的上样量会使染色背景过深,过低则得不到足够的蛋白质点。本实验采
用银染法得到的 2-D图谱背景比较清晰,得到的蛋白质 2-D图谱很好。可以利用图像分析软件对图谱间的
差异进一步做各种分析。
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周蕴薇等:山茶叶片可溶性蛋白双向电泳技术的建立 131
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图 6 小麦 WeIF3c与其它物种 eIF3c1氨基酸序列的系统树
3讨论
在 2003年,Valasek,L等完成了酵母中各种蛋白翻译起始因子间的相互作用图。这为研究各种蛋白间
的相互作用打下了基础[5]。但是目前在植物中对于 eIF3c只有对拟南芥有一定的研究,其它的植物很少有
涉及,从 genebank中查找有关 eIF3c的序列,植物中只找到我们比对的几个序列,除了拟南芥,其它也都是
推测的 eIF3c基因序列,因此对于研究植物尤其是作物中的 eIF3c还是很有必要的。
李竑等[3]在 2003年克隆了水稻的 eIF3a大亚基的的编码基因,这是国内首次涉及关于 eIF3基因的研
究。目前在小麦中克隆的蛋白翻译起始因子有eIF-1A[6]、eIF-2[7]、eIF4B[8]和eIF5(genebank序列号:EF190329),
但是未见有其它翻译起始因子的报道。而在国内尚未进行有关植物eIF3c基因的研究,而且有关小麦中真核蛋
白翻译起始因子 eIF3的研究也未见报道。克隆的小麦 eIF3c基因为作物,尤其是小麦的翻译机制以及这些
因子具体功能的研究打下了基础。
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