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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010 年第 7 期
农杆菌介导的紫茎泽兰遗传转化研究
宋洪英 谢响明 刘忠华 牛伯庆 韩潇
(北京林业大学生物科学与技术学院，北京 100083)
摘 要: 以紫茎泽兰为受体材料，GUS基因为报告基因，对农杆菌介导的遗传转化条件及影响因素进行研究，建立了农
杆菌介导的紫茎泽兰遗传转化体系。结果表明，将未经过预培养的幼叶外植体在 OD600为 0. 4 的稀释菌液中浸泡 12 min，共培
养 3 d后，转移到加有卡那霉素 50 mg /L(筛选压)和羧苄青霉素 250 mg /L的分化培养基上，经过 20 d外植体直接分化出不定
芽，诱导生根成苗。经 PCR和组织化学染色鉴定，可稳定获得较高的阳性转化率。
关键词: 紫茎泽兰 农杆菌 遗传转化 GUS基因
Agrobacterium tumefaciens-mediated Genetic Transformation of
Eupatorium adenophorum Spreng
Song Hongying Xie Xiangming Liu Zhonghua Niu Boqing Han Xiao
(College of Biological Sciences and Biotechnology，Beijing Forestry University，Beijing 100083)
Abstract: With Eupatorium adenophorum Spreng as acceptor materials，GUS gene as reporter gene，a high efficient Agrobacterium
tumefaciens-mediated genetic transformation of E． adenophorum was established． Meanwhile，relevant conditions and factors were stud-
ied． The final optimal procedure includes dipping the explants which were not pre-trained in the diluted Agrobacterium tumefaciens liq-
uid(OD600 = 0. 4)for 12 min，after co-culturing for 3 days，and transfering the explants to differentiation medium containing 50 mg /L ka-
namycin(as selecting pressure)and 250 mg /L carbencillin． The adventicious shoots was induced after about 20 days，then induction of
roots． Potsitive transgenetic plants were obtained by PCR and histochemical staining analysis．
Key words: Eupatorium adenophorum Spreng Agrobacterium tumefaciens Genetic transformation GUS gene
收稿日期:2010-04-21
基金项目:农业部公益性行业科研专项(200803021-030)
作者简介:宋洪英，女，硕士研究生，研究方向:植物分子生物学;E-mail:shya85@ 163． com
通讯作者:谢响明，男，教授，E-mail:xiangmingxie@ sina． com;刘忠华，男，副教授，E-mail:liuzh6@ bjfu． edu． cn
紫茎泽兰(Eupatorium adenophorum Spreng)俗
称破坏草、解放草，是双子叶植物，纲、菊目菊科泽兰
属的多年生草本植物，原产于墨西哥至哥斯达黎加
一带，后作为观赏植物引种到欧洲、大洋洲和亚洲，
现已广泛分布在热带、亚热带地区的 30 多个国家和
地区。因其传播速度快，侵占能力强，成为了一种世
界性的恶性有害杂草［1］。1935 年，我国在云南省南
部首次发现，现已蔓延至四川、贵州、广西和西藏等
地。紫茎泽兰入侵农田、林地、草地后，与庄稼、林
木、牧草争水肥、争空间、争光热，严重影响农作物、
林木、牧草的生长［2］，对当地的农业生产造成了不
可估量的经济损失。
紫茎泽兰作为一种重要的外来入侵植物，已经
成为研究外来植物入侵的模式生物，受到广泛关
注［3］。目前，虽然已经有利用丛生芽直接增殖和愈
伤组织再分化两条途径建立紫茎泽兰的无性系［3］
的相关报道，但是到目前为止，关于紫茎泽兰转化植
株的获得还未见报道。本研究在潘华清等［4］报道
的紫茎泽兰再生研究基础上，进行组织培养条件的
进一步优化，最终建立一套以幼叶为外植体的高效
遗传转化体系，为今后开展紫茎泽兰的转基因研究
奠定了基础。
1 材料与方法
1. 1 材料
紫茎泽兰种子由中国农业科学院赠予;含质粒
PBI121 的根癌农杆菌 LBA4404(带有 GUS 报告基
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2010 年第 7 期
因)为本实验室保存。
1. 2 培养基和培养条件
以 MS［5］为基本培养基，蔗糖浓度 3%，琼脂
0. 4%，pH5. 8，不同的培养阶段添加不同种类和浓度
的植物生长调节物质。YEB 培养基［6］:蛋白胨
5. 0 g /L +酵母提取物 1. 0 g /L +牛肉膏 5. 0 g /L +
MgSO4 2. 0 mmol /L，pH7. 0。培养温度为(25 ± 1)℃，
光照时间 12 h /d，光照度为 1 500 －2 000 lx［7］。
1. 3 方法
1. 3. 1 高效再生培养 挑选种子，0. 2% NaClO 表
面消毒 15 min，无菌水冲洗 4 － 5 次，然后接种到
MS +6-BA 1. 0 mg /L培养基培养 20 d，剪取分化出来
的芽转接到MS +6-BA 2. 0 mg /L + NAA 0. 05 mg /L继
代培养基［3］增殖培养，待芽长到 3 － 4 cm 时，转至
1 /2 MS + IAA 0. 1 mg /L培养基［4］上生根培养，生根
率为 100%。
1. 3. 2 遗传转化过程 将菌株 LBA4404(包含质
粒 pBI121)在带有 100 mg /L 卡那霉素(Kanamycin，
Km)和链霉素(Streptomycin，Str)100 mg /L 的 YEB
固体培养基上划单菌落，于 28℃培养箱中培养 2 d;
挑取单菌落并接种到 50 mL 带有 Km 100 mg /L 和
Str 100 mg /L的 YEB 液体培养基中，28℃下 160 r /
min振荡培养，将培养物于 5 000 r /min离心 10 min，
收集菌体，用液体 MS 培养基稀释菌体 OD600至 0. 4
左右［8］，剪取健壮无菌苗的幼嫩叶片成 1 cm × 1 cm
大小，浸入农杆菌液中并不时摇晃，使外植体在菌液
中侵染 12 min。取出叶片，先用无菌滤纸吸干多余
菌液，再转入 MS + 6-BA 2 mg /L + NAA 0. 05 mg /L
+ KT 2 mg /L［4］的分化培养基上共培养，暗培养 3 d
后，转到羧苄青霉素(Carbencillin，Car)250 mg /L 和
Km 50 mg /L的分化培养基直接分化出芽。25 d后统
计分化出芽的外植体数目，将长约 1 cm 的抗性芽转
到加有 Km 100 mg /L和 Car 200 mg /L的培养基上进
行生根培养［9］。培养条件与 1. 3. 1相同。
1. 3. 3 抗性植株的鉴定 先采用 GUS 活性染色
进行初步鉴定［10］，后用 CTAB 方法［11］提取紫茎泽
兰植株的总 DNA，以 Km 抗性植株的总 DNA 为模
板，含报告基因的 PBI121 质粒为阳性对照，未转
基因植株为阴性对照进行 PCR 扩增，反应条件:
95℃ 5 min变性，94℃ 50 s，60℃ 30 s，72℃ 50 s，
循环 32 次，72℃ 10 min。报告基因 gusA的上游引
物为 5-AGC CGA TGT CAC GCC GTA TG-3，下游
引物为 5-TCC GCA TCA CGC AGT TCA AC-3。
1. 4 影响农杆菌转化效率的因素探究
1. 4. 1 抗性选择压力 剪取无菌植株的幼叶成
1 cm ×1 cm 大小，放入含有不同 Km 浓度(分别为
0、25、50、100 mg /L)的分化培养基上，每个处理 30
个外植体，重复 3 次，观察抗性压力对外植体分化的
影响，以确定筛选压力。
1. 4. 2 菌液浸染时间 以 OD600值为 0. 4 的菌液
稀释浓度作为固定值，设定一系列浸染时间(3、6、
9、12、15、20 min) ，以未侵染的组织材料作为阴性对
照，观察不同浸染时间对外植体抗性芽分化的影响。
1. 4. 3 共培养时间 设置共培养时间分别为 1、2、
3、4、5 d，对比不同时间对抗性芽分化的影响。
1. 4. 4 乙酰丁香酮(Acetosyringone，AS)的影响 在
菌液中加入不同浓度的 AS(0、25、50、100 mg /L) ，比
较不同的浓度处理对抗性芽分化的影响。
2 结果
2. 1 紫茎泽兰的高效再生系统
将外植体接入诱导分化培养基 3 d 后，叶片开
始弯曲膨大，20 d左右大部分外植体不经过愈伤组
织阶段直接长出芽点，只有少量的愈伤出芽，外植体
平均出芽率达 95%以上。每个外植体上平均出芽
3 － 6个。再过 10 d后，将长有 3 － 4 对真叶、高度较
一致的丛生芽接到生根培养基上。观察发现，芽苗
在约 10 d左右时开始生根，表明本研究已通过诱导
幼叶直接再生途径建立了紫茎泽兰快速稳定的再生
系统。
2. 2 农杆菌诱导的紫茎泽兰遗传转化最适条件
确定
2. 2. 1 筛选压力 在含有 0，25 mg /L Km 的培养
基上培养 20 d后，观察到其丛生芽的分化情况无显
著差异;而在加有 Km 50 mg /L 以上的培养基上，外
植体变黄，不能分化出芽，故选择 50 mg /L Km 作为
筛选压。
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2010 年第 7 期 宋洪英等:农杆菌介导的紫茎泽兰遗传转化研究
2. 2. 2 浸染时间 对共培养 2 d 后的外植体进行
GUS检测发现，浸染时间为 3，6，9 min 时，染色效果
较浅，瞬时转化效率均低于 45%，而时间高于15 min
时，瞬时转化效率降到了 35%以下。只有当浸染时
间为 12 min 时，GUS 染色效果较好，瞬时转化效率
较高(72%) (图 1，图 2)。
图 1 不同浸染时间后的瞬时转化效率
CK．阴性对照;1 － 6．浸染时间分别为 3、6、9、12、15、20 min
图 2 外植体经农杆菌不同浸染时间后的 GUS检测
2. 2. 3 共培养时间 当共培养超过 4 d时，培养基
上的农杆菌易过度生长，造成外植体发黄甚至死亡，
影响转化效率。共培养 3 d 时，伤口周围的菌落生
长密度适中，且分化出不定芽的外植体数目较多，故
选择 3 d为最适的共培养时间。
2. 2. 4 乙酰丁香酮(AS)的影响 对比用不同浓
度 AS处理后的外植体出芽状况，发现 AS 的加入对
其芽分化的影响作用不明显。
2. 3 转基因紫茎泽兰的鉴定
从 100 个幼叶外植体中最终获得了 7 株 Km抗
性生根植株，对其进行 GUS 活性检测，体视显微镜
下观察，染色效果均显蓝色。用提取的总 DNA为模
板进行 PCR鉴定，扩增产物于 1%的琼脂糖凝胶中
90 V 恒压电泳，goldenview 染色后观察，显示 PCR
扩增出了 300 bp 大小的目的片段(图 3)。初步表
明目的基因已转到紫茎泽兰中，转化率达到 7%。
3 讨论
高效稳定的再生途径是实现植物遗传转化的重
要前提［12］。本研究在 Borthakur［13］、李慧等［3］对紫
茎泽兰再生途径研究的基础上，通过前期预试验中
比较不同外植体(茎段、叶柄、叶腋等)的再生情况，
最终确定了利用诱导幼叶在分化培养基上直接出芽
的方式，从而进一步缩短了再生周期，提高了出芽
率。并且，在前期的遗传转化预备试验中发现，在利
用诱导愈伤组织分化出芽的再生途径中外植体很容
易褐化，转化率极低。
M． DNA标准分子量;CK + ．质粒 PBI121PCR产物;CK － ．未转化植株
DNA的检测结果;1 － 7．抗性转化植株的 PCR产物
图 3 抗性转化植株的 PCR鉴定
遗传转化中，Km 筛选压力、菌液侵染浓度、浸
染时间是遗传转化的又一关键因素［14］，且紫茎泽兰
对农杆菌较敏感，易在外植体伤口处褐化，因此宜采
用较低的 OD值［15］。本研究发现，紫茎泽兰较适合
的条件是用 OD600值为 0. 4 的农杆菌菌液浸染不经
过预培养的外植体 12 min，产生的抗性绿苗转化率
最高。同时，共培养时间对抗性芽的分化率影响也
很大，时间过长，会引起农杆菌的过度生长，导致细
胞因受毒害死亡;时间过短，则不足以诱导有效的
T-DNA转移［16］。本试验研究表明，72 h为最佳的共
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培养时间。
本试验确定了紫茎泽兰遗传转化体系的最佳条
件，进而建立了一套农杆菌介导的高效的遗传转化
体系平台，为今后导入不同的外源基因，遗传控制或
遗传改良紫茎泽兰提供参考。
参 考 文 献
［1］高志勇，郭秦岭，孙强．紫茎泽兰研究概况．陕西师范大学学报，
2005，33:94-97．
［2］强胜．世界恶性杂草紫茎泽兰研究的历史及现状．武汉植物学研
究，1998，16(4) :366-372．
［3］李慧，强胜，崔瑾．利用丛生芽和愈伤组织微繁技术培养紫茎泽
兰的研究．西北植物学报，2005，25(7) :1458-1462．
［4］潘华清，何龙飞，覃芳．利用丛生芽微繁技术培养紫茎泽兰的研
究．广西农业科学，2007，38(6) :606-608．
［5］Murashige T，Skoog F． Revised medium for rapid growth and bioas-
says with tobacco tissue culture． Physiologia Plantarum，1962，15:
473-497．
［6］王关林，方宏筠．植物基因工程(第 2 版) ［M］． 北京:科学出版
社，2002:881．
［7］Yang MJ，Xie XM，He XQ，et al． Plant regeneration from phyllode
explants of Acacia crassicarpa via organogenesis． Plant Cell，Tissue
and Organ Culture，2006，85:241-245．
［8］Yang MJ，Xie XM，Zheng CX，et al． Agrobacterium tumefaciens-me-
diated genetic transformation of Acacia crassicarpa via organogenesis．
Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2008，95:141-147．
［9］刘建利，张占路，吴燕民，等．百脉根农杆菌快速高效遗传转化体
系的建立．草业科学，2006，15(3) :128-131．
［10］Jefferson RA． The GUS reporter gene system． Nature，1989，342
(6251) :837-838．
［11］陈德富，陈喜文．现代分子生物学实验原理与技术［M］．北京:
科学出版社，2006:100-101．
［12］Clarke JL，Spetz C，Haugslien S，et al． Agrobacterium tumefaciens-
mediated transformation of Euphorbia pulcherrima with virus-de-
rived hairpin RNA constructs confers resistance to Poinsettia mosaic
virus． Plant Cell Rep，2008，27(6) :1027-1038．
［13］Borthakur M，Dutta K，Nath SC，Singh RS． Micropropagation of
Eclipta alba and Eupatorium adenophorum using a single-step nodal
cutting technique． Plant cell，Tissue and Organ Culture，2000，62
(3) :239-242．
［14］Xie XM，Yang MJ，He XQ． Somatic embryogenesis and genetic en-
gineering of Acacia species． Transgenic Plant Journal，2007，1:
244-249．
［15］张录霞，牛建新，马兵钢． 根癌农杆菌介导转化番茄的影响因
素．生物技术通报，2008(1) :10-13．
［16］孔娜，朱锦辉，陈耀锋，等．秦烟遗传转化体系的优化．西北农林
科技大学学报，2008，36(9) :
櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧
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