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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 4 期
坛紫菜 hsp70 基因真核表达载体的构建与转化
仪茜茜1，2 杨锐1，2 刘伟1，2 孙雪1，2 赖晓娟3
(1宁波大学 应用海洋生物技术教育部重点实验室，宁波 315211;2宁波大学 海洋生物工程浙江省重点实验室，宁波 315211;
3宁波大学生命科学与生物工程学院，宁波 315211)
摘 要: 坛紫菜是极具经济效益的大型海藻，生活在环境多变的潮间带，易受到温度、渗透压和辐射等因素剧烈变化的
影响，经常处于逆境胁迫中。热休克蛋白 70(HSP70)是生物体内一种重要且高度保守的应激因子，作为分子伴侣在胁迫条件
下首先被诱导出来，在逆境胁迫调节中起着重要的作用。构建紫菜 hsp70 基因真核表达体系对于了解该基因在紫菜抗逆过程
中的作用有重要意义。利用 PCR技术扩增得到大小为 1． 89 kb的坛紫菜 hsp70 基因，将其克隆至 pMD18-T载体上测序。从测
序正确的菌株中提取质粒，经限制性内切酶 SmaⅠ和 NotⅠ进行消化，将目的基因与真核表达质粒 p181AINE 连接，获得重组
真核表达质粒 p181-hsp70。通过菌落 PCR、双酶切及测序等方法进行鉴定，结果表明重组真核表达质粒 p181-hsp70 构建成功。
制备酵母感受态，将重组质粒电激转入酿酒酵母中，酵母菌落 PCR结果显示电激转入成功。
关键词: 坛紫菜 hsp70 基因 真核表达载体 重组质粒构建
Construction and Transformation of Eukaryotic Express
Vector of hsp70 Gene from Porphyra haitanensis
Yi Qianqian1，2 Yang Rui1，2 Liu Wei1，2 Sun Xue1，2 Lai Xiaojuan3
(1Key Laboratory of Applied Marine Biotechnology of Ministry of Education，Ningbo University，Ningbo 315211;
2Key Laboratory of Marine Biotechnology of Zhejiang，Ningbo University，Ningbo 315211;
3College of Life Science and Bioengineering，Ningbo University，Ningbo 315211)
Abstract: Porphyra haitanensis，the seaweed with the great economic benefits，grows in the mutable intertidal environment，and is
susceptible to the fierce changes of the temperature，osmotic pressure，irradiation and other stressors，so it often exposes itself to the ad-
versity stresses． Heat Shock Protein 70(HSP70)as a highly conserved stress factor in the living organisms plays an important role in reg-
ulating the biological adaptation to the stress． It is helpful to learn the function of hsp70 in the stress resistance procession of Porphyra
by constructing the eukaryotic express system of this gene． We cloned the gene of hsp70 from Porphyra haitanensis by PCR． The 1． 89 kb
long gene was inserted in the plasmid vector pMD18-T for nucleic acids sequencing． Then the plasmid was extracted，purified，and di-
gested with the restriction enzymes SmaⅠand NotⅠ． Finally，the target gene fragments and the plasmid p181AINE were digested by the
same two enzymes and were linked together by the T4DNA ligase． The recombinant eukaryotic expression plasmid p181-hsp70 was ob-
tained． The identification results of the individual bacterial colonies PCR，double enzymes digestion and sequencing showed that the re-
combinant expressing plasmid p181-hsp70 was constructed successfully． The recombinant plasmid was transformed into the yeast compe-
tent cells by electro-transformation，and the yeast single colonies PCR indicted that the recombinant expressing plasmid p181-hsp70 was
successfully transferred．
Key words: Porphyra haitanensis hsp70 gene Eukaryotic expression vector Construction of recombinant plasmid
收稿日期:2010-10-19
基金项目:国家自然科学基金项目(40776077) ，宁波市自然科学基金项目(2009A610145)
作者简介:仪茜茜，女，硕士研究生，研究方向:藻类遗传育种;E-mail:sbtyqq_8541@ 163． com
通讯作者:杨锐，女，博士，副研究员，研究方向:藻类遗传与生物技术;E-mail:yangrui@ nbu． edu． cn
紫菜(Porphyra) ，属于红藻门(Rhodophyta)、原 红藻纲(Protoflorideophy)、红毛菜目(Bangiales)、红
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 4 期
毛菜科(Bangiaceae) ，是我国重要的海藻栽培对象
之一［1］。紫菜广泛分布在我国沿海的潮间带，多变
的生存环境使其对逆境胁迫有着特殊的适应性，尤
其是对温度、渗透压和高辐射等逆境具有快速和高
效的调节机制。深入研究紫菜抗逆相关基因及其功
能对于了解生物抗逆机理具有重要帮助。近年来，
由于全球气候变化、海区环境恶化以及培育和管养
模式不当等原因，紫菜高温病烂等问题高发，系统研
究藻类抗逆、抗病机理将为栽培生产提供科学指导。
热休克蛋白(heat shock proteins，HSPs)是一组
广泛存在于微生物和动、植物体内高度保守的蛋白
家族。在该家族中，HSP70s是最保守、重要的一族，
从古细菌、植物到人类体内都广泛存在，含量较多，
在应激反应中也最为敏感，是目前 HSPs 中研究最
深入的一族［2］。HSP70 可辅助新合成蛋白的正确
装配和折叠，对错误折叠或聚集的蛋白进行重新折
叠，帮助分泌蛋白跨膜定位到细胞器，控制调节蛋白
的活性;其在热胁迫条件下充分发挥着分子伴侣的
作用，阻止蛋白聚集，促进聚集蛋白溶解再折叠
过程［3 － 5］。
在高等动植物中，有关 hsp70 的结构、分子机制
和调控功能等方面已研究的比较清楚，而藻类
hsp70 基因的研究则相对欠缺。近年来，随着对高
等动植物中 HSP70 研究的深入，多种藻类的 hsp70
基因序列逐步被克隆出来;相关的研究表明，通过热
激胁迫或金属胁迫的方法，藻类内源 hsp70 基因随
温度的变化而瞬时表达。Reith 等［6］在紫菜(Por-
phyra umbilicalis)中克隆出质体基因编码的 hsp70
后，采用 RNA 印迹杂交的方法检测到热激条件下
hsp70 基因的表达量是对照组的 7 倍。利用 Real-
time PCR技术，Fu 等［7］在海带(Laminaria japonica)
中的研究表明，海带 hsp70 在 30℃时表达量最高，在
25℃处理 7 h 达到最大水平后而逐步下降。何文
君［8］在条斑紫菜丝状体 hsp70 的研究表明温度升高
表达量增加;并构建了原核和真核表达系统，以酵母
和大肠杆菌在高温下的生长状况说明 hsp70 基因的
表达可提高表达受体的耐高温能力。
藻类 hsp70 的异源表达研究相对缺乏，本研究
参照高等动植物基因功能研究的相关方法，拟构建
坛紫菜 hsp70 基因的真核表达载体，进行坛紫菜
hsp70 缺陷表达与过量表达的对比研究，为进一步
验证坛紫菜 hsp70 的功能提供技术基础。
1 材料与方法
1. 1 质粒与菌株
坛紫菜丝状体藻种(me-05)由宁波大学海洋生
物工程大型藻种储藏室保存。大肠杆菌 DH5α感受
态系本实验室 － 70℃保存;p181AINE 质粒、酵母菌
株 BY4741 为中国科学院遗传与发育生物学研究所
王义琴博士惠赠;酵母菌株 YBL075c(BY4741;Mat
a;his3Δ1;leu2Δ0;met15Δ0;ura3Δ0;YBL075c::kan-
MX4)购自 Euroscarf(http:/ /web． uni-frankfurt． de /
fb15 /mikro /euroscarf / index． html) ;pMD18-T 克隆载
体购自 TaKaRa生物工程公司。
1. 2 试剂与设备
PrimeSTARTM HS DNA Polymerase、T4 DNA Lig-
ase、限制性内切酶 SmaⅠ和 NotⅠ、DL2000TM DNA
Marker均购自 TaKaRa 生物工程公司;质粒提取试
剂盒、胶回收试剂盒和氨基酸等均购自捷瑞生物工
程公司;Yeast Extract(Oxide)、Typtone(Oxide)、YNB
(Difico)购自杭州昊天。超微量紫外核酸定量仪、
台式冷冻离心机均为 Thermo 公司产品;金属浴与
PCR 仪为 Eppendorf 生产;电转化仪(Gene Pulser
Xcell)为 Bio-Rad公司生产。引物合成及测序由 In-
vitrogen(上海)贸易有限公司完成。
1． 3 引物设计
根据坛紫菜 hsp70 编码区序列(DQ480726． 1) ，
利用软件 Primer Premier 5 设计引物。上游引物 U1:
5-GCCCGGGATGGGTAAAGTTGTTGGAA-3，下游引物
D1:5-TTGCGGCCGCTTATTTAGCTTCAGAGAAATCTG-
3，为便于将 PCR产物进行测序并构建表达载体，在
引物上分别引入 SmaⅠ和 NotⅠ两个酶切位点(下
划线部分) ，送至上海 Invitrogen贸易有限公司合成。
1． 4 坛紫菜 hsp70 基因的克隆及测序
采用优化的 CATB裂解法［9］提取坛紫菜丝状体
(me-05)基因组 DNA。取 2 μL基因组 DNA溶液用
超微量紫外分光光度计测定其纯度及其浓度，并用
1%琼脂糖凝胶上电泳鉴定。以此为模板，进行 PCR
扩增。反应体系:模板 1 μL，10 × PCR buffer(不含
Mg2 +)2． 5 μL，MgCl2(25 mmol /L)1． 5 μL，dNTP
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2011 年第 4 期 仪茜茜等:坛紫菜 hsp70 基因真核表达载体的构建与转化
(10 mmol /L)0． 5 μL，U1(10 pmol /L)0． 5 μL，D1(10
pmol /L)0． 5 μL，补水至总反应体系 25 μL。扩增程
序:94℃预变性 3 min;94℃变性 45 s，63℃退火 45
s，72℃延伸 2 min，共 35 个循环;72℃延伸10 min。
反应完成后，取 5 μL PCR产物在 1%琼脂糖凝胶电
泳进行检测。用胶回收试剂盒纯化回收目的片段，
并连接到 pMD18-T 载体上，转入 DH5α 感受态中，
涂布在含氨苄抗生素的 LB 平板上，37℃培养过夜，
随机挑选单克隆，通用引物检测正确的菌株送至公
司测序，测序正确的菌株标记为 pMDH11。
1． 5 重组质粒的构建与转化
提取质粒 pMDH11 和 p181AINE，分别进行
SmaⅠ /NotⅠ双酶切，回收目的片段后，以 T4连接
酶 16℃连接过夜，连接产物转化入 DH5α 感受态，
挑取单菌落，经 PCR 扩增检测正确的菌株抽提质
粒，用限制性内切酶 SmaⅠ和 NotⅠ双酶切鉴定，
鉴定正确的菌株命名为 p181-hsp70，送至上海 In-
vitrogen贸易有限公司测序。将测序正确的菌株扩
大培养，提取质粒，参照 David C． Amberg 酵母电转
化法(http:/ /www． protocol-online． org /cgi-bin /prot /
view_cache． cgi?ID = 1923) ，将重组质粒与空质粒
分别转入 BY4741 和 YBL075c 中，将转化后的酵
母菌涂布在 SC-leu 选择培养基上，30℃培养 2 － 3
d 后，挑取单克隆进行酵母菌落 PCR 进行检测，其
程序为:94℃预变性 10 min;94℃变性 50 s，55℃退
火 50 s，72℃延伸 1 min，共 35 个循环;72℃延伸
10 min。
2 结果
2． 1 坛紫菜 hsp70 基因的克隆和测序
根据优化的 CTAB裂解法提取了坛紫菜基因组
DNA(图 1-A) ，经电泳检测及紫外分光光度计检测，
DNA提取质量良好，可以用于基因操作的下游试
验。以所得 DNA 为模板，按照引物 D1、U1，扩增出
一个约 1． 89 kb 特异性条带(图 1-B) ，与理论预期
值大小一致，即目的条带。
将 PCR 产物经胶回收，克隆到 pMD18-T 载体
上，送至公司测序。根据测序结果，经在线 Blastn 比
对，得序列与 NCBI上的序列完全一致，即所得 PCR
产物序列为 hsp70 基因的编码区序列。
M． Marker DL2000;1．基因组 DNA;2． hsp70基因 PCR扩增结果
图 1 坛紫菜 DNA提取(A)及 hsp70 扩增(B)
2. 2 坛紫菜重组表达载体 p181-hsp70 的构建
提取质粒 pMDH11 和 p181AINE，并将其分别用
SmaⅠ和 NotⅠ双酶切，p181AINE 得到6． 4 kb左右
片段(图 2-A) ，pMDH11 得到大小约1． 89 kb的目的
基因和 2． 6 kb的质粒片段(图 2-B) ，两种质粒已完
全酶切开。将约 1． 89 kb 的目的基因与 p181AINE
酶切后的片段分别回收，T4连接酶连接过夜，构建重
组表达载体 p181-hsp70，将连接产物转化至大肠杆
菌感受态中，涂平板过夜。
M． DL2000 DNA Marker;1． p181AINE经 Sma Ⅰ和 Not Ⅰ双酶切;
2． p181AINE;3． pMDH11 经 Sma Ⅰ和 Not Ⅰ双酶切;4． pMDH11
图 2 p181AINE(A)和 pMDH11(B)双酶切电泳
2． 3 重组表达质粒 p181-hsp70 的鉴定
挑取阳性克隆，溶于 15 μL 灭菌纯水中，取
1 μL进行 PCR 检测，电泳结果(图 3)显示，PCR
扩增出的片段约为 1． 89 kb，与预期的结果相同，
说明该克隆中含有已转化的目的基因。从经 PCR
检测含目的基因的克隆中提取质粒，进行 SmaⅠ和
NotⅠ双酶切鉴定。重组表达载体 p181-hsp70 酶
切后的质粒片段与 p181AINE 酶切后的片段大小
相等，得到的 hsp70 在约 1． 89 kb，符合预期结果
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 4 期
(图 4)。将酶切鉴定正确的重组表达载体 p181-
hsp70 阳性克隆，送至公司测序。测序结果显示，
插入的目的基因序列与坛紫菜 hsp70 编码区序列
完全一致，说明已成功构建了真核表达载体
p181-hsp70。
M． DL2000 DNA Marker;1．对照;2 － 4．
重组质粒 PCR扩增
图 3 重组质粒 p181-hsp70 的 PCR鉴定
M． DL2000 DNA Marker;1． p181AINE SmaⅠ/NotⅠ双
酶切;2． p181-hsp70 digested SmaⅠ/NotⅠ双酶切;3．重
组质粒 p181-hsp70
图 4 重组质粒 p181-hsp70 双酶切鉴定
2． 4 酵母菌的电转化及检测
在 SC-leu选择培养基上，培养 2 d后，挑取单克
隆进行菌落 PCR，电泳结果(图 5)显示，在含有重组
质粒的酵母菌中检测到目的基因片段，表明真核表
达载体已成功转化到酵母中。
0 － 4． BY4741 + p181-hsp70 空质粒转入酿酒酵母中;5 －
9． YBL075c + p181-hsp70 重组质粒转入;10 － 12． BY4741 +
p181AINE;13 － 15． YBL075c + p181AINE
图 5 酵母菌落 PCR
3 讨论
本试验所用载体 p181AINE 来源于穿梭质粒
112AINE［10］，并用 leu2 筛选标记基因替换了 trp1 筛
选标记基因［11］，具有氨苄青霉素抗性、ADH 启动子
和终止子［12］以及亮氨酸筛选标记，可在大肠杆菌复
制，也可使外源基因在酿酒酵母中稳定表达，多用于
功能互补法分离和鉴定真核生物基因的研究。目
前，Kunling 等［12］已利用该质粒在酿酒酵母中成功
进行了拟南芥 AtENT3 基因功能的研究;Zhao 等［13］
也利用该质粒成功表达了水稻金属硫蛋白 OsMT1a，
并发现 OsMT1a在水稻耐干旱及锌离子平衡中起着
关键性的作用。
在坛紫菜 hsp70 基因序列中不具有内含子，因
此本试验直接以坛紫菜基因组 DNA为模板，扩增出
hsp70 基因编码区全序列，构建重组表达载体。与
通过逆转录聚合酶链反应法(RT-PCR)获得目的基
因相比，操作较为方便。坛紫菜 hsp70 基因业已成
功转入酿酒酵母中，有关该基因的表达状况及功能
研究将逐步展开。
与高等陆生植物不同，藻类生长在环境特殊的海
洋中，在进化中具有重要的地位，尤其是处于进化盲
端的红藻，其特殊的抗逆机制将有助于深入了解生物
抗逆机理和进化规律。前期研究表明，紫菜作为潮间
带重要的大型经济藻类，其 hsp70 基因在抗逆响应机
制中发挥重要作用。成功构建坛紫菜 hsp70 基因真
核表达载体，利用真核生物体外表达技术会帮助人们
更便捷地进行关键基因的功能验证，并为在此基础上
进行基因操作和遗传育种奠定基础。
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(责任编辑 李楠
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