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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011年第 5期
农杆菌介导法向玉米萌发种子转化 bar基因的研究
张明义 1, 2 张彦芹1 杨丽莉 1 梁改梅 1 董春林 1 孙洁 1 李洁 1 谢宝妹3
( 1山西省农业科学院旱地农业研究中心,太原 030006; 2山西省农业科学院小麦研究所,临汾 041000;
3山西省农业科学院农业科技情报研究所,太原 030031)
摘 要: 以玉米 (Z ea may s L1 )自交系-昌 7-2. 的种子作为受体,质粒 pCAMBAR1 CH I1 11为供体,采用农杆菌介导植物
萌发种子基因转化方法将 bar基因导入受体材料。PCR和 Southern b lo tting杂交分析结果证明转化成功,转化率在 6% 左右。
转化材料以 012% Basta溶液喷雾后可正常生长发育。结果证明, 农杆菌介导植物萌发种子转化, 是适于玉米基因遗传转化的
有效方法。
关键词: 玉米 种子划胚 bar基因 转化
Study onAgrobacterium tumefaciensMediated
Transformation of bar Gene into PlantGerm ination Seed
ZhangM ingy i
1, 2 Zhang Yanq in1 Yang L ili1 L iang Gami ei1 Dong Chunlin1 Sun Jie1 L i Jie1 X ieBaom ei3
(
1
A rid Farming R esearch C enter, Shanxi A cademy of Agricultural Sciences, Taiyuan 030006;
2
WheatR esearch Institute of Agr icultural Sciences, L infen 041000;
3
Information Institute Shanx iA cademy of Agr icultural Sciences, Taiyuan 030031)
Abstrac:t U sed the seeds o fm a ize(Z ea may L1 ) inbred -Chang7-2. as receptor, p lasm id pCAMBAR1 CH I 11 as donor, bar gene
w as in troduced in to receptor by the m ethod for transferr ingAgrobacerium-m ediated plant g erm ination seed gene. The results o f PCR de-
tection and Southern b lo tting hybridization ana lys is suggested that successfu l transfo rm ation w as got, the transform ation frequencyw as a-
bout to 6% . O therw ise, transgenic plants still could no rm ally grow and deve lopm ent, even though the transgen ic plants had been sprayed
used 01 2% Basta so lution. In conclusion, the m ethod fo r transferr ing Agrobacterium-m ediated plant germ ination seed gene was a fast,
simp le and convenient too l used to transform ed m aize.
Key words: M aize Seed scuffing bar gene T ransfo rm ation
收稿日期: 2010-10-31
基金项目:转基因生物新品种培育重大专项重点课题 ( 2009ZX08003-005B )
作者简介:张明义,男,硕士,研究员,研究方向:抗旱育种和分子生物学; E-m ai:l zm y_1958@ 1631 com
自 1983年世界首例转基因烟草植株 [ 1]诞生以
来,植物转基因研究日趋完善。第一例开展转基因玉
米研究的是 1986年 Fromm等 [ 2]将抗除草剂 pat基因转
入玉米原生质体中, 1989年, Shilito[ 3]转化从 CAT100
和 B73胚性愈伤组织分离出的原生质体,经分化培养
获得了可育的转基因植株。从首例转基因玉米报道到
现在的 20多年时间里,玉米转化的受体、转化方法和
标记基因的选择等研究都得到了迅速发展。
最初研究认为玉米是不易转化的植物 [ 4] , 仅探
索玉米的转化方法就花费了 10多年时间。目前,玉
米转化方法包括:基因枪法 [ 5]、农杆菌介导法 [ 6]、电
击法 [ 7]和 PEP介导法 [ 8]等, 利用这些方法均获得了
转化植株。近几年,由山西省农业生物技术研究中
心发明已获国家专利的 /农杆菌介导植物萌发种子
基因转化方法 0 [ 9] ,在玉米转化上得到应用,其主要
步骤包括:待转化种子吸水膨胀,种子胚微创伤, 加
入适量携带待转化质粒农杆菌菌液, 振荡培养至种
子露白,露白种子移栽到温室或大田,依据标记基因
筛选和分子检测。该方法的优点是避免其他方法所
需较长时间的组培过程,不受玉米的基因型限制;普
通实验室即可进行操作完成。缺点是转化前对胚的
微创伤操作较费时费力;转化率仍有待进一步提高。
2011年第 5期 张明义等: 农杆菌介导法向玉米萌发种子转化 bar基因的研究
本研究采用农杆菌介导植物萌发种子基因转化
方法将 bar基因导入玉米自交系材料 -昌 7-2. ,旨在
获得转基因植株。
1 材料和方法
111 材料
11111 植物材料 试验受体材料为玉米自交系
-昌 7-2. ,由本中心保存备用。
11112 质粒 bar基因的质粒载体为 pCAMBAR1
CH I1 11, 农杆菌菌株为 LBA4404。质粒上 bar基因
对除草剂 Basta的有效成分 Phosphinothricin( PPT )
具有抗性, bar基因启动子为 CaMV35S, 终止子为
CaMV35SPo ly(A )。质粒图谱,见图 1。
图 1 质粒 pCAMBAR1 CH I1 11物理图谱
112 方法
11211 菌液培养和浓度测定 用 YEB液体培养基
进行菌液培养,菌液体积可根据试验需要逐级放大
培养。菌液浓度测定方法: 梯度稀释并测定菌液
OD 600值, 按要求将菌液稀释到所需浓度 ( OD600值分
别为 0101、0103、0105、0107和 0109 )备用 (临时置
4e 保存 )。
11212 转化方法
1121211 种子吸水膨胀和划胚 为使质粒 DNA能
够进入受体细胞,必须对受体胚进行微创伤,创伤部
位是种子胚芽处。具体方法是将吸水膨胀种子放在
干净的磁盘内,用解剖刀进行无菌操作,在种子胚生
长点处轻划一下,使胚致伤但又尽可能不影响种子
萌发成苗。划胚方式分 3种,包括胚根端朝向操作
者,在胚芽处由上向下划为竖划、左右划为横划及垂
直于台面向胚芽处刺为穿刺。
1121212 种子与农杆菌共培养 将 300粒划伤和
未划伤处理的种子分别装入加有 135 mL双蒸水的
广口瓶中,加入适量菌液, 为探索乙酰丁香酮 ( AS)
对转化率的影响,在菌液中附加 200 Lmol/L的 AS,
以不加 AS为 CK。然后于摇床上 90 r /m in振荡培
养 48 h左右,至种子露白。
1121213 除草剂预筛选 在共培养 24 h后, 将各
种处理分成两份, 一份中加入 012% Basta溶液,另
一份不加,继续共培养至种子露白,以探讨除草剂预
筛选或后筛选对转化率的影响。
1121214 播种和移栽 露白种子播种于事先备好
的砖垒小格里, 以蛭石作为苗床。出苗后长至 3叶
期, 移栽到大田,记录播种种子数、出苗数、移栽苗数
及移栽后成活苗数。
1121215 除草剂二次筛选 无论除草剂预筛选与
否的移栽苗在 4- 5叶期喷雾 012% Basta溶液进行
二次除草剂筛选。 10 d后调查成活苗数,成活苗可
以初步认定为 PPT 抗性苗。6 - 7叶期取样提取
DNA进行分子检测。成活植株挂牌标记, 并套袋自
交收获种子。
1121216 试验总体设计 挑选籽粒饱满的种子约
13 000粒,其中 1 000粒做不划胚处理 (包括阴性对
照材料 ), 其余 12 000粒做划胚处理。划胚与不划
胚种子同时吸水膨胀 24 h, 将划胚种子再分成 3份,
分别进行不同方式的划胚处理。划胚与不划胚种子
皆与菌液共培养 48 h(至种子露白 )。菌液浓度分
OD600值为 0101、0103、0105、0107和 0109的 5个处
理, 每个菌液处理又分菌液中加和不加 AS两个子
处理。各子处理再分为用除草剂预筛选和后筛选两
种处理。所有处理均设 3次重复。
11213 PCR检测 喷雾 Basta除草剂后能够正常
生长的植株, 在 6- 7叶期取样。DNA提取采用改
良 SDS碱裂解法 [ 10]。根据 bar基因序列设计引物
(其扩增片段为 438 bp), 引物由上海生工合成。上
游: 5c-ACCATCGTCAACCACTACAT-3c; 下 游: 5c-
AGTCCAGCTGCCAGAAACCC-3c。PCR扩增体系为
25 LL, 扩增程序为 94e 45 s, 58e 45 s, 72e 1 m in
45 s, 30次循环。
11214 Southern blotting杂交分析 取 20 Lg经纯
化的转基因植株和阴性对照植株的 DNA, 用限制性
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内切酶 EcoRÑ酶解, 作为阳性对照的质粒 DNA用
限制性内切酶 BamHÑ和 E coRÑ酶解,酶切产物用
017%琼脂糖凝胶电泳分离 DNA片段, 然后用虹吸
法转移到尼龙膜上。用 PCR法和地高辛标记试剂
盒标记质粒中的 bar基因片段作为探针, CSPD染
色, X -胶片显影。
2 结果与分析
211 种子胚划伤对出苗率的影响
未划胚和划胚对种子出苗率影响的调查和统计
结果见表 1。
由表 1可以看出, 划胚种子的出苗率为
7317%, 正常种子的出苗率为 9812%。假定两种处
理的种子出苗率比例为 1B1,经统计分析,样本 X 2 =
31491 8, V20105 = 31841,差异不显著, 即划胚对种子
出苗率的影响达不到显著水平。另外还发现, 胚穿
刺处理的种子比竖直和水平划胚的种子的出苗率要
高,证明胚的创伤是有一定限度的,应尽量做到既微
创伤胚,又不太影响处理胚种子的出苗率。
表 1 胚划伤对种子出苗率的影响
处理 重复 种子数 (粒 ) 出苗数 (株 ) 出苗率 (% )
未划胚
1 600 586 9717
2 600 592 9817
3 600 590 9813
小计 1 800 1 768 9812
划胚
1 4 000 2 894 7214
2 4 000 3 125 7811
3 4 000 2 826 7017
小计 12 000 8 845 7317
212 转化植株的获得
21211 除草剂喷雾筛选 移栽苗生长至 4- 5叶
期,喷雾 012%的 Basta溶液, 喷雾后大部分苗叶片
变黄, 最后死亡。成活苗为除草剂抗性植株。处理
后的调查结果为阴性对照苗全部死亡; 未划胚但经
过与菌液共培养转化的移栽苗也全部死亡; 划胚且
转化的移栽苗 8 845株存活 1 294株。证明未划胚
种子是不能转化的, 划胚种子转化后的 PPT抗性苗
占划胚种子数的 1018%, 占划胚种子出苗数的
1416%。划胚对种子出苗数的影响以及喷雾除草剂
大田移栽苗的反应,见图 2和图 3。
左.划胚种子出苗;右.未划胚种子出苗
图 2 划胚对种子出苗的影响
图 3 移栽苗喷雾除草剂
21212 PCR检测 移栽苗取样与 PCR检测结果见
表 2。为了提高试验结果的准确性,试验设 3个处
理: ¹ 阴性对照; º 未划胚但经过转化; » 划胚且转
化。 ¹、º 处理的取样数为未经除草剂喷雾处理的
苗数, »处理为除草剂喷雾后存活的苗数。
表 2 移栽苗 PCR检测结果
处理 取样数 (株 )
PCR检测结果 (株 )
阴性结果数 阳性结果数
阳性结果率
(% )
CK 132 132 0 0
未划胚 600 600 0 0
划胚 1 294 279 921 7112
从表 2可以看到,阴性对照和未划胚苗中没有
检测到目的基因存在。证明吸水膨胀种子未经胚微
创伤处理,虽然与菌液共培养,但无法得到转化。这
在此类苗喷雾除草剂后全部死亡时已得到证实。划
胚处理种子的萌发苗,经过除草剂喷雾筛选后, 其
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PCR扩增检测的阳性植株占 7112%。若以划胚
处理的种子为 基数, PCR 阳性 植株占 717%
( 921 /12 000)。阴性对照的 PCR检测结果全为
阴性, 证明 PCR扩增检测试验的方案和操作是正
确的。
图 4是部分样品的 PCR扩增产物经 1%凝胶电
泳分离后的结果。可直观看到,阴性对照材料未扩
增出特异条带,大部分材料扩增出与阳性对照大小
一致的特异条带。
21213 Southern blott ing杂交分析 从 921株 PCR
检测呈阳性结果的材料中选取 50株的 DNA进行
Southern b lo tting杂交分析, 检测到有特异杂交条带
的植株 3株, 转化率达到 6%。由于 12 000划胚种
子的转化试验中,包含划胚方式、加入乙酰丁香酮
与否、菌液浓度处理和除草剂预筛选与否等试验
处理,并非 12 000粒划胚种子都处于最佳的转化
状态和环境中, 所以实际的转化率可能还会更高
一些。
图 5为部分 PCR检测阳性结果材料的 South-
ern blotting杂交分析的结果。一些泳道只有一条
杂交带,另一些泳道有多条杂交带,证明目的基因
是以单拷贝多位点的形式整合到转基因植株的染
色体上。
经 PCR和 Southern b lotting检测分析,表明目的
基因已导入转基因植株, 且整合到转基因植株的染
色体上。
M.分子量标记; P.质粒; 1.阴性对照; 2- 9.部分转基因植株
图 4 部分转基因植株的 PCR检测结果
CK.阴性对照; P.质粒; 1- 3.转基因材料
图 5 部分 T3代植株的 Sou thern blotting杂交分析结果
213 影响转化率的因素
21311 划胚方式对转化率的影响 划伤胚方式分横、
竖和穿刺 3种,涉及种子 2 700粒,每种方式重复 3次,
每个重复 300粒种子。这些种子的移栽苗数、除草剂
喷雾后成活苗数 (取样数 )、以及分子检测结果,见表 3。
由表 3看出, 3种划伤胚方式的对萌发种子转
化率都在 5%左右, 处理间不存在显著差异。结合
表 1, 3种方式对种子萌发率的影响, 以穿刺法对种
子萌发率影响较小。故划胚处理应采用穿刺方式。
表 3 划胚方式对转化率影响的统计结果
划胚方式 重复 种子数 (粒 ) 成活苗数 (株 ) 得到的转化苗数 (株 ) 转化率 (% )
竖划
1 300 27 16 513
2 300 31 14 417
3 300 28 18 610
横划
1 300 27 15 510
2 300 29 17 517
3 300 28 14 417
穿刺
1 300 29 16 513
2 300 30 13 413
3 300 27 17 517
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21312 菌液浓度对转化率影响 合理的菌液浓度是
转化成功与否的关键因素之一。本研究设置 5个菌
液浓度,其对种子转化率影响,见表 4。从中看出, 不
同菌液浓度对种子转化率影响差异显著。OD600值为
0101和 0103时, 转化率为 017% - 213%; 而当 OD600
值为 0105- 0107时,转化率较高,为 7% - 817%。当
OD600值达 0109时,种子的转化率为 0。其原因可能
是菌液起始浓度过高,共培养 24 h后,共培养液已很
浑浊,氧气不足,不利于种子和菌株生活。
21313 乙酰丁香酮对转化率的影响 乙酰丁香酮
( AS)对萌动种子划胚处理后的转化率的影响调查
结果,见表 5。
表 4 菌液浓度对转化率影响的统计结果
菌液浓度 (OD 600 ) 重复 种子数 (粒 ) 转化植株数 (株 ) 转化率 (% )
0101
1 300 4 113
2 300 3 110
3 300 2 017
0103
1 300 7 213
2 300 9 210
3 300 6 210
0105
1 300 24 810
2 300 26 817
3 300 23 717
0107
1 300 22 713
2 300 23 717
3 300 21 710
0109
1 300 0 0
2 300 0 0
3 300 0 0
表 5 乙酰丁香酮对转化率影响的统计结果
乙酰丁香酮浓度 (Lm ol /L) 重复 种子数 (粒 ) 转化植株数 (株 ) 转化率 (% )
0
1 300 7 213
2 300 5 117
3 300 8 217
100
1 300 11 317
2 300 9 310
3 300 10 313
200
1 300 26 817
2 300 24 810
3 300 25 813
400
1 300 5 117
2 300 3 110
3 300 6 210
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2011年第 5期 张明义等: 农杆菌介导法向玉米萌发种子转化 bar基因的研究
在共培养液中不加 AS, 种子的转化率在 117% -
217%之间,而当 AS浓度为 200 Lmo l/L时,转化率
则提高到约 9%左右, 就数字而言, 转化率提高了 2
倍。即在共培养液中加入适量 AS可以提高种子转
化率, 这与项艳等 [ 11]的研究结论相似。AS浓度过
高由于其对种子毒性的增加,转化率反而下降。
21314 除草剂预筛选和后筛选对转化率影响 除草
剂预处理 (共培养 24 h后,在菌液中直接加入除草剂
溶液 ( 012% )和后处理 (移栽后用 012%除草剂喷雾
处理 )对划胚苗转化率的影响调查结果,见表 6。
表 6 除草剂预筛选和后筛选对转化率影响的统计结果
处理 重复 种子数 (粒 ) 转化植株数 (株 ) 转化率 (% )
预处理
1 300 14 417
2 300 15 510
3 300 13 413
后处理
1 300 17 517
2 300 15 510
3 300 17 517
根据表 6中结果, 除草剂预处理和后处理对划
胚种子转化率的影响有一定差异, 但达不到显著水
平。这样,除草剂预处理有利于试验操作,不仅节省
除草剂使用量,降低大田喷雾除草剂对环境的污染,
而且可简化试验操作。
3 讨论
有关玉米转基因方法的研究已有许多报
道 [ 12- 14 ]。转基因玉米中,抗除草剂转基因玉米的播
种面积最大 [ 15]。Bar基因来源于吸水链霉菌 ( S trep-
tomyces hygroscop ieus) ,对除草剂 PPT( phosph inothr-i
cin)具有抗性 [ 16, 17] , 目前已成功转化的作物有小
麦 [ 18]、烟草 [ 19]、水稻 [ 20]、油菜 [ 21] 和玉米 [ 22]等。本
研究用农杆菌介导植物萌发种子基因转化方法将
Bar基因成功转化到玉米自交系-昌 7-2. ,获得了转
基因植株。
对于禾本科作物的玉米来说,该转化方法操作简
单,转化率可达 6%左右。不同划胚方式对转化率影
响不大,但对种子出苗率有较大影响,因此, 划胚操作
以穿刺法最佳。共培养液中菌体浓度以 OD600 =
01045- 0107为最适,浓度太抵或过高都不利于转化。
浓度过低达不到转化所需菌体群体效应的效果,转化
率会很低;浓度过高,一是共培养后农杆菌不能被有
效抑制,而造成共培养的种子大量受损;二是筛选培
养基中加入抑制农杆菌抗生素的量要加大, 不仅增加
了试验成本,且控菌效果也不太好。
共培养液中加入适量乙酰丁香酮能提高转化效
率。本研究中,共培养液中加入 400 ng /mL乙酰丁香
酮,可使转化率提高 50%左右。同时还发现,在共培
养液中加入 012% Basta或在共培养苗移栽后用
012% Basta溶液喷雾进行除草剂抗性筛选,对转化率
影响不大。需要注意的是,筛选用除草剂的浓度须经
预备试验来确定,即以不同浓度梯度的除草剂溶液对
未转化植株喷雾,使植株能刚好致死作为临界浓度,
即筛选用除草剂的最适浓度。
农杆菌介导植物萌发种子基因转化方法虽有很
多优点,但也存在一些问题, 如划胚分寸的掌握、如
何进一步提高转化效率等。
参 考 文 献
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(责任编辑 马鑫 )
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