全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2009年第 4期
动胶菌发酵产物 PHAs提取方法的研究
何竹青 黄建新
(西北大学生命科学学院,西安 710069 )
摘 要: 以动胶菌为生产菌株, 对后期提取方法进行筛选,从而确定了提取聚羟基烷酸酯 ( PHA s)的最佳方案即季铵盐
浓度为 1% ,作用时间为 15 m in,细胞浓度为 350 g /L, 次氯酸钠浓度为 3% ,作用时间为 5 m in。以该方案为基础的放大实验,
得到产物纯度 983% ; 经力学性质测试拉伸强度为 26 265M Pa; 杨氏模量 1287535MPa;经热分析测试熔点为 173 , 熔解焓
4318 Jg1。
关键词: 聚羟基烷酸酯 ( PHA s) 提取方法 产物收率 力学测试
Study of theM ethod of Extracting PHAs from
Zoologea spBatch Fermentation
H e Zhuqing Huang J inx in
(College of Life Sciences, N orthwest University, X ian 710069)
Abstrac:t Exper im ent stud ied the serve lm ethods o f ex traction po ly hydroxya lkano ic acids ( PHAs) from stra in BRTThe product
from industria l experim ent pur ifaca tion ra te w as 983% , stress was 26 626MPa, the Young s m odu lus was 1287 535 MPa, m e lting
po int w as 173 , m e lting etha lpy was 4318Jg1。
Key words: Po ly hydroxyalkano ic ac ids ( PHA s) Extraction m ethod Exper im ent havest rate S tr iess
收稿日期: 20081125
基金项目:陕西省自然基础研究计划项目 ( SJZT08)
作者简介:何竹青 ( 1982) ,女,陕西西安人,硕士研究生,主要从事应用微生物学研究; Em ai:l sh iyansh iw anzhang@ 126 com
通讯作者:黄建新,教授,硕士生导师; Em ai:l huang jx551@ 163 com
聚羟基烷酸酯 ( PHA s)是一类由微生物在非
平衡生长状态下合成的细胞内贮藏性天然高分子
聚合物。由于其良好的热塑性、光学活性等物理
特性能堪与聚丙烯相比, 以及独特的生物可降解
性和生物相容性,极有可能成为塑料的代替品 [ 1, 2 ]
来缓解严重的环境危机。除此之外, 聚羟基烷酸
酯在农业、食品、日用消费品、电子、光学、生物医
学等高技术领域中均有广泛应用前景, 日益成为
研究的热点 [ 6, 8 ]。
制约 PHAs工业化生产的主要因素之一是后期
提取和纯化的成本过高 [ 3 ] , 因此一种低廉、有效且
简便易行的提取方法成为研究的重点。目前由产碱
菌、自生固氮菌产生的 PHA s提取方法主要包括有
机溶剂法、酶法和化学试剂法等 [ 4] , 而对动胶菌产
生 PHA s提取方法却鲜有报道。动胶菌生长周期
快,营养要求简单, 是生产聚羟基烷酸酯的理想菌
株。因此,对本实验室获得的一株高产 PHAs的动
胶菌菌株发酵产物 PHA s的非溶剂提取方法进行了
研究,得到一种简便易行的提取 PHAs的方法,证实
动胶菌生产聚羟基烷酸酯的可行性, 具有很好的工
业化的应用前景。
1 材料与方法
11 菌种
动胶菌 BRT,由本实验室提供。
12 培养基
斜面培养基: 葡萄糖 10 g /L, 蛋白胨 5 g /L,牛肉
膏 3 g /L, NaC l 1 g /L,琼脂 18 g /L, pH 72~ 74。
发酵摇瓶培养基: 蔗糖 25 g /L, 酵母膏 7 g /L,
KH 2PO4 2 g /L, N a2HPO4 2 g /L, M gC l2 02 g /L, Fe
SO4 05 g /L, pH 72~ 74, 121 灭菌 20 m in。
13 培养方法
将活化好的斜面菌种接入装有 50 m l种子培养
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2009年第 4期
基的三角瓶中, 30 置 180 r /m in摇瓶培养 18 h后,
以 10%接种量转接入 5 L自控机械搅拌发酵罐中,通
气量 11VVM,搅拌转速 520 r/m in, 30 发酵 32 h。
14 细胞制备
收集发酵液,于 4 000 r /m in离心 20 m in,菌体
用蒸馏水洗涤后离心收集。
15 PHA s的提取方法
151 溶剂提取法 取 80 恒温烘干的菌体于洁
净干燥的器皿中, 加入 5倍量氯仿,加塞密闭, 60
水浴 1 h。分离出氯仿层, 注入洁净干燥的培养皿
中,自然挥发得到 PHAs产物; 菌体重复抽提 2~
3次。
152 表面活性剂法 将离心得到的湿菌体配成
细胞悬液 ( 350 g /L ) , 加入不同表面活性剂在 50
下磁力搅拌 20m in。于 4 000 r /m in离心 20m in,将
沉淀再配成悬液,加入次氯酸钠,作用 5 m in后离心
收集沉淀,得到产物。取少量产物溶于氯仿后进行
测定。
16 PHA s纯度分析
硫酸降解法 [ 10 ]。
17 PHA s的平均粘分子量测定
粘度法 [ 5, 9]。
18 熔点测定
用差示扫描仪进行热化学分析, 以 10 /m in速
度升温,在 50~ 200 范围内检测熔点和热焓。
2 结果与讨论
21 表面活性剂对 PHAs提取效果
采用溶剂法从发酵菌体中提取 PHAs时, 由于
湿菌体有一层水化膜直接用溶剂很难提取, 因此必
须将菌体干燥后方可进行,故该提取法造成能耗高,
污染严重、其成本高, 不适应工业化生产的需要。因
此,采用水相非溶剂提取 PHA s的方法的研究就具
有重要的应用意义。
动胶菌是革兰氏阴性菌,细胞壁含有肽聚糖、脂
多糖、脂蛋白,且在细胞壁外还有层类似荚膜的多糖
类物质,这些物质的存在很大程度上影响了胞内产
物 PHA s的提取效率。根据该菌的细胞结构特点以
溶剂提取法为参照, 设计了表面活性剂水相提取
PHBs的方法,即利用表面活性剂疏水部分插入细胞
膜磷脂双分子层,最终达到破胞效果,使 PHAs颗粒
释放出来。分别将 32 h培养后的菌体制备成 200
g /L的菌悬液, 加入 SDS (十二烷基磺酸钠 )、季铵
盐、吐温和去垢剂, 在 20~ 70 温度下测定 PHA s的
提取率 (图 1)。
图 1 表面活性剂对 PHAs提取的影响
如图 1所示, 季铵盐作用下的 PHA s的提取率
明显优于其他表面活性剂作用的结果,提取率高达
676%。在季铵盐作用下多糖类物质可以降解成为
小分子物质, 达到破壁效果, 使 PHA s易释放出来。
在 20~ 70 期间, 随着温度上升, 提取率逐渐增加,
温度升至 50 左右时, 提取效果最好, 温度继续上
升则提取率有所下降。因此选取效果最佳的季铵盐
在 50 时进行后续试验。
22 季铵盐浓度及作用时间对 PHAs提取的影响
分别将 1%, 3%, 5%的季铵盐加入经 32 h培养
图 2 季铵盐浓度及作用时间对 PHA s提取效果的影响
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2009年第 4期 何竹青等:动胶菌发酵产物 PHA s提取方法的研究
后制备的菌悬液中每隔 5 m in测定 PHA s的提取率。
如图 2所示,随作用时间的增加 PHA s的提取率逐
渐增高,其中季铵盐浓度为 1% ,作用 15m in效果最
好。随着时间的延续, PHA s的提取率反而下降。
高浓度的季铵盐提取 PHA s效果差。
23 季铵盐和次氯酸钠混合处理对 PHA s提取的
影响
季铵盐作用后,细胞破裂水相体系中除了 PHAs
外还含有其他细胞物质, 不易与 PHA s分离, 因此获
得的 PHA s纯度约 70%。在 1%的季铵盐 15m in作
用后, 离心取沉淀分别加入 1%, 3% , 5%的次氯酸
钠,比较次氯酸钠作用 1~ 15 m in对 PHAs提取率的
影响 (图 3)。
图 3 混合培养对 PHAs提取的影响
结果如图 3所示, 次氯酸钠的氧化作用可以降
解细胞中多糖脂质等物质, 增加提取率。次氯酸钠
作用时间从 1~ 11m in,在 5m in时达到最高,随后提
取率随作用时间增加反而下降,这可能是由于长时
间作用下次氯酸钠对 PHAs有分解作用, 导致提取
率下降。如图所示, 结果表明以 3%的次氯酸钠作
用效果最好。后续试验就选取次氯酸钠浓度为 3%
作用时间 5m in。
24 细胞浓度对 PHA s提取的影响
细胞浓度决定了提取环境的黏度,从而影响了
搅拌率以及季铵盐和次氯酸钠与细胞的接触面积和
作用效果。菌悬液配成 150~ 450 g /L的细胞浓度进
行试验,比较细胞浓度对 PHA s提取的影响 (图 4)。
结果如图 4所示, 随着细胞浓度的上升,提取率
逐渐升高,细胞浓度在 350 g /L时作用效果最好, 随
图 4 细胞浓度对 PHA s提取的影响
后提取率随细胞浓度增加反而下降。这是由于菌体
悬液密度过大,影响季铵盐和次氯酸钠处理的效果,
使得菌体无法与试剂充分作用,从而影响提取率。
25 溶剂直接提取法与季铵盐和次氯酸钠共同处
理法热化学性质分析
PHAs的热学性质, 直接影响着用其为原料生
产的物质的品质好坏 [ 7]。分别把用溶剂直接提取
的 PHA s与季铵盐和次氯酸钠共同处理法的提取的
PHAs进行热化学性质对比,结果见图 5。溶剂直接
提取法通过紫外法测定其纯度为 994% , 粘均分子
量为 912 105;季铵盐和次氯酸钠共同处理法所得
到的产物纯度为 983%、粘菌分子量是 764 105,
完全符合高分子化合物加工要求。
由图 5可以看出, PHAs有 2个峰,说明动胶菌生
产的 PHAs是两种组分的共混高聚物,位于 170 的峰
是 PHB,也是 PHAs的主要成分 [ 7]。出峰温度不同,峰
高也相差较多,说明不同提取方法所生产的 PHAs在加
热过程中热量变化明显不同,加工性质也有区别。此
外,图 5A, B中均有 170 的峰,说明存在的 PHB的成
分基本一致。图 5A, B的相似性说明了两种方法提取
的 PHAs本质上是没有差异的。
26 溶剂直接提取法与季铵盐和次氯酸钠共同处
理法力学性能分析
PHAs作为材料应用, 则要求具有必要的力学
性能。对于大部分应用领域而言, 力学性能比高聚
物的其他物理性能显得更为重要。对不同提取方法
得到的产物薄膜进行力学测试,参数详见表 3。
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2009年第 4期
图 5 不同提取方法下 PHA s的热性质分析图
表 3 溶剂直接提取法与季铵盐和次氯酸钠共同
处理法力学参数的比较
负载
( kN)
拉力 b
(MPa)
位移
(mm )
模量 E
(MPa)
溶剂直接提取 0043 16180 1678 512746
季铵盐和次氯酸钠共同提取 0045 26265 0675 1287535
从数据可以看出应用溶剂直接提取的 PHA s与
季铵盐和次氯酸钠共同提取的 PHAs在力学性质有
显著不同,尤其是在拉力 ( b)和模量 ( E )这两个最
为重要的力学量上,后者明显优于前者,说明应用季
铵盐和次氯酸钠共同提取动胶菌生产的 PHAs是一
种可行的好方法。
3 小结
试验得到一种动胶菌产生的 PHAs的提取方
法,在 350 g /L的细胞浓度下,用 1%的季铵盐搅拌
细胞 15 m in后离心得到沉淀, 把沉淀配成再悬液与
加入 3%的次氯酸钠作用 5m in后离心取沉淀,烘干
得到产物。
把得到的产物进行热学和力学检测, 发现溶剂
直接提取的 PHA s与季铵盐和次氯酸钠共同作用提
取的 PHA s在本质上没有区别, 而力学强度却有明
显的差异,从而证明了季铵盐和次氯酸钠共同作用
提取 PHA s是一种简单易行的好方法。
参 考 文 献
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