全 文 ：·综述与专论·
生物技术通报
B IO TECHNOLOGY BULL ETIN 2009年第 6期
分泌高效蛋白的地衣芽孢杆菌及其工业应用
牛丹丹 石贵阳 王正祥
(江南大学生物工程学院生物资源与生物能源研究中心 ,无锡 214122)
摘 要 : 革兰氏阳性、腐生性地衣芽孢杆菌是高温α2淀粉酶、碱性蛋白酶的重要工业生产用菌株。其基因组大小约为
4122 Mb,已被多个国际机构认定为 GRAS工业菌株。地衣芽孢杆菌具有完善的蛋白分泌体系 ,蛋白合成与分泌能力可达到
20～25 mg/m l。在作为外源基因表达系统的研究中 ,建立了其遗传转化方法 ,完成了多种表达载体的构建与应用 ,以及进行了
作为宿主细胞的地衣芽孢杆菌的遗传改良与多种重组蛋白表达的研究。显示地衣芽孢杆菌具有作为重组蛋白高效分泌表达
的巨大潜力与工业应用价值。
关键词 : 地衣芽孢杆菌 基因表达 工业酶制剂
Research Progress of High Prote in Secretion B acillus
lichen iform is and Its Industr ia l Application
N iu Dandan Shi Guiyang W ang Zhengxiang
( Center for B ioresource and B ioenergy, School of B iotechnology, J iangnan University, W uxi 214122)
Abs trac t: Gram2positive sap rophytic B acillus licheniform is is an important species for industrial enzymes p reparation, such as
thermastableα2amylase or alkaline p rotease1 It has about 4122 Mb genome and is generally regarded as safe as involved in industrial
app lication1B 1 lichen iform is possesses a comp lete p rotein secretory system, and is able to synthesize and secret kinds of hydrolases with
secretory volume of 20～25 mg/m l1 For the purpose of gene overexp ression, genetic transformation, many kinds of exp ression vectors
and host cell genetical modification as well as some benefit genes overexp ression have been carried out in B 1 lichen iform is1 Overall,
B 1 lichen iform is has performed a great potencial for commercial app lication in recombinant p rep ration1
Key wo rds: B acillus licheniform is Gene exp ression Industrial enzymes
收稿日期 : 2008211224
基金项目 :国家“863”计划 (2006AA020204)
作者简介 :牛丹丹 (19802) ,女 ,汉 ,在读博士 ,研究方向 :工业酶制剂与工业微生物学
通讯作者 :王正祥 ,教授 ,博导 ; E2mail: zxwang@ jiangnan1edu1cn 地衣芽孢杆菌 (B acillus lichen iform is)是一种革兰氏阳性腐生性微生物 ,广泛分布于土壤和其它自然环境中 ,具有耐热、酶系丰富、产酶量更高和安全等诸多优良特性 ,被认为是较理想的工业生产菌株 ,其模式菌株的基因组序列也于 2004年公布。与枯草芽孢杆菌相比 ,地衣芽孢杆菌生长温度高 5～7℃;其次 ,其生长速率适中 ,容易使刚跨膜的未合适折叠得蛋白充分折叠 ;此外 ,地衣芽孢杆菌分泌蛋白至培养基中的能力大约是枯草芽孢杆菌的 2倍 ,异源蛋白表达水平已报道达到 20～25 mg/m l[ 1 ] ,为所见报道的所有芽孢杆菌表达水平最高者。就地衣芽孢杆菌作为蛋白质特别是工业酶制剂的表达系统的 研究作一综述。1 地衣芽孢杆菌基本生物学特征111 生物学分类与生态在芽孢杆菌属中 , B acillus am yloquefaciens, B a2cillus a trophaeus, B acillus lichen iform is, B acillus pum i2lus和 B acillus subtilis传统上被认为是生理特征相似的 5个种 ,但通过 DNA同源性分析 ,可以很容易将它们区分开来。地衣芽孢杆菌与 B 1 pum ilus的DNA相似性大约为 8% ,与其亲缘关系最近的解淀粉芽孢杆菌的 DNA相似性在 9% ～15%。 r2RNA小亚基序列可以将这 5个种区分开来。利用地衣芽孢杆菌的厌氧生长能力、精氨酸脱水酶生产、淀粉水解
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生物技术通报 B iotechnology B u lletin 2009年第 6期
以及利用丙酸为惟一碳源生长等特性 ,也可以将此
与枯草芽孢杆菌区分开来。
112 传染
有关地衣芽孢杆菌致病性曾有 10例左右的病
例报道 ,皆为创伤、器官移植等继发感染的病例。目
前没有关于地衣芽孢杆菌能够突破人体天然免疫屏
障 ,如皮肤、呼吸道粘膜、消化道感染人类 ,及作为伤
口感染常见病菌的报道。因此 ,地衣芽孢杆菌被认
为是非人类致病菌。
113 食物中毒
地衣芽孢杆菌引起的食物中毒鲜见报道。地衣
芽孢杆菌长期作为食品加工用酶制剂的生产 ,已经
说明某些地衣芽孢杆菌可能产生毒素不是引起食物
中毒的主要原因。
2 地衣芽孢杆菌及其重组菌的工业应用许
可历程
1972年 ,地衣芽孢杆菌已被大规模应用于淀粉酶
的发酵生产 , 1981年 ,《食品化学品索引》将地衣芽孢杆
菌列为食品加工用淀粉酶和蛋白酶的来源。1981年 ,
由地衣芽孢杆菌生产的淀粉水解酶和蛋白酶被美国
FDA鉴定为 GRAS级 ,在其补充说明中强调 :“地衣芽
孢杆菌是一种被普遍认知的多种食品中存在的常见微
生物 ,没有任何有关食品存在此种微生物与任何毒性
或致病性相关的报道”。1989年 ,丹麦卫生部在世界上
首次给予基因重组地衣芽孢杆菌菌株工业应用的生产
许可和环境认证 ,并宣布重组地衣芽孢杆菌菌株满足
“优良工业性大规模生产 ( good industrial large scale
p roduction organism s, GILSP organisms) ”生物体的所有
要求。1988年 ,美国国立卫生研究院 (N IH)在其《重组
DNA分子研究准则》中部分豁免了有关地衣芽孢杆菌
宿主 /载体系统有关限制 ,让地衣芽孢杆菌生物安全地
位与枯草芽孢杆菌相似。1991年 ,N IH修补了其 1988
年发布的《重组 DNA分子研究准则》,引入了与 GILSP
标准相同的 GLSP ( good large2scale p ractice,优良大规
模实践 )标准 ,用于指导和规范研究与生产中的重组微
生物的大规模培养。1987年起 ,多个重组地衣芽孢杆
菌得到美国环保署的生产许可。1988年 ,日本国际贸
易与工业厅也批准了重组地衣芽孢杆菌的生产许可。
现在 ,有关地衣芽孢杆菌遗传操作与重组菌的
工业应用国际准则是 :作为宿主细胞的地衣芽孢杆
菌为无芽孢突变株 ,回复突变率低于 10 - 7 ;作为遗
传载体 ,内源性质粒或噬菌体的其它宿主不包括蜡
状芽孢杆菌或炭疽杆菌。
3 地衣芽孢杆菌基因组特征
2004年 ,国际上两个独立研究小组几乎同时报道
了有关地衣芽孢杆菌模式菌株 ATCC14580 (DSM13)基
因组研究工作 [ 1, 2 ] ,并以 Veith等的研究小组的研究结
果更为准确。地衣芽孢杆菌 DSM13基因组特征为 :单
一环状染色体 ,大小为 4 222 748 bp (ATCC14580大小
为 4 222 336 bp) , G +C含量为 4612% ,含有 4286个开
放阅读框 , 72个 tRNA基因 , 7个 rRNA操纵子和 20个
转座酶基因。与枯草芽孢杆菌基因组极具相同之处 ,
有 80%的编码序列与枯草芽孢杆菌相似 ,但无论在基
因组序列还是功能水平上皆含有与枯草芽孢杆菌完全
不同的插入区域。地衣芽孢杆菌 DSM13含有高度保守
的蛋白分泌系统 ,没有聚酮体合成体系 ,但能形成脂肽
性地衣素。该基因组中也显示了乙醛酸途径和厌氧核
糖核酸还原酶的存在 ,解释了地衣芽孢杆菌能够利用
乙酸和 2, 3丁二醇生长并能厌氧代谢葡萄糖的生理特
征。地衣芽孢杆菌 DSM13基因组的一般特征与其它
相近基因组的异同性 ,见表 1。
表 1 地衣芽孢杆菌基因组与其它相近基因组的特征比较
B 1 licheniform is B 1 subtilis B 1 halodurans B 1 cereus B 1 anthracis
基因大小 ( bp) 4, 222, 748 4, 214, 810 4, 202, 353 5, 224, 283 5, 227, 293
基因数 4, 286 4, 112 4, 066 5, 642 5, 508
编码序列含量 ( % ) 8719 8710 8510 8510 8413
G + C含量 % 4612 4315 4317 3516 3514
RRNA操纵子数量 7 10 8 12 11
tRNA基因数量 72 86 78 98 95
前噬菌体基因 71 268 42 124 62
转座酶数量 10 0 93 10 18
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2009年第 6期 牛丹丹等 :分泌高效蛋白的地衣芽孢杆菌及其工业应用
依据地衣芽孢杆菌 DSM13基因组序列 ,已经确定
的胞外酶有 α2淀粉酶 (BL i00656)、(2葡萄糖苷酶
(BL i03543、BLi02117 )、α2L2聚阿拉伯糖 2果糖苷酶
(BL i03021)、聚阿拉伯糖内切 21, 52L2阿拉伯糖酶
(BL i01295)、聚阿拉伯糖内切 21, 52α2L2阿拉伯糖苷酶
(BL i04220)、聚阿拉伯基半乳糖内切 21, 42α2半乳糖苷
酶 (BL i04276)、β2半乳糖苷酶 (BLi00447)、β2葡萄糖苷
酶 (BL i04214)、纤维素酶 (BL i01882)、纤维素 1, 42β2纤
维二糖糖苷酶 (BL i01881 )、几丁质酶 (BL i00338、
BL i00339)、内切 21, 42β2葡聚糖酶 (BL i02088)、内切 21,
42β2甘露糖苷酶 (BL i01883)、内切 21, 42β2木聚糖酶
(BL i00655)、内切 2葡聚糖酶 (BLi01880)、谷氨酸特异性
蛋白酶 (BL i00340)、果聚糖酶 (BLi02827)、果聚糖酶
(BL i03707)、果聚糖蔗糖酶 (BL i03706)、脂肪酶 /酯酶
(BL i03370、BL i02821、BL i00545 )、麦 芽 糖 淀 粉 酶
(BLi00658 )、次要胞外丝氨酸蛋白酶 (BL i04019、
BL i01123)、果胶裂解酶 (BL i01404、BL i03053、BL i03741、
BL i04129)、果 胶 甲 基 酯 酶 ( BL i03498 )、肽 酶 T
(BL i04177 )、多聚糖降解酶 (BL i01399 )、蛋白酶
(BL i02863、BL i02862)、碱性蛋白酶 (BL i01109)、锌蛋白
酶 (BL i01909)。其中 ,在以前的研究中 ,已经从地衣芽
孢杆菌不同菌株中克隆出的有关重要酶编码基因有 :
青霉素酶 [3, 4 ]、α2淀粉酶 [5 ]、对饱和脂肪酸的作用明显
优于不饱和脂肪酸的 P450单氧酶 [6 ]、果胶裂解酶 [ 7 ]、
多酚氧化酶 [8 ]、γ2谷氨酰转肽酶 [9 ]、β21, 321, 42葡聚糖
酶 [ 10, 11 ]、蛋白酶 [ 12, 13 ]、Pz2肽酶 [14 ]、纤维素酶 [15 ]、脂
酶 [ 16 ]、β2半乳糖苷酶 [17 ]、碱性磷酸酶 [18, 19 ]、角蛋白
酶 [ 20 ]、环糊精糖基转移酶 [21 ]等编码基因。
4 地衣芽孢杆菌蛋白质合成与分泌特征
与蛋白质合成关联的 tRNA池总结于表 2。地
衣芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌在 tRNA种类和数量上
皆有一定差异。
与枯草芽孢杆菌相似 ,地衣芽孢杆菌 DSM13包
含有 5种蛋白质分泌途径 : Sec型分泌途径、Tat运
输途径、ABC转运途径、Com分泌途径和穿膜途径
(图 1)。Sec途径中 ,先导蛋白翻译后 ,其分泌过程
能被信号肽识别颗粒 CsaA或 SRP识别 ,并维持合
适的结构以刺激 SecA蛋白到下一个蛋白。在转运
后的短时间内 ,先导蛋白由信号肽 I型酶酶切加工
表 2 地衣芽孢杆菌和枯草芽孢 tRNA池
Codon3 Ratio3 3
A la AGC GGC 1 /1 CGC TGC 5 /3 6 /4
Gly ACC GCC 4 /2 CCC TCC 3 /3 7 /5
Pro AGG GGG CGG TGG 3 /1 3 /1
Thr AGT GGT 1 /1 CGT 0 /1 TGT 4 /2 5 /4
Val AAC GAC 1 /1 CAC TAC 4 /3 5 /4
Phe AAA GAA 3 /3 3 /3
A sn ATT GTT 4 /4 4 /4
Lys CTT TTT 4 /3 4 /3
A sp ATC GTC 4 /4 4 /4
Glu CTC TTC 6 /6 6 /6
H is ATG GTG 2 /2 2 /2
Gln CTG TTG 4 /4 4 /4
Ile AAT GAT 3 /3 TAT 3 /3
Met CAT 6 /6 6 /6
Tyr ATA GTA 2 /2 2 /2
Sup res CTA TTA 0
Cys ACA GCA 1 /1 1 /1
Trp CCA 1 /1 1 /1
Ser AGA GGA 1 /1 CGA TGA 2 /2 5 /5
ACT GCT 2 /2
A rg ACG 4 /2 GCG CCG 1 /1 TCG 7 /5
CCT 1 /1 TCT 1 /1
Leu AAG GAG 1 /1 CAG 1 /1 TAG 2 /1 8 /5
CAA 1 /1 TAA 3 /13 表中密码子后的数据为相同 B 1subtilis /B 1 licheniform is tRNA数量3 3 B 1subtilis /B 1 licheniform is同义 tRNA总数
并折叠成成熟蛋白后释放到培养基中。Tat分泌途径
的组成成分有 TatAD、TatCD、TatAY和 TatCY,支持先
导蛋白的转运。在转运过后 ,先导蛋白由信号肽 I型
或 II型酶酶切加工 ,折叠的成熟蛋白释放到培养基
中。通过不依赖于 Sec的途径来转运后 ,脂蛋白的先
导蛋白被 Lgt脂修饰并由脂蛋白信号肽酶 L spA
( SPase II)酶切。纤毛蛋白共转录过程中的酶切和氨
基端甲基化都依赖于 ComC。蛋白包括 ComGA、
ComEC、ComGF、ComFA、ComEA、ComGG、ComGC、
ComGD和 ComGE,其帮助先导蛋白的转运。转运后
先导蛋白的信号肽被 ComC剪切 ,而先导蛋白在膜的
胞内恻被甲基化修饰并且由类似 ComC的信号肽酶
剪切。ABC转运蛋白的推测分泌途径如下 :先导蛋白
通过 NBD结合到质膜。在被 ATP酶如 EscA /B 或
CydD /C剪切后 ,随着胞膜成分的加工 ,蛋白分泌出膜
外并释放至培养基中。许多不带有信号肽的胞外蛋
白在其先导蛋白有跨膜区 ,它能引导蛋白分泌到胞外
或他们整个拓扑结构在膜外。
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生物技术通报 B iotechnology B u lletin 2009年第 6期
N1代表亲水区 ; H1代表疏水区 ; C1代表羧基端 ;M1代表成熟蛋白 ; TM1代表跨膜区
图 1 地衣芽孢杆菌 D SM 13蛋白的分泌途径
地衣芽孢杆菌 DSM13的信号肽可分为 5类 :由
I型信号肽酶 ( SipS/T/W /V )切割的 Sec分泌型信
号肽 ,双精氨酸结构信号肽 ( Tat信号肽 ) ,由 I型信
号肽酶切割的脂蛋白 (L ip )信号肽 ,由 Com切割的
纤毛 (Com)信号肽 ,以及由 EscA /B或 CydD /C切割
的生物信息素 (ABC)信号肽。
5 地衣芽孢杆菌作为外源基因表达宿主的
主要研究进展
地衣芽孢杆菌菌株及其经过传统遗传改良获得
的突变株 ,已经作为生产菌株在酶制剂工业中使用
数十年。这一菌株的最突出性能是其具有极高分泌
蛋白质 (酶 )的能力 ,其特定酶蛋白的分泌能力已有
报道达到 20～25 mg/m l。但相对于其它表达系统
而言 ,因为其遗传转化极为困难以及枯草芽孢杆菌
表达系统的研究在较长一段时间没有任何实质性进
展等因素的影响 ,以地衣芽孢杆菌作为基因表达系
统的研究 ,没有得到足够的重视。
511 遗传转化体系的建立
Imanaka等 [ 22 ]在 1981年研究地衣芽孢杆菌青
霉素基因的表达中 ,第一次实现了以 pMB9为骨架
的重组质粒对地衣芽孢杆菌原生质体的转化。1989
年 , Jensen和 Hulett[ 23 ]首次较系统的研究了地衣芽
孢杆菌原生质体遗传转化方法 ,并总结出原生质体
转化后再生温度提高到 46℃是实现其遗传转化的
关键。1994年 , Enterococcus faeca lis Tn916可以通过
细菌接合的方式以 10 - 5 ～10 - 7的几率转移入地衣
芽孢杆菌 [ 24 ]。但这一方法没有在后续的研究中采
用 ,相反 , Tn916的相关序列被用在芽孢杆菌的表达
载体的构建中。1999年 , Xue等 [ 25 ]较系统的研究了
运用电穿孔法转化地衣芽孢杆菌的方法学优化。我
们也曾对特定地衣芽孢杆菌菌株的遗传电转化方法
进行过优化。2008年 ,德国一个课题组 ,研究获得
了地衣芽孢杆菌中的两个限制性修饰系统的限制性
酶编码基因的缺少突变株 ,利用此突变株可以实现
大肠杆菌来源的质粒 DNA的稳定遗传转化 [ 26 ]。此
研究是地衣芽孢杆菌遗传操作中一个重要突破。
但总的来说 ,地衣芽孢杆菌的遗传转化是十分
困难的 ,转化率十分低下 ,转化操作需要富有经验的
研究人员进行。此外 ,不同地衣芽孢杆菌菌株以及
不同研究目的对遗传操作的要求也有不同。
512 表达载体的构建与表达稳定性
多篇研究报导显示 ,从枯草芽孢杆菌等来源的质
粒以及从地衣芽孢杆菌若干分离菌株中来源的天然
质粒 ,可以在地衣芽孢杆菌中进行复制。从地衣芽孢
杆菌中分离获得的质粒也是以 RepA为基础 ,进行滚
环复制 ,并且 RepA与枯草芽孢杆菌来源的高度相
似 [ 27 ]。如在枯草芽孢杆菌中使用的 pUB110[ 28 ]、
pHY300p lk[ 29 ]、pDG148[ 30 ]等都可以在地衣芽孢杆菌
中较稳定的维持。故以这类质粒为基础构建许多枯
草芽孢杆菌表达载体原则上皆可以用于地衣芽孢杆
菌的遗传操作。现有的文献尚无针对地衣芽孢杆菌
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2009年第 6期 牛丹丹等 :分泌高效蛋白的地衣芽孢杆菌及其工业应用
专用表达载体的报导。
第一篇突出标注为专用于地衣芽孢杆菌的整合
型载体见于 1998年的报导。在该报导中 ,所构建的
载体 pTLH包含有无启动子的大肠杆菌 lacZ基因、
pBR322复制原点、卡那霉素抗性选择性标记 ,以及
杆菌肽合成酶操纵子的第一个基因的内侧部分序列
用于对地衣芽孢杆菌的染色体整合。特异性整理发
生后 ,重组菌因不能合成杆菌肽 ,则在藤黄微球菌指
示平板上不出现抑菌圈 [ 31 ]。
地衣芽孢杆菌碱性磷酸酶 I编码基因的启动子
较早被鉴定为一超强诱导型启动子 ,并受磷浓度的
严谨调控 [ 32 ]。另一个调控青霉素酶表达的启动子
也被鉴定 ,可以用作引导外源基因的表达。以地衣
芽孢杆菌α2淀粉酶基因及其上下游序列为基础的
新型分泌表达系统也成功构建与初步应用 [ 33, 34 ]。
其它一些来源于枯草芽孢杆菌的启动子和信号肽序
列也可以试用于地衣芽孢杆菌的表达载体的构建。
有关研究地衣芽孢杆菌生理性能时使用基因报
导载体的研究见于最近的报道。在构建穿梭表达载
体 pCSS810和 pGFPratiometric的基础上 ,在地衣芽
孢杆菌中表达荧光素酶或绿色荧光蛋白 ,通过对比
发现 ,荧光素酶更能检测目的细胞的生长状态 ,并且
对目的细胞的生长、代谢几乎没有影响 [ 35 ]。
513 基因表达技术的研究与宿主细胞改良
地衣芽孢杆菌基因表达技术主要采用游离表达
与整合表达两种形式。宿主细胞的改良主要集中于
芽孢形成缺陷株及其蛋白分泌能力的研究上。目的
基因拷贝数提高可以有效提高目的基因产物在地衣
芽孢杆菌中的表达水平。如提高碱性蛋白酶编码基
因的拷贝数 ,碱性蛋白酶提高 65% [ 36 ] ;角蛋白酶水
平在其编码基因拷贝数提高 3～5倍时 ,产酶水平提
高了 4～6倍 [ 37 ]。
另一方面 ,地衣芽孢杆菌菌株改良也有利于目的
分泌蛋白水平的提高。地衣芽孢杆菌芽孢形成所必
需基因 spoIIAC突变 ,则其产角蛋白酶水平不变 ,有利
于工业生产 [ 38 ]。芽孢形成缺陷突变株不影响其 DNA
酶、RNA酶、聚半乳糖醛酸裂解酶、蛋白酶和木聚糖
酶水平 ,但葡聚糖内切酶、羧甲基纤维素酶活力有所
降低 ,而延长发酵时间至 72 h,α2淀粉酶水平降低
30% [ 39 ]。提示芽孢形成缺陷突变株基因的突变 ,对
不同目的基因的表达会产生不同的影响。提高突变
d lt操纵子改变地衣芽孢杆菌细胞壁结构 ,异源环糊
精糖基转移酶分泌水平提高 115～7倍 [ 40 ]。
运用 13 C示踪技术研究芽孢形成缺陷突变株的
代谢特征 ,结果显示 ,地衣芽孢杆菌代谢流通过磷酸
戊糖途径明显加快 ,好氧和厌氧代谢平衡性较枯草
芽孢杆菌优 ,多种生长条件下皆能保持良好生长并
仅出现乙酸代谢流的适度变化 [ 41 ]。
对地衣芽孢杆菌所分泌的酶蛋白编码基因 ( ce2
lA, ch iA和 am yL )进行删除 ,再通过多拷贝游离质粒
载体表达异源淀粉酶基因发现突变株表达异源淀粉
酶的水平明显提高 ;同时细胞自身表达的蛋白酶活
力也显著提高 [ 42 ]。暗示特定地衣芽孢杆菌菌株的
蛋白质分泌能力可能存在一个分泌容量极限。
6 结束语
地衣芽孢杆菌作为基因高效表达的宿主细胞具
有极其吸引力的重要原因是其具有很高的蛋白质分
泌能力。与其它主要研究的芽孢杆菌分泌表达相
比 ,地衣芽孢杆菌的分泌表达系统还更多的处于实
验室研究阶段 ,若干科学和技术难题需要逐步加以
解决。如稳定用于基因操作的地衣芽孢杆菌宿主细
胞 ;针对不同研究与应用目的的多种表达载体的构
建等。
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蔬菜营养与品质 (精装 ) ·书 讯·
王正银 主编 徐卫红 李会合 副主编
97827203202323325 86100 2009年 4月 出版
本书以植物营养学、蔬菜学、环境科学、人类健康学等多学科交叉和有机结合为特点 ,首次系统阐述了蔬菜营养与品质的基本理论
和优质蔬菜生产的营养调控技术。全书共八章 ,包括蔬菜营养基本原理、蔬菜的品质特性、蔬菜营养与硝酸盐、蔬菜营养与重金属、土
壤营养与蔬菜品质、设施蔬菜营养与品质、特用蔬菜营养与品质、优质蔬菜的营养调控。
本书适于大专院校农业资源与环境、土壤学、植物营养学、园艺学、农学、生命科学、环境科学、食品科学等专业的本科生、研究生和教师以
及广大农业科技工作者参考阅读。
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