全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2009年第 3期·研究报告·
收稿日期：2008-08-19
基金项目：农业部“948”项目（2006-G23）
作者简介：程继东（1979-），男，内蒙古人，硕士，研究方向：植物基因工程
通讯作者：安玉麟（1954-），男，硕士生导师；E-mail：nkyanyulin@163.com
向日葵 （Helianthus annuus L.） 是一种适应性
强、 能够耐受低度干旱和盐碱的重要经济作物，是
植物油脂和蛋白的重要来源， 特别是我国新疆、甘
肃、内蒙古等北方省区的主要油料作物。 如果将抗
旱、耐盐相关基因导入向日葵中，无疑会进一步增
强其抗逆性，产生巨大的经济效益 、社会效益和生
态效益。 然而植物的抗干旱、耐盐碱性状是由多基
因控制的数量性状， 这给杂交育种带来很大困难，
而且常规育种费时费力，周期长、见效慢，不能适应
当前向日葵生产发展的需要。 近年来，基因工程技
术在作物品种改良中的广泛应用， 特别是抗旱、耐
盐相关基因的克隆，为作物抗旱、耐盐新品种选育
开辟了一条新途径。
脯氨酸 （proline） 是植物中主要的渗透调节物
质之一 ，它不仅是生物大分子的保护剂 、羟基的清
除剂， 还是植物从胁迫条件回复正常过程中迅速、
有效的氮源、碳源和还原剂。包括细菌、真菌和植物
等在内的许多物种，在渗透胁迫条件下常通过积累
脯氨酸来达到渗透调节的作用。 目前已从细菌、酵
母、水稻、黑麦、大豆、拟南芥、苜蓿等中克隆出了多
个脯氨酸合成酶或与之相关的基因，即脯氨酸合成
酶基因家族。 在胁迫条件下，谷氨酸在植物细胞质
中合成脯氨酸。 其中 P5CS（△-二氢吡咯-5-羧酸合
成酶）是一个双功能酶 ，具有 γ-谷氨酰激酶和谷氨
酰 γ-半醛脱氢酶活性， 催化从谷氨酸合成脯氨酸
的最初两步反应，其活性受脯氨酸反馈抑制。 P5CS
抗旱、耐盐基因 P5CS转化向日葵自交系
程继东 1，2 安玉麟 1 孙瑞芬 1
（1内蒙古农牧业科学院生物技术中心，呼和浩特 010031；2内蒙古农业大学农学院，呼和浩特 010019）
摘 要： 以向日葵保持系 75-33B和恢复系 Ht80-97的子叶为转化受体材料，用携带 P5CS基因的双元载体系统的
根癌农杆菌进行叶盘转化，获得抗 Kan的转化芽。提取转化芽总 DNA进行 PCR 检测及 PCR -Southern杂交检测，证实获
得阳性抗性芽 75-33B 2株，Ht80-97 4株，转化率分别为 3.17%和 4.65%。
关键词： 向日葵 P5CS基因 遗传转化 PCR 扩增 PCR -Southern杂交
Drought and Salt-alkali Resistance Gene P5CS Transformed into
Sunflower Inbred Lines
Cheng Jidong1，2 An Yulin1 Sun Ruifen1
（1Biotechnology Research Center，Inner Mongolia Academy of Agriculture and Animal Husbandry Sciences，Huhhot 010031；
2Institute of Agronomy，Inner Mongolia Agriculture University，Huhhot 010019）
Abstract： The leaf discs of sunflower maintainer line 75-33B and restorer line Ht80-97 were transformed with
P5CS gene mediated by Agrobacterium tumefaciens which carried a binary vector pCHF3/ P5CS. Transgenic shoots were
obtained and detected by PCR and PCR -Southern blotting. The results indicated that two transgenic shoots from
maintainer line 75-33B and four from restorer line Ht80-97 were positive，and the frequency of genetic transformation
was 3.17% and 4.65% respectively.
Key words： Sunflower P5CS gene Agrobacterium tumefaciens mediated gene transfer PCR amplification PCR -
Southern blotting
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2009年第 3期
基因在脯氨酸积累以降低渗透胁迫，下反馈调控植
物中脯氨酸合成水平等方面均起着重要作用。在胁
迫条件下，植物中脯氨酸的积累是两条途径相互调
控的结果， 即增加脯氨酸合成酶基因 P5CS 的表达
量，同时抑制脯氨酸降解酶的活性 [1]。
近年来，不少研究者通过农杆菌介导法 [2~9]、PEG
介导法 [10]、基因枪法 [11]、显微注射和花粉管通道
法 [12~15]开展向日葵遗传转化的研究，但主要集中在
转化方法的研究上，导入的基因大多为 GUS 基因。
目前有关抗旱、 耐盐基因 P5CS 导入向日葵的研究
未见报道。 研究表明，农杆菌介导的遗传转化方法
是目前双子叶植物最有效的转化方法。
本研究采用内蒙古农牧业科学院向日葵课题
组自己选育出的保持系 75-33B 和恢复系 HT80-97
两个品种作为转化受体材料，通过农杆菌介导法用
抗旱、耐盐碱基因 P5CS 转化向日葵，获得了转基因
抗性芽，为培育抗干旱、耐盐碱的向日葵新品系奠
定了基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料 向日葵保持系 75-33B 和恢复系
HT80-97 种子由内蒙古农牧业科学院向日葵课题
组提供。
1.1.2 载体与菌株 转化质粒为 pCHF3/P5CS，由
本课题组构建，根癌农杆菌为 LBA4404。
1.1.3 主要生化试剂 利福平（Rif）和 2，3，5-三碘
苯甲酸为 Sigma 产品；6-BA、IAA、L-苯丙氨酸、水解
酪蛋白，纤维素酶和果胶酶、乙酰丁香酮、壮观霉素
（Spe）、卡那霉素（Kan）、头孢霉素（Cef）、2×Taq PCR
MasterMix（含染料 ）和 Plant Genomic DNA Kit 购自
清华大学北京天为时代科技有限公司 ；DIG High
Prime DNA Labeling 和 Detection Starter KitⅠ为 Roche
产品 ；Total BLO -T+TMNylon Membranes 为 Mandel 产
品；其它常规试剂均为国内分析纯。
1.1.4 引物 引物由上海生工生物工程技术服务
有限公司合成，序列如下：引物 1：5-GGTTAGCGG-
TTGGAAGATTGG -3（21 mer）；引物 2：5-TGCGCC-
TAGTCTCAAATCGTG -3（21 mer）。 扩增片段大小为
1 905 bp。
1.1.5 主要培养基 芽再生培养基 ：MS+B5 有机+
肌醇 0.1 g/L+ KNO3 5 g/L+水解酪蛋白 0.5 g/L+6-
BA 1.0 mg/L +IAA 0.07 mg/L +2，3，5-三碘苯甲酸
0.02 mg/L+L-苯丙氨酸 5.0 mg/L+AgNO3 7.0 mg/L +
蔗糖 30 g/L+琼脂 7.0 g/L，pH5.8~6.2。
生根培养基 ：1/2 MS+蔗糖 1%+NAA 0.04 mg/
L+琼脂 7.0 g/L，pH5.8~6.2。
1.2 方法
1.2.1 受体材料的准备 取向日葵保持系 75-33B
和恢复系 HT80-97 种子，剥去种皮，用纱布包好，自
来水下冲洗 0.5~1 h， 先用 75%酒精消毒 1 min，再
用 0.1% HgCl2 消毒 10 min， 无菌 ddH2O 冲洗 3~4
次， 用灭菌滤纸吸干水分， 将种子接种到 1/2 MS
（不加任何激素） 固体培养基上。 培养条件为 25±
1℃， 光照 16 h/d。 分别剪取接种 5 d 的 75-33B 和
HT80-97 的无菌苗子叶，切取子叶接近上胚轴的三
分之一部分， 并将其切成大小约 4 mm×3 mm 的叶
盘，再垂直主叶脉切 1~2 个小切口 ，用 0.05%的果
胶酶和 0.1%的纤维素酶在 30℃条件下共同消化
30 min，用液体 MS 洗叶盘 3 次，备用。
1.2.2 侵染菌液的制备 挑取转化农杆菌 LBA44-
04/pCHF3/P5CS 单菌落，接种于 5 ml（含 Str 100 mg/
L，Rif 20 mg/L，Spe 100 mg/L）YEB 液体培养基中 ，
28℃、150 r/min 振荡培养过夜。 用含相同抗生素的
YEB 液体培养基按 1 ∶10 的比例稀释菌液扩大培
养，当 OD600nm为 0.5~0.6 时，6 000 r/min 离心收集菌
体，用液体 MS 洗菌体 1~2 次，最后用 MS 悬浮菌体
使菌液 OD600nm为 0.8 左右，备用。
1.2.3 叶盘的转化 将叶盘浸泡在制备好的菌液
中侵染 30 min，然后接种在加有乙酰丁香酮 （终浓
度为 100 μM）的芽再生培养基上，黑暗条件下与农
杆菌共培养 3d。
1.2.4 转化体筛选和植株再生 将共培养 3 d 后
的材料转入含 Kan 25 mg/L、Cef 500 mg/L 的芽再生
培养基上，继续暗培养 4 d 后转入光下诱导生芽。 当
再生的芽长到 1 cm 左右时，转接在含 Kan 25 mg/L，
Cef 500 mg/L 的生根培养基中生长并生根。
1.2.5 转基因植株总 DNA 的提取及目的基因的
PCR 扩增 提取方法按照 Plant Genomic DNA Kit
产品说明书进行。 PCR 扩增反应条件：95℃预变性
7 min，94℃变性 1 min，58℃退火 1 min，72℃延伸
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2009年第 3期
PCR-Southern
(%)
75-33B 63 36 5 2 3.17
Ht80-97 86 41 14 4 4.65
表 1 再生芽的筛选及检测
2 min，35 个循环；最后 72℃保温 10 min。 0.8%的琼
脂糖凝胶电泳检测 PCR 结果。
1.2.6 PCR-Southern 杂交检测 以纯化的 pCHF3/
P5CS 质粒的 PCR 扩增产物作为探针进行标记。 标
记方法按照 DIG High Prime DNA Labeling and De-
tection Starter Kit Ⅰ产品说明书进行。 将转化芽总
DNA 的 PCR 产物和质粒 DNA 的 PCR 扩增产物
（作阳性对照），以及非转化芽总 DNA 的 PCR 扩增
产物 （作阴性对照 ） 进行 0.8%琼脂糖凝胶电泳 ，
Southern 吸印转移到尼龙膜上 。 转膜过程按文献
[16]进行。
1.2.7 杂交 方法按照 DIG High Prime DNA Labe-
ling and Detection Starter Kit Ⅰ产品说明书进行。
2 结果与分析
2.1 向日葵叶盘的转化及抗性芽的再生
被侵染的叶盘共培养 3 d 后开始吸水膨胀并
发生弯曲，10 d 后有部分叶盘在其切口处开始有芽
的分化。 多数情况下分化芽出现在叶盘近胚轴端，
但有个别在远胚轴端出现。暗培养一周后转入光照
条件下， 叶盘颜色渐渐变绿并开始有丛生芽产生，
第 3 周为芽集中分化期，有个别外植体出现两处丛
生芽 ，但绝大多数只有一处丛生芽 （图 1-a），叶盘
再生结果见表 1。 当丛生芽长到 1 cm 时，及时从叶
盘上切下， 转移到含 Kan 25 mg/L，Cef 250 mg/L 的
生根培养基中，经过 3~4 周的培养，部分转化芽生
长为抗性芽（图 1-b，c，d），而有些转化芽逐渐黄化
死亡，这些转化芽可能是假阳性芽。 将抗性芽转接
到生根培养基上没有生根，而且在后续的培养过程
中，抗性芽表现出矮化、玻璃化、试管内开花、分枝
多、多头现象（图 2），致使转化芽很难成苗。
2.2 抗性芽的 PCR 检测
以转化芽总 DNA 为模板进行 PCR 检测， 从 2
株 75-33B 和 4 株 Ht80-97 抗性芽中扩增出与阳性
对照相同大小的片段，1 905 bp （图 3，2、4 泳道；图
4，1、2、5、14 泳道），而非转化芽中没有扩增出预期
片段， 初步证明目的基因已整合到向日葵基因组
中。
2.3 PCR-Southern 杂交检测
为了进一步证实 PCR 扩增产物的真实性 ，将
PCR 扩增产物电泳后印迹转移到硝酸纤维素膜上，
以阳性质粒 PCR 回收产物为探针 ， 进行 PCR-
Southern 杂交。 结果表明 PCR 阳性芽显示出较强的
杂交信号（图 5、图 6），而非转化芽没有显示出杂交
信号，进一步证明目的基因已成功整合进向日葵基
因组中。75-33B 的转化率为 3.17%，Ht80-97 的转化
率为 4.65%（表 1）。
c d a b
图 1 叶盘芽的再生及抗性芽的筛选
a b c d
图 2 抗性芽的表现
a.抗性芽矮化；b.玻璃化；c.试管内开花；d.分枝多、多头
a.再生芽；b，c，d.卡那霉素抗性芽
M.λDNA/HindⅢ Marker；1~5.75-33B 转化芽的 PCR 扩增 ；
CK+.阳性对照；CK-.阴性对照
图 3 75-33B 抗性芽 PCR 检测
M.λDNA/HindⅢ Marker；1~14.Ht80-97 转化芽的 PCR 扩增 ；
CK+.阳性对照；CK－.阴性对照
图 4 Ht80-97 抗性芽 PCR 检测
程继东等：抗旱、耐盐基因 P5CS转化向日葵自交系
2 027 1 905
bp bp
2 027
1 905
bp
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2009年第 3期
3 讨论
本研究所用的植物表达载体 pCHF3 中含有
Spe 和 Kan 抗性基因 ， 其中 Spe 只在农杆菌中表
达，转化后只有 Kan 基因随同目的基因进入植物细
胞中表达，因此在进行转化体的筛选过程中 Kan 将
起到重要作用。但是 Kan 对转化细胞筛选的同时也
抑制了外植体的分化。 当 Kan 浓度太高时，会对未
转化细胞产生毒害作用，细胞将快速死亡 ，而死亡
或将要死亡的细胞对邻近的细胞将会产生抑制作
用，不利于转化细胞的生长 [17]。 段晓昱等 [18]的试验
结果表明，Kan 对向日葵茎尖、子叶、胚轴不同部位
转化外植体的筛选适宜浓度为 25~30 mg/L。 胡文
冉 [19]确定了筛选油葵子叶转化体的适宜 Kan 浓度
为 40 mg/L。 徐培洲 [20]在分化培养基中加 2 mg/L 的
Kan，有不定芽分化迹象后再加工作浓度为 8 mg/L
的 Kan，可提高转化效率 ，利用这种方法获得 6 株
转基因阳性植株。 有关抗生素适宜浓度的筛选，试
验证明浓度之间的差异没有达到显著水平。由于时
间的关系以及鉴于本试验的受体材料向日葵属于
难再生植物 ，因而本试验中使用了 25 mg/L 的 Kan
作为筛选浓度，最终获得 6 株转基因阳性植株。
植物转化过程中，掌握好外植体在农杆菌中的
侵染时间是转化成功的关键之一。 侵染时间太短，
农杆菌不能充分接种到外植体伤口表面，共培养时
无农杆菌生长，不能转化；侵染时间太长，会使外植
体受到农杆菌的毒害缺氧而软腐坏死。侵染时间因
作物不同而不同，一般不超过 30 min[16]。 刘海臣 [21]
通过对下胚轴进行干燥处理来改变细胞的渗透压，
提高抗性芽率，结果表明对下胚轴进行干燥处理 4
h 以后，农杆菌中侵染 10 min，抗性芽率最高。 本试
验也进行过 10、20 和 30 min 侵染时间处理， 结果
表明侵染 30 min 转化率最高， 这是因为在切取外
植体的过程中叶盘失水导致细胞渗透压改变，所以
通过长时间的侵染有利于叶盘充分吸取菌液，从而
促进叶盘的转化。
转化芽成苗难已被众多研究者所证实，植株矮
小 [22]、提早开花 [23，24]、玻璃化 [23]、分枝多 [25，26]或出现多
头 [27]现象，特别是早花和玻璃化严重地抑制着再生
芽生根，进而影响转化芽的生长、移栽及后续研究。
Everett 等 [2]在试验中共获得 17 例转基因植株，每个
植株皆表现为矮化和早花，导致产生小的花头和花
粉败育。 Schrammeijer 等 [28]首先以茎尖为外植体建
立向日葵的遗传转化系统， 但遗传转化效率极低，
侵染 1 500 个为植体仅获得 2 个转化芽，但都未生
根 ；通过嫁接获得 2 个嵌合体植株，其中 1 株由于
早花未获得果实，另 1 株正常结实，但是 F1 代失去
GUS 活性。所有这些问题都已成为向日葵遗传转化
的最大障碍，有待进一步解决。
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1~5.75-33B 转化芽；CK+.阳性对照；CK-.阴性对照
图 5 75-33B 抗性芽 PCR-Southern 杂交检测
1~6.Ht80-97 转化芽；CK+.阳性对照；CK-.阴性对照
图 6 Ht80-97 抗性芽 PCR-Southern 杂交检测
1 2 3 4 5 CK+ CK -
1 2 3 4 5 6 CK+ CK -
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