全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·技术与方法· 2008年第4期
收稿日期:2008-01-29
基金项目:国家“863”计划项目资助(2006AA10Z198)(2007AA10Z170)
作者简介:刘长青(1978-)男,博士生,主要从事分子细胞生物学研究工作
通讯作者:关伟军(1966-)男,教授,博士生导师;研究方向:动物细胞分子生物学;电话:010-62815992,E-mail:wjguan86@iascaas.net.cn;
马月辉(1964-)男,研究员,博士生导师;研究方向:动物遗传资源保护;电话:010-62813463,E-mail:yuehui_ma@263.net
基因组文库是用重组 DNA技术将某种生物细
胞的核 DNA的全部片段随机地连接到基因载体
上,再转移至适当的宿主细胞中,通过细胞增殖而
形成的各个片段的无性繁殖系的总集。其目的在于
便于纯化、贮存和广泛深入的分子生物学研究。构
建重要动物品种基因组文库可以使物种的全部基
细菌人工染色体基因组文库构建关键技术研究
刘长青 1,2 吴宏梅 1 包阿东 1,3 陆涛峰 1 刘帅 1,3 张洪海 4
唐学玺 1 关伟军1 马月辉 1
(1中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京 100094;2中国海洋大学海洋生命学院,青岛 266003;
3内蒙古农业大学动物科学与医学学院,呼和浩特 010018;4曲阜师范大学研究生处,曲阜 273165)
摘 要: 基因组文库是进行分子克隆和基因结构与功能研究的基础,完整覆盖的基因组文库的构建,使基因组任
何DNA片段的筛选和获得成为可能。细菌人工染色体(BacterialArtificialChromosome,BAC)与其它载体系统相比具有
转化效率高、嵌合体少、插入片段易回收,高覆盖率、稳定性强,并且具有易分离和操作等特性等优点而被广泛应用。作为
物种保护策略的重要部分,构建我国濒危动植物品种基因组BAC文库,对于其遗传资源的保护和研究具有非常重要的作
用。在查阅大量国内外相关资料的基础上,就BAC基因组文库构建过程中载体的制备、高分子量 DNA的制备、大片段
DNA的回收、连接与电击转化、基因组BAC文库质量鉴定等几个重点、难点问题进行了详细的论述和分析,对于构建高
分子量插入片段、高覆盖率和稳定性的基因组文库提供理论基础与技术支撑。
关键词: 细菌人工染色体 基因组文库构建 质粒纯化 高分子量DNA
DiscussofSeveralProblemsinBacterialArtificial
ChromosomeLibraryConstruction
LiuChangqing1,2 WuHongmei1 BaoAdong1,3 LuTaofeng1 LiuShuai1,3
ZhangHonghai4 TangXuexi1 GuanWeijun1 MaYuehui1
(1InstituteofBeijingAnimalScienceandveterinary,CAAS,Beijing100094;2DivisionofLifeSciencesandTechnology,
OceanUniversityofChina,Qingdao266003;3ColegeAnimalScienceandVeterinary,InnerMongoliaAgricultural,Huhhot
010018;4ColegeofLifeScience,QufuNormalUniversity,Qufu273165)
Abstract: Theconstructionofagenomiclibraryisesentialtoresearchongenomestructureandfunction.A
comprehensivegenomiclibrarymakesitposibletoscreenandisolateanygenomicDNA fragmentsfrom it.Artificial
bacterialchromosomecanholdlargesegmentDNA,whichhavehighercoverageratioandstabilitythanothervectorsin
theconstructionofgenomelibrary.Itisalsoeasytoseparateandmanipulate.Someproblemsoftheconstructionof
genome library aboutpreparation ofBAC vector,isolation ofhigh molecularweightnuclearDNA,isolation of
size-selectedDNAfrom agarose,morecoverageratioandstabilitywerediscused,thusbeingabletosupplyabasisfor
thegenomelibraryoflarge-sizeinsert,morecoverageandstability.
Keywords: Bacterialartificialchromosome Genomiclibrary Plasmidpurification HMW nuclearDNA
2008年第4期
因信息能够得到长期而有效的保存,是今后 10年
内实现高层次、立体式保护生物多样性及基因资源
的最佳途径之一。在各种基因组 DNA大片段文库
中,细菌人工染色体文库以其插入片段大、容易回
收、拷贝数低、遗传性能稳定、嵌合体少、转化效率
高、操作简便且可对克隆在 BAC的 DNA进行直接
测序等显著优势而被人们广泛利用[1]。基因组 BAC
文库经历了 10多年的发展,技术方法也日趋完善,
目前,已有人类[2]、猪[3,4]、马[5]、牛[6]、绵羊[7]、山羊[8]、
狗[9]和鸡[10]等动物的基因组 BAC基因组文库都已
被构建或正在构建中。这些文库的构建,为基因组
学及后基因组学的研究提供了一个强有力的技术
平台和资源。
构建基因文库时,一个最重要的指标就是它能
在多大程度上代表起始材料,即它是否能覆盖所有
原初序列。如果某些序列,如缺少限制性酶切位点
的重复序列未被克隆,这样的文库就不具代表性。
同样如果文库中未能含有足量的克隆,则极有可能
会丢失某些基因。文库构建过程所涉及的步骤较
多,难度较大,其中的任何一处环节出现错误都会
导致整个实验的失败,而且文库建成后采用行之有
效的鉴定方法来验证其质量也是至关重要的。在查
阅大量国内外相关资料的基础上,就 BAC基因组
文库构建过程中载体的制备、高分子量 DNA的制
备、大片段 DNA的回收、连接与电击转化、克隆的
挑取、文库质量的鉴定等几个重点、难点问题进行
了详细的论述和分析,尤其着重介绍近几年基因组
BAC文库构建方法上的一些关键技术的改进,对于
构建高分子量插入片段、高覆盖率和稳定性的基因
组文库提供理论基础与技术支撑。
1 BAC载体制备技术
1.1 BAC载体的制备是构建文库的一个关键
载体制备的好坏直接关系到文库中空白载体
的比例和文库的质量。为了减少或避免空白载体,
一种措施是对载体进行酶切的同时,进行脱磷处
理。经脱磷后的载体先做自连反应,由于未脱磷的
载体自连后与线性载体片段泳动速度存在差异,通
过较长时间的电泳后,回收载体片段,从而可提高
载体的质量和纯度。目前抽提纯化 BAC载体的主
要有两种,碱裂解释放质粒后[11]CsCl-EB密度梯度离
心法[12]与使用 DNA纯化试剂盒(QIAGEN,Germany)
纯化质粒[13]。Qiagenlarge-constructkit是专门设计用
来抽提纯化 BAC载体的一种试剂盒,对于 BAC载
体提取的质量和纯度较好[14]。实验表明 CsCl密度
梯度离心纯化 BAC质粒构建的文库质量好于 DNA
纯化试剂盒纯化质粒,主要表现在:(1)插入片段
大;(2)插入片段的整齐度较好,80%以上集中在
100kb左右;(3)空载率较低。但是该方法最突出的
缺点是耗时、需昂贵的高速离心机设备,另外由于
使用了 EB作为指示剂,增加了实验的危险性。用
DNA纯化试剂盒纯化质粒载体的优点是快速、方
便、不需昂贵设备,效果较好。
1.2 应设计一系列试验以确定载体完全消化所
需的最小酶量及最短酶作用时间
酶用量过大可能会导致非特异性酶切,结果产
生很高比例的假阳性,使整个文库的空载率过高[15]。
1.3 对酶切后的载体脱磷也很必要
脱磷不足载体易自连,空载率升高;反之,会损
伤载体,使之与外源 DNA的连接能力下降,结果导
致白斑比例很高,空载率也相应提高[16,17]。载体脱
磷之后应立即使用,以减少载体的自身降解,提高
连接效率。载体脱磷效果检测分别用 T4DNA连接
酶和 T4DNA连接酶及 T4多核苷酸激酶对所制备
的载体于 16℃自连过夜。电转化 DH10BTM感受态细
胞,在 SOC培养基中,于 37℃,200r/min条件下复
苏 1h,适量涂布于带有氯霉素、IPTG和 X-gal(X/I/
C)的固体 LB培养基表面,于 37℃,培养 24～36h,
观察菌落生长情况。
凝胶回收的线性载体 DNA分别在仅含 T4
DNA连接酶和含 T4DNA连接酶及 T4多核苷酸激
酶作用下的连接产物经转化后涂布于 X/I/C固体
LB培养基表面进行培养。结果表明无 T4多核苷酸
激酶存在时,转化产物经培养只能产生极少量的单
菌落。说明载体脱磷效果比较好,仅有极少数的载
体能够发生自连;而在 T4多核苷酸激酶作用下,转
化产物则能产生大量的单菌落。间接说明了载体制
备过程中脱磷效果很好,只有在外源磷存在时载体
才能够发生自连形成单菌落[18]。
2 高分子量 DNA的制备技术
高分子量 DNA的制备是构建文库的一个难
刘长青等:细菌人工染色体基因组文库构建关键技术研究 67
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第4期
点。关键一步是将细胞(或者植物细胞是细胞核)的
质量和浓度、琼脂糖凝胶的浓度等因素。用碾磨处
理动物组织可减少对基因组 DNA的损害。为防止
细胞核的破裂,组织不能碾磨过细,细胞的悬浮要
动作轻柔。包埋在琼脂糖凝胶栓里的细胞数目大约
为(5～7)×107ml-1,包埋的细胞浓度会直接影响 DNA
的消化和连接。细胞浓度太大,导致 DNA很难被酶
切;反之,会使连接效率降低。包埋细胞的琼脂糖浓
度也很重要,琼脂糖浓度太高,会影响酶切效果,甚
至无法酶切;反之,凝胶栓很难成型,不易操作。一
般把细胞悬液与 1%的琼脂糖凝胶等体积混合,酶
切的效果很好。为了使琼脂糖酶能充分扩散到凝胶
栓内,一方面需要把酶和凝胶栓在冰上共同孵育
1h,另一方面需增加酶和凝胶栓接触的表面积。试
验时可根据情况,将一块凝胶栓分成多份,各取 1/3
进行部分酶切条件的优化,发现明显比整块凝胶栓
酶切效果好,而且节约了每次做试验的样品,使样
品能最大限度用于 DNA的回收。
3 大片段 DNA的回收技术
大片段 DNA一般采用琼脂糖酶消化法或电透
析法回收。Strong等[19]报道,对于高分子量 DNA的
回收,采用电透析法[8]得到的 DNA比用琼脂糖酶处
理得到的更完整,尤其当 DNA片段非常大时,差异
更显著。电透析法回收 DNA使用普通琼脂糖,而琼
脂糖酶回收 DNA必须使用低熔点琼脂糖。电透析
法还可避免凝胶于 65℃熔化时对 DNA分子的损
伤。所以,电透析法对于大规模文库的构建更经济
有效。以往脉冲电泳用 TAE缓冲液分离部分消化
的 DNA,因为 TBE中的硼酸根离子会抑制随后的
连接反应[18]。但 0.5×TBE缓冲能力最强,能得到理
想的分辨率,可在回收 DNA后用 0.5×TE溶液置换
0.5×TBE除去硼酸根离子。DNA的回收有一次脉冲
电泳选择和二次脉冲电泳选择。一次脉冲电泳选
择,可减少 DNA的损失,但会产生小片段与大片段
的共迁移,回收片段中含有相当比例的小片段,由
于载体有优先连接较小片段的趋势,会与载体优先
连接,从而使整个文库的克隆偏小[20]。二次脉冲电
泳选择能除去一部分陷在大片段中的小片段,使回
收的 DNA片段大小比较均匀,但 DNA的损失很
大。而且片段太大又会降低连接效率,转化效率较
一次选择降低十至几十倍。在第一次分离时切下位
于 100~200kb和 200~300kb的片段分别进行第二
次分离,经二次分离后再分别回收大片段。在进行
第二次脉冲电泳分离时,脉冲电泳调节成 10s,在此
条件下,分离的片段主要集中于 140~180kb,因此
最后构建的文库插入片段大部分位于这一范围。据
统计,第二次选择之后的大片段的含量仅有一次电
泳后的 1/3~1/6。为提供大片段的含量、同时又尽可
能的去除小片段,Kazutoyo等(1998)采用 3步选择
法,大大提高了大片段的含量[21]。
4 载体与高分子量 DNA连接技术
最高的转化效率与精确的连接条件相关,因此
各种参数,如连接时间、载体和插入片段浓度、
T4DNA连接酶浓度等条件的改变都会对转化效率
产生巨大影响,均被优化以获得最佳的转化效率[19]。
不同片段大小对连接有较大的影响,随目标片段增
大,连接效率呈下降的趋势。影响连接的因素还有
酶、缓冲液、无菌水的 pH值等[22]。为避免电激转化
过程中弧光放电的发生,将连接混合物在低盐缓冲
液(0.5×TE或者 Tris-cl)中悬滴透析除去连接体系
的各种离子,但这样会导致连接体系体积增大,浓
度降低,重组子的数量减少,所以有必要进一步浓
缩。在做连接反应之前,最好不要试图通过透析法
来增加插入片段 DNA的浓度,否则,会大大降低连
接和转化效率。然而 Kazutoyo等[23]的试验证明,运
用 30%的 PEG8000浓缩连接体系的连接物 DNA
后,可得到较高的转化效率。根据每次连接体系的
不同,连接体系在冰上浓缩的时间也需要摸索,以
获得达到最适 DNA浓度的时间。连接体系浓缩后
较浓缩前更容易降解和聚集,所以浓缩后应尽快转
化。连接酶的存在也会影响电激转化效率,将连接
酶在 65℃灭活 10min,能提高转化效率。
5 电激转化技术
电激转化的效率,即每次转化产生的重组子数
量,是对构建文库的每个环节进行优化的最终目
标。在电激转化过程中,温度、电穿孔参数(电压梯
度、电阻)、宿主细胞(遗传背景、生长条件)、脉冲后
处理等因素会影响电激转化效率。低温操作有利于
提高转化效率;低电场强度、低电阻能提高大片段
DNA的转化效率。随着 DNA片段尺度的增加,电
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激效率也随之降低。DH10B是重组缺陷型的 BAC
宿主菌,电激后应立即转移到 SOC培养液中,时间
过长会导致转化效率大大降低[24]。
6 BAC文库的鉴定
基因组 BAC文库构建完成后,对文库的质量
进行评价和鉴定至关重要。而评价一个基因组
BAC文库质量的标准有:文库中克隆的数量、插入
片段平均大小、对基因组的覆盖率、空载率、细胞器
DNA的含量及假阳性克隆的含量。基因组文库的
覆盖率由于不同的实验需要也有所差异,如用于克隆
全长目的基因和测序,则对文库的覆盖率要求高 [25];
而如果克隆着丝粒等的重复序列,那基因组文库的
覆盖率则可大大缩小;此外,核基因组文库 DNA要
尽量杜绝混杂细胞器 DNA的污染,因为细胞器
DNA不仅会降低实际库容量,还可能会误导染色
体步查走向错误方向,采用脉冲电泳纯化法制备高
纯度大分子量 DNA,可从根本上避免细胞器 DNA
的污染。
文库的质量决定了文库作用的大小。一个好的
BAC文库应该具有大的插入片段、高的基因组覆盖
率、小的细胞质 DNA的污染及小的空载率[1]。
7 结论
BAC能容纳大片段 DNA,而且具有遗传特性
稳定、易于操作等优点。就 BAC文库构建过程中几
个关键环节进行了探讨和分析。在载体的制备中,
质粒的纯化是一个关键问题。张洪斌等利用 CsCl
密度梯度离心法纯化质粒的方法制备了多种载体
并成功的应用到植物 BAC文库的构建当中[25]。随
着对 BAC研究的深入,BAC必将在后基因组时代
基因组学的研究中发挥更重要的作用,必将会在基
因功能鉴定及在复杂系统里研究基因的表达与调
控,生物物种改造,基因治疗等领域具有更广阔的
应用前景[26]。
构建基因文库时,一个最重要的指标就是它能
在多大程度上代表起始材料,即它是否能覆盖所有
原初序列。如果某些序列,如缺少限制性酶切位点
的重复序列未被克隆,这样的文库就不具代表性。
同样如果文库中未能含有足量的克隆,则极有可能
会丢失某些基因[27]。因此,文库建成后采用行之有
效的鉴定方法来验证其质量也是至关重要的。
BAC文库在某些动植物和人类基因组及后基因组
计划中发挥了巨大的作用。随着基因组研究的深入
和方法的简化,除遗传模式物种和经济重要物种
外,更多的动植物要进入到基因组研究中,将有更
多物种构建 BAC文库。同时,利用 BAC文库容量
大的特点,进行基因表达调控、基因互作和目的基
因定位转化等后基因组时代的工作是未来 BAC文
库利用的发展方向。不容置疑,随着越来越多 BAC
文库的构建,以及 BAC应用方法和范围的创新,
BAC文库必将为基因组研究带来更大的飞跃[28]。
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