全 文 ：收稿日期:2002-10-30
作者简介:陈凡国(1970-),男 ,讲师 ,发育生物学博士 ,现在从事小麦品质相关基因克隆工作.
＊通讯作者
　文章编号:1671-9352(2003)04-0109-04
野生一粒小麦着丝粒 RCS1相关序列的克隆鉴定
陈凡国　封德顺　夏光敏＊
(山东大学　生命科学学院 ,山东　济南　250100)
摘要:用水稻着丝粒重复序列 RCS1为探针 , 与 3072个克隆进行菌落杂交 , 得到了 32 个阳性克隆 , 用 RCS1 与拟斯
卑尔脱山羊草着丝粒重复序列 Tcs250 为探针进一步筛选 ,在 32 个 RCS1相关的阳性克隆中任选 10 个克隆进行点
杂交 , 分别有 6个和 5 个阳性克隆.为了克隆 RCS1 相关片段 ,依据 RCS1的序列设计了三对引物 , 将引物 3从上述
阳性克隆中扩增的一个 543 bp的片段克隆测序 ,发现与水稻 RCS1 部分片段达到约 83%的同源 , 与大麦的反转座
子(Ty3 gypsy)部分序列同源性达到了 92%, 与节节麦中着丝粒的整合酶基因部分序列同源性达到了 96%,命名为
TBRCS1.TBRCS1可能是野生一粒小麦着丝粒区的组成部分.
关键词:野生一粒小麦;细菌人工染色体;着丝粒序列
中图分类号:Q943　　　文献标识码:A
Isolation and characterization of centromere RCS1 homology sequence
from Triticum boeoticum
CHEN Fan-guo , FEN De-shun &XIA Guang-min＊
(School of Life science , Shandong University , Jinan shandong 250100)
Abstract:In order to study the structure and clone the sequence of the centromere of T.boeoticum , 3072 clones of the BAC library
were screened by RCS1 as probes.Thirty-two positive clones were obtained.Then ten positive clones picked at random from the
thirty-two positive clones wre probed by RCS1 and Tcs250 respectively again.Six and five clones showed unambiguous positive hy-
bridization respectively.Then three pairs of primers to RCS1 were designed using DNA star software.PCR amplification was carried
out using positive BAC clones as templates by the three pairs of primers respectively.We obtained a 600 bp(named TBRCS1)se-
quence by primer 3.Sequencing analysis revealed that TBRCS1 had 83%homology to RCS1 in rice and 92% to a Ty3 gypsy class
of retrotransposon sequence in barley and 96% to a integrase-like gene reported in Aegilops tauschii It indicated that TBRCS1 was
part of centromere of T.boeoticum.
Keyword:Triticum boeoticum ;BAC;Centromeric sequence
　　不同植物基因组大小差别甚大.研究表明不同
物种基因组大小的差异主要在于一些重复序列的含
量上 ,基因组中重复序列的含量与其 DNA的含量是
呈正相关的 ,拟南芥基因组中重复序列的含量只有
14%[ 1] , 而小麦基因组中重复序列所占的比例高达
85%左右[ 2] ,由此可见 ,若要深刻地认识植物基因
组的组成和基因的表达与调控 ,则必须研究基因组
重复序列.
着丝粒是染色体的重要结构 ,主要是由重复序
列组成.在高等生物的着丝粒区含有大的卫星 DNA
和重复序列 ,在植物中 ,尽管通过许多方法鉴定 、分
离出一些着丝粒区的重复序列 , 但对着丝粒的研究
　第 38 卷　第 4期
　Vol.38　No.4 　 　 　 　 　
山　东　大　学　学　报　(理　学　版)
JOURNAL OF SHANDONG UNIVERSITY
　 　 　 　 　 2003年 10 月　
Oct.2003　
仍然只是起步而已[ 3] .因此 ,本文试图在所建的 BAC
文库的基础上 ,分离野生一粒小麦着丝粒区的重复
序列片段 ,以期对着丝粒的结构有所了解 ,进而为研
究基因组间的进化关系奠定一定的基础.
1　材料与方法
1.1　材料　BAC 文库由作者在中国农业科学院品
资所构建[ 4] , pRCS1 由蒋继明博士提供;pTcs250由
程治军博士提供.
1.2　方法
1.2.1　着丝粒 RCS1相关阳性克隆的筛选
(1)用 hand-held replicator 将单克隆文库中
TBAA001.2-TBAA008.2及混合池文库中 TBAAP001.
2-TBAAP004.2 的 384 孔板上的菌转移到相应的尼
龙膜上;
(2)培养 、转膜的工作按照文献[ 5]的方法进行;
(3)碱裂解的方法(同文献[ 5])制备 RCS1及
Tcs250;
(4)随机引物标记法标记探针 RCS1 ,杂交方法
与标记方法同文献[ 5] .
1.2.2　Tcs250为探针进一步的点杂交
(1)选 10个 RCS1阳性的 BAC克隆进行液体培
养 ,按照文献[ 5]方法提取质粒 ,用 NotI 酶切后投入
100 ℃的水中 7min ,后立即投入冰中 ,分别调浓度为
5 ng uL 、10 ng uL、20 ng uL 、30 ng uL ,分别直接点于膜
上 ,pECBAC1 、RCS1 为对照 ,之后保鲜膜包好 ,储于
-20 ℃的冰箱中备用;
(2)随机引物标记法标记探针 RCS1 ,Tcs250 ,标
记及杂交方法同文献[ 5] .
1.2.3　着丝粒重复序列 RCS1相关序列的克隆
RCS1引物的设计
利用 NCBI中的 Genbank提供的 RCS1全序列 ,
用DNA Star 设计了三对引物:
引物 1 ,上链:5 -TTTGGCCACAGATGCGAAG
AGATG-3
下链:5 -AAGTCGTGGCGGCCGTCAG
AAGTT-3
引物 2 ,上链:TGTGCCCATTTCAGATTGTGT
AT-3
下链:5 -AAGTCGTGGCGGCCGTCAG
AAGTT-3
引物 3 ,上链:5 -TTTTGGCCACAGATGCGA
AGAGA-3
下链:5 -GAGCACGAGGCAACAAACC
ATACA-3
1.2.4　BAC-PCR扩增 RCS1相关序列及克隆
(1)梯度 PCR 扩增体系:在 25 uL 的体系中 ,
Taqase (1 U)1 uL , 10 ×buffer(Mg2+)2.5 uL , Prime
1(5 uM)和Prime2(5 uM)各1 uL ,BAC DNA(10 ng uL)
1 uL ,d NTP(25mM)0.2 uL ,dd water 18.8 uL.
(2)梯度PCR的程序:
1　　　　　　　　　　94 ℃　4min
2 94 ℃　30 sec
3 45 ℃-70 ℃　60 sec
4 72 ℃　90 sec
5 Go to 2 , 30 cycles
6 72 ℃　10 min
7 10 ℃　12 h
8 End
(3)PCR完毕后电泳 ,用 1×TAE配置 1.4%的
琼脂糖凝胶 ,70V ,50 min.
(4)紫外灯下准确切下扩增片段 ,作好标记 ,用
Wizard Purification Kit(Promega)纯化回收 ,用于此后
的克隆工作.
(5)连接体系 10 uL(T-easy Kit , Promega):T-easy
vector 1 uL , 2 ×buffer 4 uL , PCR DNA 4 uL , T-easy
ligase (3U uL)1 uL.16 ℃,12 h or 4 ℃,24 h.
(6)转化及涂板培养等工作同文献[ 4] .
RCS1相关片段的测序及分析
博亚公司(上海)测序 ,在 ebi上进行序列比较.
2　结果与分析
2.1　着丝粒重复序列 RCS1及 Tcs250相关克隆的
筛选
2.1.1　RCS1及 Tcs250的制备
用 Hind Ⅲ 和 EcoR Ⅰ双酶切 RCS1及 Tcs250质
粒后 ,电泳回收 RCS1和 Tcs250片段 ,图 1A(全部为
相同插入的克隆)箭头所指为 RCS1 片段 ,长度为
877 bp;图 1B(全部为相同插入的克隆)箭头所指为
Tcs250片段 ,长度约 250 bp.
　110　 山　东　大　学　学　报　(理　学　版) 第 38卷　
图 1　电泳回收 Hind Ⅲ 和 EcoR Ⅰ双酶切 RCS1 及 Tcs250片段
A , RCS1 片段 , B , Tcs250 片段
Fig.1　Recovery of double enzymed RCS1 and Tcs250 by HindⅢ and EcoRⅠ by electrophoresis
2.1.2　RCS1阳性克隆的筛选
以着丝粒重复序列 RCS1为探针进行菌落原位
杂交 ,结果在 TBAA001.2-TBAA008.2中一共筛得 32
个阳性克隆 ,如图 2;同时 TBAAP001.2-TBAAP004.2
经筛选发现 3 5的被检混合池均有杂交信号(数据
未显示).
2.1.3　以 RCS1及 Tcs250为探针进一步的点杂交
RCS1和 Tcs250无同源性 ,对照 12均为 RCS1.
任意选取 10个 RCS1相关阳性克隆通过提取质粒后
点杂交的方式进行鉴定.如图 3所示 ,以载体和鲑精
DNA作封阻 ,以 RCS1 、Tcs250 为探针分别进行梯度
点杂交 ,DNA 的浓度分别为 5ng ,10ng , 20ng , 30ng ,以
载体 DNA和 RCS1为对照 ,结果发现 ,以 RCS1为探
针进行筛选 ,只有 1 、5 、6 、8 、9 、10 出现杂交信号 ,而
2 、3 、4 、7没有杂交信号 ,分析在初次菌落杂交存在
偏差;以Tcs250为探针时 , 1 、6 、8 、9 、10在杂交中出
现强烈的阳性信号 ,说明 Tcs250可能是野生一粒着
丝粒的组成部分.另外 ,阳性克隆信号强度的差异可
能是由于重复序列的多少造成的.克隆 5 、8 ,同时含
有两种重复序列 ,因此将作为今后工作的重点来研
究野生一粒小麦中的 RCS1和 Tcs250相关片段重复
序列全长及它们的进化关系.
图 2　RCS1相关阳性克隆的筛选
Fig.2　Screening of clones containing sequences homology to RCS1
图 3　阳性克隆的 DNA点杂交
Fig.3 　Dot hybridization of the candidate clones with RCS1 ,
Tcs250
A , 30 ng;B , 20 ng;C , 10 ng;D , 5 ng;
1-10 , BAC clones;11 , vector , 12 , RCS1
2.1.4　水稻着丝粒 RCS1相关序列在野生一粒小麦
中的克隆
利用 DNA star 和已知的水稻着丝粒 RCS1序列
(NCBI)设计了三对引物 ,以点杂交验证的 RCS1 相
关阳性 BAC克隆的质粒 DNA 为模板 ,用上述三对
引物分别进行梯度 PCR ,结果发现引物 3可以进行
特异的扩增 ,并发现最适退火温度是 53 ℃.于是在
此温度下进行扩增 ,重复 3次均出现同样的结果如
图 4 ,得到的片段暂时命名为 TBRCS1.递交 genbank ,
获得序列号为 AF497780.
　　将引物 3扩增片段克隆测序并在 ebi上进行序
列比较 ,发现与水稻 RCS1有 83%的同源性 ,A+T
的含量为 62%.与大麦的反转座子(Ty3 gypsy)部分
序列同源性达到了 92%,与节节麦中着丝粒的整合
酶基因部分序列同源性达到了 96%, 命名为
TBRCS1.TBRCS1可能是野生一粒小麦着丝粒区的
组成部分.
　第 4期 陈凡国 , 等:野生一粒小麦着丝粒 RCS1 相关序列的克隆鉴定 111　 　
图 4　利用 PCR 从野生一粒小麦 BAC 克隆中扩增 RCS1 相
关片段
1 , 2 , 3 为引物 3 三次扩增结果 , 4 为引物 1扩增的结果 , 5 为
引物 2扩增的结果 6 为标准分子量.
Fig.4　Amplified correlative segment of RCS1 from BAC clones of
Triticum boeoticum via PCR
1 , 2 , 3 , amplified with primer3;4 amplified with primer 1;5 ampli-
fied with primer 2;6 marker.
3　讨论
着丝粒是染色体一个重要的结构区域 ,与真核
生物的有丝分裂和减数分裂密切相关.因此 ,最近多
人致力于着丝粒结构和功能的研究并取得了一定的
进展.
与哺乳动物 、酵母相比 ,高等植物着丝粒的研究
才刚刚开始[ 3] ,拟南芥的着丝粒处最为丰富的重复
序列为Atcon ,约占总基因组的 2 ～ 5%[ 6] ;拟南芥的
全序列的测定为着丝粒的研究提供了契机 ,并使着
丝粒的研究深入到分子水平 ,发现 5条染色体的着
丝粒长度均在 4Mb以上 ,而拟南芥的基因组总量仅
125Mb
[ 7] ;番茄的基因组为 950Mb[ 8] ,研究发现第九
染色体着丝粒的长度至少为6Mb[ 9] ;Miller et al发现
着丝粒处的重复序列 Sau3A10家族占高粱基因组的
1.6 ～ 1.9%[ 10] , 而高粱的基因组仅 772 Mb[ 8] ,用
pSau3A10 作探针筛选高粱的 BAC 文库[ 11] , 约有
5.4%的 BAC 克隆被筛选出来 , 另外一个探针
pSau3A9筛选的阳性克隆为 0.6%;Dong et al等用高
粱的着丝粒序列 pSau3A9筛选水稻(Oryza sativa ssp.
indica)BAC文库 ,在 11 000克隆中筛选出确定无疑
的阳性克隆22个 ,并从其中之一克隆分离出 7个着
丝粒重复序列家族[ 12] ;本文利用蒋继明博士提供的
水稻着丝粒重复序列家族 RCS1 作探针在 1 532个
野生一粒小麦 BAC克隆中初步筛选出 32个阳性克
隆 ,并从 10个克隆中得到确定的 6个 RCS1相关克
隆 ,以 RCS1序列设计引物 ,用得到的 RCS1相关克
隆中的 BAC1为模板进行 PCR扩增实验 ,得到了扩
增片段暂命名为 TBRCS1 ,与 RCS1有 83%以上的同
源 ,从侧面证明筛选的克隆的正确性.
从其占总克隆约 1%的比例可以看出 ,该序列
在野生一粒小麦的着丝粒中占有较大的比重.通过
序列比较发现和 Ty3 gypsy类反转座子同源性很高.
致谢:感谢中国农业科学院张学勇恩师在论文完成中给予的帮助.
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(编辑:于善清)
　112　 山　东　大　学　学　报　(理　学　版) 第 38卷