全 文 ：基因组细菌人工染色体文库( BAC)的构建及应用
李海权 刁现民*
(国家谷子改良中心河北农林科学院谷子研究所,石家庄 050031)
摘 要: 细菌人工染色体( BAC)是一种承载 DNA大片段的克隆载体系统, 用于人、动物和植物基因组文库构
建。BAC具有插入片断大、嵌合率低、遗传稳定性好、易于操作等优点。BAC文库的构建是基因组较大的真核生物
基因组学研究的重要基础,可用于真核生物重要基因及全基因组物理作图、重要性状基因的图位克隆、基因结构及
功能分析。本文主要综述了细菌人工染色体的构建与其鉴定, 及其在物理图谱构建、图位克隆、转基因技术等研究
上的应用。
关键词: 基因组 细菌人工染色体 文库构建
Construction and Application of Genomics Bacterial
Artificial Chromosome( BAC) Library
Li Haiquan Diao Xianmin*
(National Mill et Improvement Center, Institute of Millet Crops, Hebei Academy of Agri cultural
and Forestry Sci ences , Shij iazhuang 050031)
Abstract : Bacterial artificial chromosome ( BAC) is a kind of vector system used to construct large fragment insert libraries
of genome DNA in human, animals and plants. Bacterial artificial chromosome has several notable advantages, such as inserting
large fragments, maintaining the stability of inserted DNA in E. coli, producing few chrisms, recovering inserted DNA from E.
coli cell and easy in library construction. Bacterial artificial chromosome libraries have some important purposes in the research of
eukaryote genomes. They have been used for physical mapping of eukaryote genomes, mapbased cloning of agronomically impor
tant trait genes and gene structure and function study . This paper presents a brief introduction of the development of BAC, and the
process of construction, identification and application of BAC libraries.
Key words: Genomics Bacterial artificial chromosome Library construction
随着对各种生物在 DNA 分子水平上研究的深
入,尤其是人类和水稻基因组计划的实施,构建基因
组文库己成为遗传研究实验室的常规策略。它对于
分离特定的基因片段,研究基因的表达调控、基因组
的组织结构,以及人类和动植物的基因组工程等都
有极其重要的作用。构建基因组文库的载体很多,
大致可分为噬菌体系列(如早期的 噬菌体、cosmid、
P1噬菌体和 fosmid等)和人工染色体系列(如 YAC、
BAC和 PAC等)。前者的克隆能力相对较小(噬菌
体24 kb左右, cosmid 35~ 45 kb) , 许多真核生物的
基因, 上游启动子序列较长,又含有大而多的内元,
如此庞大而复杂的结构, 难以作为单一片段克隆于
这些载体中。因此, 人们开始构建一系列的人工染
色体, 如酵母人工染色体( yeast artif icial chromosome,
YAC )、细菌人工染色体 ( bacterial artificial chromo
some, BAC ) ,P1人工染色体( PIderived artificial chro
mosome, PAC)和哺乳动物人工染色体( mammalian ar
t ificial chromosome,MAC)等,它们的普遍特点是插入
片段较大,一般在 100 kb 以上。这些具有较大外源
片段承受能力的人工染色体对于真核生物基因组文
库构建无疑是极为有利的,且其在与外源片段连接
后无需进行包装。本文主要对以人工染色体为载体
收稿日期: 20041112
* 通讯作者: xmdiao@yahoo. com. cn
生物技术通报
综述与专论 BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2005年第 1期
构建的基因组文库, 即 BAC文库的构建及其应用进
行综述。
1 细菌人工染色体文库 ( BAC) 的构建及其
发展
DNA文库是基因组研究的基础, 真核生物的遗
传研究往往需要对大分子 DNA, 包括基因簇 ( gene
cluster)进行克隆, 而已有的系统逐渐显现了它们的
一些固有缺陷: 质粒系统容量小( < 15 kb) , 只适用
于一般基因的克隆, 很少用于 DNA 文库( DNA li
brary)的构建。粘粒容量虽有所增大( < 45 kb) , 但
对于一些较大的基因簇的研究仍然无能为力。YAC
系统容量很大(可至数 Mb) , 但由于其易于发生重
组, 稳定性差及制备工艺的繁琐局限了它的使用。
因此建立一种容量大, 能够稳定遗传且易于操作的
载体系统就成了分子生物学研究的重要内容。20世
纪90年代发展起来的细菌人工染色体( bacterial arti
ficial chromosome, BAC) ,使人们的愿望成了现实。
BAC构建的基础是 E. coli 及 F 因子。研究表
明, F 因子在 E. coli 中的复制受到严格控制而保持
低拷贝,一般为每细胞单拷贝或两个拷贝, 此外, F
因子具有携带 1Mb插入片段的潜能,这就使得以此
为基础、构建具有大容量克隆能力的 BAC 载体成为
可能。1989年,O Connor 等首次用染色体建造的
方法,利用 F 因子构建载体 pMBO131来克隆大片段
DNA。3年后,以 pMBO131载体为基础, Shizuya等将
T7、SP6启动子序列,含 cosN及 loxP 位点的 噬菌体
和P1噬菌体片段分别引入 pMBO131载体,首次构建
DNA插入片段达 300kb以上的 pBAC108L 载体, 该载
体即使传代 100 代后, 仍可稳定遗传, 尚未检出缺
失,重组及嵌合现象。第一代 BAC 载体的选择标志
基因为氯霉素抗性基因, 为进一步方便克隆的筛选,
许多在常规质粒载体中已成熟使用的选择性标志基
因纷纷被引入第一代 BAC载体。1997年, Mejia 将
半乳糖甘酶 LacZ 基因及抗新霉素 neo 基因插入
pBAC108L 载体,转染人类 fibrosarcoma 细胞系, 在含
Xgal, IPTG的平板上生长 48hr 后, 出现 4. 5% ~ 10
%的蓝色细胞; 同年 Baker 构建了含荧光素酶或绿色
荧光蛋白 GFP 的 BAC 载体, 以此载体克隆 70 ~
170kb的人类基因组 DNA 并转染 HeLa 细胞和成纤
维细胞后, 便于筛选出表达 GFP 的克隆, 随后, 很多
的动物病毒基因组也因此而克隆成功。至此, 能够
快速筛选克隆的第 2代 BAC载体构建完成。自 BAC
用于文库构建以来, 己相继建立了几十种动植物包
括大豆[ 1]、玉米[ 2]、小麦[ 3]、水稻[ 4]、高粱[ 5]、大麦[ 6]、
马铃薯[ 7]、珍珠粟[ 8]、人类[ 9]和牛[ 10]等的基因组文
库。时至今日, 第 2代 BAC载体系统仍被广泛用于
相关实验操作。
2 BAC文库的构建与鉴定
2. 1 BAC文库构建
2. 1. 1 BAC 载体的制备 载体的质量直接关系着
文库中空白载体的比例和文库的质量。载体的纯度
越高, 获得阳性克隆的概率越高, 文库的质量也越
好。为了减少或避免空白载体的比例, 对载体进行
脱磷处理要彻底。但脱磷后的载体于 80 不能长
时间保存, 否则将导致载体迅速降解[ 11]。目前常用
的载体有 pECBAC1、pBeloBAC1等。
2. 1. 2 高分子量 ( HMW)核 DNA 的制备和部分消
化 核 DNA的制备, 一般是在液氮中将组织研磨成
粉末,而且在整个研磨过程中均使组织浸在液氮中。
为了防止核 DNA降解,一般采用两种低熔点琼脂糖
包埋核DNA的方法,一是将核 DNA包埋在低熔点琼
脂糖中形成栓塞( plugs) ,二是将核 DNA 包埋在低熔
点琼脂糖和矿物油混合物中形成微粒( microbead)。
通过比较试验, plugs在制备方法、保护核 DNA、操作
上具有明显优点。然后对核 DNA进行酶切,最终目
的是通过酶切产生大小比较集中的片段, 一般通过
两次脉冲场电泳进行片段选择[ 11]。
2. 1. 3 大片段核 DNA 与载体连接及转化受体感受
态细胞 大片段核 DNA是否能有效连接到载体上
主要取决于插入 DNA片段与载体的比例, 对于不同
生物采用的比例不同,大多数 BAC 文库采用 15~
15(摩尔比) [ 11]。目前,对于转化大肠杆菌而言, 电转
化是使用最普通的一种手段。电转化效率与插人片
段的大小有关, 插人片段越大,转化效率越低;反之,
越高。此外,转化条件也直接影响转化效率、插人片
段大小及假阳性克隆的含量。因此, 在大规模转化
前需进行转化预试验,以选择最佳的转化条件。
2. 1. 4 挑选阳性克隆 可通过 lacZ 的 A 互补所形
成的蓝白菌落筛选阳性克隆。阳性克隆的分检有人
工和全自动分子生物学工作台技术( robotics) 两种。
72005年第 1期 李海权等:基因组细菌人工染色体文库( BAC)的构建及应用
虽然全自动分子生物学工作平台精确度高、操作简
便、快捷, 但由于其仪器设备比较昂贵, 目前国内用
的很少,国内均采用人工方法进行分拣。人工分拣
工作量大、选择性强。
图 1 BAC 文库构建流程图
2. 2 BAC文库的鉴定
一个文库构建完成后,需要对文库进行评价, 评
价一个 BAC 文库质量高低的标准是文库中克隆的
数量、插入片段大小、对基因组的覆盖率、细胞器
DNA的含量及假阳性克隆的含量。
2. 2. 1 BAC文库的筛选 目的是检验构建的 BAC
文库是否具有很好的代表性和实用性。用与目的基
因紧密连锁的单拷贝标记探针筛选 BAC文库。
2. 2. 2 BAC 克隆的鉴定 从文库中随机挑选一定
量的 BAC克隆,提取质粒 DNA, 酶切后,脉冲电泳检
查插入片段的大小。以 Southern杂交来检验 BAC克
隆插入片段是否来源于原材料。检验假阳性克隆,
保证库的质量。
2. 2. 3 BAC克隆的稳定性鉴定 挑选几个较大的
BAC克隆(分子量分别为 140和 250kb) ,分别接种在
培养基上, 连续继代培养后, 分别提取第 0 代和第
100代 BAC克隆的质粒 DNA,酶切后,脉冲电泳检查
BAC克隆中外源 DNA 在继代培养中是否存在和发
生突变。
2. 2. 4 检查 BAC文库是否含有细胞器 DNA的污染
核 DNA文库混杂细胞器 DNA的污染, 不仅会降
低实际库容量,还可能会误导染色体步移走向错误
方向[ 12]。采用脉冲电泳纯化法制备高纯度大分子
量 DNA,进行 BAC文库的构建,可以从根本上避免
细胞器 DNA的污染。同时以线粒体基因为探针与
BAC克隆进行菌落原位杂交, 检验 BAC克隆有无细
8 生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2005年第 1期
胞器 DNA的污染。
2. 2. 5 BAC 末端的分离 无论是进行基因组分析
还是染色体步移, 都需要分离 BAC 克隆左右末端。
分离 BAC克隆末端比较常用的方法包括质粒获救、
反向 PCR和 TAILPCR法。前两种方法都需要酶切
和连接,操作复杂,有时由于在多克隆位点附近没有
相应内切酶的切点, 会无法得到末端序列。最近刘
耀光发展的 TAILPCR技术,利用克隆载体多克隆位
点的附近序列, 合成与其互补的 3个长特异性引物
和3~ 6个随机兼并性引物, 通过 3 个 PCR 扩增反
应,结合两高一低复性温度的高级循环,来达到扩增
特异性克隆末端片段的目的。该技术操作简单, 敏
感度高,适用范围广, 是目前理想的分离 BAC 末端
的方法。有的 BAC分离出多个末端, 可以分别进行
克隆。利用这些末端序列,一方面进行定位, 丰富该
区域的分子标记, 另一方面用来筛选 BAC文库, 以
期建立一个较大的 BAC重叠群。
3 细菌人工染色体的应用
3. 1 基因组物理图谱构建
基因组物理图谱是指一系列 DNA的限制性酶
切片段沿染色体的有序排列形式;它与传统的遗传
图谱的主要区别在于, 它能反映基因组中基因或标
记间的实际距离, 是基因组结构的真实反映。一种
生物的全基因组物理图谱一旦得以构建, 即可通过
基因组序列分析找到大量的功能基因, 还能发展新
的分子标记以增强遗传图谱上分子标记的密度, 加
速基因图位克隆的进程。物理图谱的构建是通过菌
落杂交, PCR和 DNA 指纹等方法来确定克隆之间的
重叠关系, 将顺序重叠的克隆片段排列在一起。制
作重叠克隆群则需具有一定容量的大片段基因组文
库。BAC载体具有插入片段大,易分离等特点,使之
在物理图谱构建中发挥了重要作用。如, 1998年洪
国藩[ 13]报道了水稻第一代 BAC指纹图谱,它含 631
个 BAC跨叠克隆群,覆盖水稻基因组 92%。而 Tao
等[ 14]目前已完成了水稻大规模 BAC 物理图谱, 该
图由 298个 BAC contigs 组成, 覆盖水稻基因组的
97. 4%。1999 年 Tersa Mozo 等[ 15] 报道了由 27 个
BAC contigs覆盖了拟南芥整个基因组的物理图谱;
另外,大豆的基因组 BAC指纹图也即将完成[ 16]。
3. 2 基因的图位克隆
基因的图位克隆( mapbased cloning)又称定位克
隆( positional cloning) , 是根据目的基因在染色体上
的位置进行的, 无需预先知道基因的 DNA 顺序, 也
无需预先知道其表达产物的有关信息, 它基本包括
以下几个环节: ( 1)建立目的性状的分离群体, ( 2)
利用分子标记技术在目的基因两侧寻找与之紧密连
锁的标记; ( 3)利用遗传作图和物理作图将目的基因
定位在染色体的特定位置上; ( 4)构建大片段基因组
文库( BAC或YAC) ; ( 5)以与目的基因紧密连锁的分
子标记为探针, 通过杂交技术或 PCR 方法筛选文
库,并用染色体步移或登陆的方法寻找含有候选目
的基因的阳性克隆; ( 6)通过遗传转化进行功能互补
验证目的基因。由此看出,大片段基因组文库是图
位克隆的重要环节, BAC 载体已在许多基因的图位
克隆中做出了贡献。例如, Kleinhofs研究小组以水
稻为图位克隆中介, 克隆了大麦感锈病抗性基因
Rpg1和 rpg4,通过精确作图后测序结果表明 Rpg 1
为一个编码膜蛋白的开放阅读框[ 17]。
3. 3 基因组测序
基因组测序是获得生物全部遗传信息的可靠手
段。BAC文库性质稳定, 保真度高, 而且与自动化
DNA制备纯化程序相容,所以成为基因组分析中优
先选择的克隆系统。BACs即可以通过亚克隆到质
粒上进行测序,也可以直接作为原始底物进行测序。
近年来, 致力于揭示全部遗传信息的基因组计划取
得了很大进展,被测序的基因组从微生物[幽门螺杆
菌(Helicobacter pylori )、大肠杆菌、酿酒酵母( Sacccha
romuces )等]、植物[拟南芥( Arabidop sis thaliana )水稻
( Oryza satica) ]动物[线虫( Ceanorhabdotis elegans )、黑
腹果蝇( Drosophila melanogaster )、家鼠 ( Mus muscu
lus ) ,直到人类自身(参见 http: / / www. tigr. org/ tdb/
mdb)。许多靠一般遗传手段难以发现的大量基因
最终将会通过基因组测序得以认识和克隆。中国科
学院国家基因研究中心把 430Mb 的水稻基因组
DNA克隆到 20 000个 BAC上, 而后将它们搭成跨叠
克隆群, 通过完成跨叠克隆群上所有 BAC克隆片段
的测序, 而获得了水稻基因组的全序列[ 18]。可见
BAC文库在基因组测序上的关键作用。
92005年第 1期 李海权等:基因组细菌人工染色体文库( BAC)的构建及应用
3. 4 BAC与比较基因组研究
比较基因组学( comparat ive genomics) 是对来自
不同物种的已知的基因和基因组结构进行比较, 以
了解基因的功能、表达机理和物种进化。比较基因
组学研究的主要方法有生物信息学、DNA微阵列和
BAC阵列( BAC arrays) ;三种方法均与BAC相关。生
物信息学的研究依赖于以 BAC为基础的大量 DNA
测序结果; BAC微阵列方法是进行基因杂交用于鉴
定DNA序列,比较不同基因及检测基因表达的有力
工具; 而利用 BAC 构建 DNA微阵列是其构建的主
要方法。有关人结核分歧杆菌( Mycobaterium tuber
culosis)和牛分歧杆菌( Mycobaterium bovis )等分歧杆
菌属的比较基因组学的研究, 对探索与致病性有关
的基因至关重要。Brosch等通过构建人结核分支杆
菌H37Rv 和牛分歧杆菌 BCG的基因组文库及物理
图谱, 将挑选出的可以覆盖整个基因组的 BAC克隆
进行酶切电泳, Southern转膜, 制作出全基因组探针,
然后用这些基因组 BAC阵列相互杂交, 从而发现了
一系列缺失和重叠基因;通过分析, 估计 BCG 较人
结核分歧杆菌缺失了至少 61个基因,包括与结核致
病性有关的基因[ 19]。
BAC阵列无需对样本进行测序, 对于具有操作
危险性等难进行遗传操作和生物学背景知识缺乏的
原核生物尤其有效,是现在和今后进行功能基因组
学研究的主要资源。
3. 5 光学作图
将光学手段运用到物理作图当中是近年新发展
的遗传研究方法。BACs 一般平均插入片段 100~
150kb, DNA片段长约 50m, 在单道高倍显微物镜下
很易成像,它是光学作图的理想底物。FiberFISH 适
宜于基因组的数量作图, 而且由于可以在荧光显微
镜下同时观察几种探针的位置和顺序, 能有效地排
除染色体步移过程中经常遇到的复重序列带来的困
难。这光学物理图谱的构建, 无疑给图位克隆奠定
了坚实的基础。最近, Cai等人[ 20]将来源于人染色
体11和 22的几个 BACcontigs进行了高分辨率的光
学作图。这种高分辨率的 BACs限制性图谱将成为
由 shortgun测序数据装排 contigs 的有效骨架。利
用BAC对基因组进行高分辨率的光学作图( Optical
mapping)正方兴未艾。
3. 6 BAC转基因技术
转基因技术可有效地研究基因的表达及其功
能。增强子、位点控制区域( locus control region)及绝
缘子( indulator)等调控元件对于转基因的高水平组
织特异表达和整合十分重要,但这些元件常距基因
有约 50kb 之遥。传统上, 由于受 DNA 克隆载体容
量的限制,制作转基因技术的外源基因片段通常小
于 20kb;因此某些调控基因活性的重要元素不可避
免地被丢失, 从而导致转基因的低水平表达及位置
效应的产生。
由于 BAC可以容纳大片段 DNA, 不仅包括编码
区,而且还包含有内含子和调控区; 此外, BAC携带
的基因可以和各种酶类、转录因子等作用,遵守基因
表达和复制机制, 理论上和正常染色体上的基因相
似,因此 BAC 可将复杂的基因或基因家族, 包括远
程顺式作用原件转入受体生物基因组中, 使转入的
基因在一定范围内接近于原有的组织状态,减少了
转基因沉默的可能, 而且可以进行基因时空表达的
研究。一旦实现转化基因的稳定、正常表达和调控,
基因工程才能真正超越传统遗传育种, 成为生物物
种改良和基因治疗的可靠、快捷途径。1997年, An
toch等采用 BAC 转基因挽救 ( transgenetic BAC res
cue)策略克隆并确证了鼠节律钟基因及其功能[ 21]。
1998年, Probst等通过 BAC 转基因 shark 聋鼠,纠正
其缺陷基因获得成功[ 22]。目前, BAC 转基因已成为
研究基因的功能、时空调控和表达的有力工具。
4 展望
细菌人工染色体( BAC)能容纳大片断 DNA, 比
其它载体系统构建的基因组文库有更高的覆盖率和
稳定性,并且易于分离和操作等特性。BAC文库在
某些动植物和人类基因组及后基因组计划中发挥了
巨大的作用。随着基因组研究的深入和方法的简
化,除遗传模式物种和经济重要物种外,更多的动植
物要进入到基因组研究中,将有更多物种构建 BAC
文库。同时,利用 BAC文库容量大的特点, 进行基
因表达调控、基因互作和目的基因定位转化等后基
因组时代的工作是未来 BAC文库利用的发展方向。
不容置疑, 随着越来越多 BAC 文库的构建, 以及
BAC应用方法和范围的创新, BAC 文库必将为基因
组研究带来更大的飞跃。
10 生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2005年第 1期
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致 读 者
经上级有关部门批准,原中国农业科学院科技文献信息中心更名为中国农业科学院农业信息研究所,同
时,银行户名改为中国农业科学院农业信息研究所,开户银行、账号、电话、通讯地址等不变。
特此敬告!
生物技术通报编辑部
2005年 1月
112005年第 1期 李海权等:基因组细菌人工染色体文库( BAC)的构建及应用