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生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 10期
弓形虫表面抗原 SAG1截短型片段在
大肠杆菌中的可溶性表达及纯化
安立刚 1 　蒋蔚 1 　王权 1 　陈永军 1 　龚国华 2
周锦萍 2 　邢小勇 1 　孙泉云 2 　丁铲 1
(1 中国农业科学院上海兽医研究所 农业部寄生虫学重点开放实验室 ,上海 200241; 2 上海市动物疫病防控中心 ,上海 201103)
　　摘 　要 : 　在大肠杆菌中高效表达及纯化获得可溶性、有反应活性的弓形虫表面抗原 SAG1截短型片段 ( tSAG1) ,为研制
新型的弓形虫病检测试剂奠定基础。构建重组质粒 pET232a2tSAG1并将其转化大肠埃希菌 BL21 (DE3)表达菌株 ,在异丙基
硫代 2β2D半乳糖苷 ( IPTG)诱导下表达蛋白。SDS2PAGE分析表达产物的表达形式 ,通过降低培养温度、降低摇床转数和升高
LB液体培养基 pH,诱导目的蛋白在上清中表达 ,利用 H is·B indÓ Kit试剂盒对目的蛋白进行纯化 ,W estern blot和 EL ISA检测
纯化蛋白的反应原性。在 IPTG为 1 mmol/L、温度 37℃条件下 , tSAG1以融合蛋白 (H is2tSAG1)的形式在大肠埃希菌中高效表
达 ,表达产物以包涵体形式存在。在 22℃和 LB培养基 pH为 7. 7条件下 ,融合蛋白主要在上清中表达。W estern blot和 EL ISA
分析纯化蛋白能被弓形虫的阳性血清所识别。 tSAG1在大肠埃希菌中得到了可溶性蛋白表达 ,经纯化后能被弓形虫的阳性血
清所识别 ,可用于制备检测弓形虫病的诊断试剂。
关键词 : 　弓形虫 　tSAG1　蛋白表达 　蛋白纯化 　免疫印迹 　EL ISA
Expression and Pur if ica tion of Soluble
Fusion Prote in of Toxoplasm a
gondii Tsag1 in Escherich ia coli
An L igang 1 　J iang W ei1 　W ang Quan 1 　Chen Yongjun 1 　Gong Guohua 2
Zhou J inp ing 2 　Xing Xiaoyong 1 　Sun Quanyun 2 　D ing Chan 1
(1 Key Laboratory for Anim al Parasitology of M inistry of Agriculture, Shanghai Veterinary Research Institu te,
Chinese Academ y of Agricultural Sciences, Shanghai 200241; 2 Shanghai Anim al D isease Control Center, Shanghai 201103)
　　Abs trac t: 　 It was to exp ress the Toxoplasm a gondii major surface antigen SAG1 truncated fragment in the Escherich ia coli and pu2
rify the soluble fusion p rotein which can be used to develop the new diagnostic reagent. The recombinant of pET232a2tSAG1 was trans2
formed into a bacterium BL21 (DE3) and the recombinant was exp ressed under the inducement of IPTG. The exp ression p roduct was an2
alyzed by SDS2PAGE. The fusion p rotein would be induced into supernatant by using the methods of growing the cell in a low speed and
temperature, raising pH of the culture of medium. The immunogenicity of recombinant antigen purified was tested with W estern blot and
ELSA. The truncated fragment of SAG1 was highly exp ressed in E. coli as fusion p rotein in 37℃ and 1 mmol/L of IPTG. The solubility
analysis of exp ress p roduct indicated that this recombinant p rotein exp ressed in inclusion bodies. In 22℃ and pH7. 7of the culture medi2
um, the fusion p rotein of tSAG1 could be induced into supernatant. The recombinant p rotein purified could be recognized by toxop lasmo2
sis positive serum withW estern blot and ELSA. The truncated fragment of SAG1 was highly exp ressed in supernatant and the fusion p ro2
tein could be recognized by toxop lasmosis positive serum after purification. The fusion p rotein can be used for develop ing the new diag2
nostic reagent to diagnose the infection of Toxoplasm a gondii.
Key wo rds: 　Toxoplasm a gondii　tSAG1　Protein exp ression　Protein purification　W estern blot　EL ISA
收稿日期 : 2009204209
基金项目 :公益性行业 (农业 )科研专项经费项目 (200803017) ,上海市科技兴农重点攻关项目 [沪农科攻字 (2006)第 524号 ]
作者简介 :安立刚 (19822) ,男 ,硕士 ,研究方向 :预防兽医学 ; E2mail: xinqing_an@163. com
通讯作者 :王权 (19662) ,男 ,硕士 ,研究方向 :预防兽医学 ; E2mail: wq1cn@ yahoo. com. cn
2009年第 10期 安立刚等 :弓形虫表面抗原 SAG1截短型片段在大肠杆菌中的可溶性表达及纯化
　　刚地弓形虫 ( Toxoplasm a gondii)是细胞内专性
寄生的机会致病原虫 ,呈世界性分布 ,严重危害人类
健康的人畜共患病 [ 1 ]。 SAG1是速殖子表面抗原 ,
原来又称 P30, Burg等 [ 2～4 ]首先克隆得到了完整的
弓形虫 SAG1 基因 , SAG1 基因全序列长 l. 1 kb左
右 ,编码长 336个氨基酸。天然的 SAG1主要通过
糖脂序列 ( GN )锚定在弓形虫的表膜上。 SAG1抗
原作为弓形虫速殖子表面主要抗原之一 ,具有较强
的免疫原性 ,能够诱导机体产生 IgG、IgM、IgA抗体
和 CD8 + T细胞杀伤弓形虫。血清中抗 SAG1抗体
是弓形虫感染后最早出现而且持续时间较长的抗体
之一 [ 5, 6 ] ,因此 SAG1可作为一种良好诊断性抗原应
用于血清学方法检测抗体。但 SAG1又是一种高度
构象决定性抗原 ,其抗原活性与蛋白质分子的正确
折叠相关 [ 7～9 ]。资料表明利用原核生物表达 SAG1,
融合蛋白在大肠埃希菌中往往形成不溶性的无活性
的包涵体 [ 10, 11 ]。
本研究将截短的 SAG1 ( truncated fragment of
SAG1,简称 tSAG1)基因利用大肠埃希菌表达系统
进行表达 ,通过改变培养条件 ,探索诱导融合蛋白在
上清液中进行表达和纯化获得 SAG1可溶性蛋白的
方法 ,为制备弓形虫基因工程抗原蛋白奠定基础。
1　材料与方法
1. 1　试验动物、菌株及质粒
弓形虫国际标准 RH株由本研究室保存。昆明
鼠 (体重约为 25 g)购自复旦大学实验动物中心。
质粒 pET232a ( + )和大肠埃希菌菌株 BL21 (DE3)
由本研究室保存。
1. 2　主要试剂
限制性内切酶 B am H I、X ho I、T4 DNA连接酶均
为大连宝生物工程有限公司 ( TaKaRa)产品 ;质粒抽
提试剂盒为北京博大泰克公司产品 ;琼脂糖凝胶回
收 DNA片段试剂盒琼脂糖为美国 AXYGEN公司产
品、IPTG和蛋白质低相对分子质量 marker为 Pro2
mega公司产品 ; H is·B indÓ Kits为 Novagen公司产
品 ,其它试剂为进口或国产分析纯。
113　弓形虫 　速殖子收集及 DNA提取
RH株弓形虫速殖子复苏后连续在小鼠体内传
代 ,感染 3 d后无菌操作抽取腹水 ,虫体用 PBS洗 3
次 ,用试剂盒按说明书抽提基因组 DNA。
1. 4　设计引物和 PCR扩增目的片段
根据 GenBank ( S76248)中弓形虫主要表面抗原
SAG1的基因的全序列设计引物 ,在上游引物 5′端
B am H I酶切位点 ,在下游引物 5′端引入 X hoⅠ酶切
位点 (下划线部分 )。
上游引物 : 5′2CGTGGATCCTTCACTCTCAAGT2
GCCCT23 ′
下游引物 : 5′2AAACTCGAGACCTGCAGCCCCG2
GCAAACT23 ′
在 PCR管中依次加入 25μl TaqM ix, 20μl ddH2O,
上、下游引物各 1. 5μl,DNA模板 2μl,总体积为 50μl。
反应条件 : 94℃预变性 5 m in后进入循环 , 90℃变性
40 s, 60℃退火 40 s, 72℃延伸 45 s,共进行 30个循
环 ,最后 72℃延伸 10 m in, PCR产物用 1%琼脂糖电
泳鉴定。
1. 5　重组 pET232a2tSAG1质粒的构建
B am HⅠ和 XhoⅠ双酶切目的片段和空载 pET232a
( + )后 ,用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收。T4DNA连接
酶 16℃连接过夜 ,转化到 E. coli ( Top10)宿主菌中 ,经
过抗生素抗性筛选后 ,挑取单菌落扩增后进行酶切、
PCR和测序鉴定。
1. 6　重组质粒的转化
将重组质粒 pET232a2tSAG1转化感受态 BL21
(DE3)菌株 ,将菌株涂于含氨苄青霉素的 LB平板
上 ,置 37℃培养箱中培养。
1. 7　目的基因的诱导表达、SDS2PAGE分析及可溶
性分析
挑取 LB平板上的单个菌落 ,置于含氨苄青霉
素的 LB液体培养基中培养至对数生长期时 (A550 =
0. 5～1. 0)加入 IPTG至终浓度为 1 mmol/L进行诱
导培养。37℃培养 5 h,离心收集细菌。取 2 m l培
养液离心后加入上样缓冲液煮沸 10 m in,离心去除
细菌碎片。取 10 μl上清液进行 SDS2PAGE分析
(分离胶浓度为 12% )。并进行表达产物的可溶性
分析 ,将诱导表达的菌体用原 LB 培养液 1 /20的
PBS(pH7. 2)重悬 ,于冰浴上超声破壁 10次 ,每次
5 s, 12 000 r/m in离心 10 m in,分别收集上清液和沉
淀 ,通过 SDS2PAGE电泳分析融合蛋白 (H is2tSAG1)
的存在形式。
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 10期
1. 8　优化表达条件后融合蛋白的存在形式
取过夜培养母液按 2%分别接种于 pH6. 5、
pH7. 0、pH7. 5、pH7. 7的含氨苄青霉素的 LB液体培
养液中 ,培养温度为 22℃,摇床转数为 120 r/m in,
IPTG浓度为 0. 1 mmol/L其余培养条件同上 ,收集
菌体 ;培养温度分别为 37℃、32℃、27℃、22℃, IPTG
浓度为 0. 1 mmol/L ,摇床转数为 120 r/m in,含氨苄
青霉素的 LB液体培养液 pH为 7. 7,其余培养条件
同上 ,收集菌体 ; IPTG浓度分别 0. 05、0. 1、0. 5、
1 mmol/L,摇床转数为 120 r/m in,培养温度为 22℃,
含氨苄青霉素的 LB液体培养液 pH为 7. 7,其余培
养条件同上 ,收集菌体。同上处理 , SDS2PAGE分析
上清液和沉淀产物 ,观察 pET232a2tSAG1表达产物
表达形式的变化。
1. 9　在优化表达条件条件下上清中融合蛋白 (H is2
tSAG1)的纯化
在优化表达条件条件下收集的菌体 ,用 Binding2
buffer重悬 ,经超声波破碎 ,收集上清然后按照 H is·
B indÓ Kits试剂盒操作纯化并收集目的蛋白。按收
集顺序将收集管进行编号。
1. 10　W estern blot和 EL ISA分析融合蛋白的反应
原性
W estern blot分析融合蛋白的反应原性 :通过
电转移将凝胶中的融合蛋白转到硝酸纤维膜上后
进行免疫染色。分别用弓形虫阳性血清及阴性血
清为一抗 (稀释度为 1∶2 000 ) ,兔抗犬 IgG抗体
为二抗 (稀释度为 1∶2 000 ) ,用辣根过氧化物酶
标记的羊抗兔为三抗 ( 1∶6 000 ) ,最后进行 ECL
显色。
EL ISA分析融合蛋白的反应原性 :将纯化的融
合蛋白 (浓度为 2. 1 mg/m l)用 pH9. 6的碳酸盐包被
液按 1∶40、1∶80、1∶160、1 ∶320、1 ∶640、1 ∶1 280、
1∶2 560稀后 ,每孔加 100μl包被 EL ISA板 , 4℃过
夜 ,用含吐温的 PBS洗涤 3次后 ,每孔加 150μl 1%
的明胶 37℃封闭 2 h;含吐温的 PBS洗涤 3次后 ,每
孔加入一抗 100 μl (弓形虫阳性血清 ,稀释度为
1∶2 000) ,置 37℃温箱中 1. 5 h;含吐温的 PBS洗涤
3次后 ,每孔加入二抗 100μl (兔抗犬 IgG,稀释度为
1∶2 000) ,置 37℃温箱中 1. 5 h;含吐温的 PBS洗涤
3次后 ,每孔加入 100μl三抗 (辣根过氧化物酶标记
的羊抗兔 ,稀释度为 1 ∶6 000 ) , 置 37℃温箱中
1. 5 h;含吐温的 PBS洗涤 3次后 ,每孔加入 100μl
融合蛋白显色液 ( TMP 6 μl + 6 m l的底物缓冲液
+ 6μl H2 O2 )显色 10～15 m in,每孔加 50μl 2 M硫
酸中止后 ,测 OD450值。
2　结果
2. 1　截短型弓形虫 tSAG1基因的 PCR扩增
扩增产物经 1%琼脂糖凝胶电流 ,可见单一条
带 ,其大小在 700 bp左右 ,与预期大小 705 bp相符
(图 1)。
M. Marker 2000; 1. tSAG1的 PCR扩增产物 ; 2. 阴性对照
图 1　 tSAG1基因扩增结果
2. 2　pET232a2tSAG1重组质粒的构建、鉴定及测序
结果及同源性分析
将重组质粒 pET232a2tSAG1用 B am H Ⅰ和 X ho
Ⅰ双酶切 ,可见两条大小分别为 700 bp和 5 900 bp
左右的条带 ,表明重组表达质粒构建成功 (图 2)。
M1. Marker DL15000;M2. Marker DL 2000; 1. X hoⅠ和 B am HⅠ双酶切
pET232; 2. XhoⅠ和 B am HⅠ双酶切 pET232a2tSAG1
图 2　pET232a2tSAG1重组质粒限制性酶切分析
将阳性菌株送到上海英俊测序 ,运用 DNA star
和 ClustalW进行序列分析表明 ,测序结果与弓形虫
RH株 (GenBank登录号 : S76248. 1)核苷酸同源性为
99. 6% ,与弓形虫 P株 ( GenBank登录号 : S85174. 1)
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2009年第 10期 安立刚等 :弓形虫表面抗原 SAG1截短型片段在大肠杆菌中的可溶性表达及纯化
核苷酸同源性为 99. 0% ,与弓形虫 C株 ( GenBank登
录号 : S63900. 1)核苷酸同源性为 99. 0% ,说明转入的
基因确实是 tSAG1基因。64和 287 位置上由 G突
变为 A, 539位置上由 T突变为 C,但读码框正确 ,未
发生移码。利用 ExPASy提供的软件工具进行氨基
酸序列分析及二级结构预测 ,结果显示 ,该突变位点
并不是功能位点 , 不影响 tSAG1 蛋白的结构与
功能。
2. 3　优化条件后表达产物 SDS2PAGE及可溶性分析
2. 3. 1　表达产物 SDS2PAGE分析结果 　在 37℃、
培养基 pH7. 0、IPTG浓度 1 mmol/L的条件下 ,表达
产物经 12% SDS2PAGE电泳 ,显示清晰的蛋白带 ,在
表达质粒中插入的 tSAG1 基因片段为 697 bp。转
录、翻译后的蛋白质约含 232个氨基酸残基 ,分子量
约为 21. 07 kD。加上 pET32a ( + )质粒上编码的共
表达约 22. 6 kD 的蛋白片段 ,推测融合蛋白约为
43. 67 kD。只含空载质粒 pET232a的对照菌体在该
处未出现此特异性带 (图 3)。
M. 蛋白分子质量标准 ; 1. pET232a2tSAG1未经 IPTG诱导的细胞裂解
物 ; 2. pET232a未经 IPTG诱导的细胞裂解物 ; 3. pET232a2tSAG1经
IPTG诱导的细胞裂解物 ; 4. pET232a经 IPTG诱导的细胞裂解物
图 3　pET232a2tSAG1表达产物的 SD S2PAGE分析
2. 3. 2　重组质粒表达产物的可溶性分析结果 　在
37℃、培养基 pH7. 0、IPTG浓度 1 mmol/L, tSAG1基
因在大肠埃希菌表达系统中高效表达 ,表达产物以
包涵体形式存在 ,在上清中未出现此特异性条带
(图 4)。
2. 4　不同条件下融合蛋白的存在形式
2. 4. 1　LB液体培养基 pH对表达产物表达形式的
影响 　在温度 22℃、IPTG浓度 0. 1 mmol/L、摇床转
数 120 r/m in条件下 ,上清中融合蛋白的表达量随
着 pH值升高而增加 ,沉淀中的融合蛋白的表达量
随着 pH值升高而减少 (图 5)。
M. 蛋白分子质量标准 ; 1. pET232a2tSAG1超声裂菌后的沉淀 ;
2. pET232a2tSAG1超声裂菌后的上清液
图 4　pET232a2tSAG1表达产物的可溶性分析
M. 蛋白分子质量标准 ; 1～4. pH分别为 6. 5、7. 0、7. 5、7. 7条件下诱
导表达的超声波裂解细菌后的上清液 ; 5～8. pH分别为 6. 5、7. 0、
7. 5、7. 7条件下诱导表达的超声波裂解细菌的沉淀
图 5　融合蛋白表达的 SD S2PAGE分析
2. 4. 2　温度对表达产物表达形式的影响 　在 LB
液体培养基 pH7. 7、IPTG浓度 0. 1 mmol/L、摇床转
数 120 r/m in条件下 ,上清中融合蛋白的表达量在
22℃和 27℃的表达量最高 ,沉淀中的融合蛋白的表
达量都比较少 (图 6)。
IPTG对表达产物表达形式的影响 　在温度 22℃、
LB液体培养基 pH7. 7、摇床转数 120 r/m in,不同
IPTG下融合蛋白大部分在上清中表达 ,沉淀中的表
达量很少 ;表达量差别不大 (图 7)。
2. 5　上清液中可溶性融合蛋白的纯化
摇床转数 120 r/m in、温度 22℃、IPTG 浓度
0. 1 mmol/ l、pH7. 7 LB培养、制备的菌体裂解液上
清液经 H is·B indÓ Kits纯化试剂盒纯化后 ,融合蛋
白 H is2tSAG1的纯度达到 90%以上 (图 8)。
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 10期
M. 蛋白分子质量标准 ; 1～4. 温度分别为 37℃、32℃、27℃和 22℃条
件下诱导表达的超声波裂解细菌后的上清液 ; 5～8. 温度分别为
37℃、32℃、27℃和 22℃条件下诱导表达的超声波裂解细菌的沉淀
图 6　不同温度下诱导 pET232a2tSAG1
的融合表达 SD S2PAGE分析
M. 蛋白分子质量标准 ; 1～4. IPTG浓度分别为 0. 05、0. 1、0. 5和
1 mmol条件下诱导表达的超声波裂解细菌后的上清液 ; 5～8. IPTG
浓度分别为 0. 05、0. 1、0. 5和 1 mmol条件下诱导表达的超声波裂解
细菌的沉淀
图 7　不同 IPTG浓度诱导 pET232a2tSAG1的
融合表达 SD S2PAGE分析
M. 蛋白分子质量标准 ; 1～6. 分别为 pET232a2tSAG1纯化后 1～ 6号
收集管 ; 7. 未纯化的 pET232a2tSAG1超声裂菌后的上清液
图 8　纯化后的 pET232a2tSAG1融合
蛋白的 SD S2PAGE分析
2. 6　纯化的融合蛋白的 W estern blot分析
纯化的融合蛋白 (H is2tSAG1)能被弓形虫阳性
血清识别 (图 9)。
M1蛋白分子质量标准 : 1. PET2329 ( + )空质粒表达蛋白 (弓形虫阳
性血清为一抗 ) 2. 纯化的 H is2tSAG1 (弓形虫阴性血清为一抗 ) ; 3. 纯
化的 H is2tSAG1 (弓形虫阳性血清为一抗 )
图 9　纯化的 H is2tSAG1融合蛋白
W estern blot分析
2. 7　应用 EL ISA检测弓形虫抗体
用纯化的融合蛋白检测已知犬的弓形虫阳性血
清和阴性血清 ,结果显示 ,融合蛋白抗原能与犬的弓
形虫阳性血清反应 ,不与阴性血清反应 ,说明融合蛋
白具有较好的反应原性 ,见表 1。
表 1 融合蛋白的 EL ISA检测结果 ( OD450 )
融合蛋白
稀释度
1∶40 1∶80 1∶160 1∶320 1∶640 1∶12801∶2560 空白
阳性血清 0. 621 0. 584 0. 461 0. 388 0. 315 0. 137 0. 137 0. 124
阴性血清 0. 08 0. 073 0. 071 0. 075 0. 086 0. 076 0. 072 0. 08
3　讨论与总结
目前市售的弓形虫特异性抗体诊断试剂盒主要
检测弓形虫特异性 IgG和 IgM抗体 ,通常使用从感
染动物中收集或经组织或细胞培养的弓形虫速殖子
提取物作为包被抗原 ,制备程序烦琐 ,且不可避免地
携带一些宿主或细胞的抗原 ,纯度低。由于速殖子
抗原的制备难以标准化 ,因此 ,试剂盒之间经常存在
方法间差异 ,而同一试剂盒的不同批次之间也常常
存在批间差异 [ 12, 13 ]。利用分子生物学技术 ,在不同
的表达系统中表达虫体蛋白作为诊断抗原可以避免
使用弓形虫速殖子抗原存在的上述问题。
由于表膜抗原 SAG1具有很强的抗原性 ,近几
年 ,已有不少报道 [ 14～16 ] 是利用基因工程方法将
SAG1基因在原核或真核细胞系统中进行表达 ,用
于检测弓形虫抗体。但是 SAG1重组蛋白的免疫原
性主要依靠其肽链正确的折叠和二硫键的形成 [ 17 ]。
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2009年第 10期 安立刚等 :弓形虫表面抗原 SAG1截短型片段在大肠杆菌中的可溶性表达及纯化
而全长的 SAG1在大肠埃希菌中表达缺乏有效的折
叠 ,很难被天然的抗 SAG1血清有效识别 ,其原因在
于基因编码的多肽 N端存在信号肽序列和 C端有
疏水结构。龚娅等以及陈晓光等 [ 18 ]分别构建了弓
形虫重组质粒 pET2SAG1,使 SAG1在 pET系统中表
达 ,融合蛋白以不可溶的包涵体形式存在 ,经纯化和
复性后能被弓形虫感染者血清所识别 ,但 SAG1在
复性的过程中常形成其他不同的构象 ,其纯化蛋白
在免疫印迹试验显示两条蛋白条带 ,并且在纯化蛋
白的浓缩增高到一定程度后 ,蛋白质开始聚集形成
没有活性的二聚体甚至多聚体的沉淀。真核细胞的
表达可获得与天然 SAG1蛋白构型接近的重组蛋
白 ,但是步骤繁琐 ,造价昂贵 ,表达量小 [ 19, 20 ]。
本研究通过对 SAG1基因的部分取舍 ,除去其 N
端信号肽和 C端疏水氨基酸序列 ,将截短的 SAG1
基因经扩增后 ,构建重组表达质粒 pET232a2tSAG1,
并以融合蛋白的形式在 E. coli中高效表达 ,通过降
低摇床转数、培养温度和提高培养液 pH的方法使
融合蛋白在上清中大量表达 ,无需复性就具有很好
的免疫原性 ,且易于纯化。纯化的过程中有少量杂
蛋白存在可能原因 :杂蛋白和标签蛋白结和在一起
或者是一些杂蛋白对镍离子有更好的亲和性的。
W estern blot和 EL ISA试验表明该重组蛋白能被感
染弓形虫的犬的血清所识别 ,说明重组的 SAG1具
有与天然蛋白相同的免疫反应性 ,这为弓形虫病诊
断试剂盒的研制打下了良好的基础。
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