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研究报告

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 8期
棉蚜 Catb5基因 RNAi载体的构建及其对烟草的转化
李晓明 高朝宝 彭明 崔百明
(石河子大学生命科学院 石河子大学农业生物技术重点实验室,石河子 832003 )
  摘  要:  依据细胞色素氧化酶亚基 序列的多态性设计特异性引物,通过 PCR技术扩增出的特异性条带鉴定为棉蚜。
提取棉蚜总 RNA, 利用 RT
PCR技术从棉蚜中扩增出大小为 515 bp的 C atb5目的基因,进一步将两段 Catb5基因分别正向和
反向连接到植物表达载体 pB i35SG12上, 构建了 pB i35SC5 RNA i表达载体,并通过农杆菌介导法导入烟草中, PCR检测表明已
得到转基因烟草再生苗。
关键词:  棉蚜 C atb5基因 RNA i 表达载体 烟草
Construction of RNA iExpression Vector forAphis gossipy Catb5
Gene and Transformation of Tobacco
L iX iaom ing Gao Chaobao PengM ing Cu iBami ing
(K ey Laboratory of Agriculture B io technology of Shihez i Univer sity, Co llege of Life Science, Shihezi University, Shihez i 832003)
  Abstrac:t  Aphis gossipy w as identified by PCR w ith pr ime rs accord ing to the sequencing leng th po lymo rph ism m ethod based on
the cytochrom e ox idase subun it I gene. The to tal RNA w as extrac ted from A. gossipy and the 515 bp leng th product o f C atb5 gene w as
cloned by RT
PCR. RNA i vec tor pB i35SC5 w as constructed by inserting the tw o C atb5 genes into plant expression vector pB i35SG12
forw ard and reverse ly. The vecto r is transfo rm ed into tobacco m ed ia ted byAgrobacter ium tum efaciens GV3101. T ransgen ic plants w ere
screened by kanamycin resistant and ver ified by PCR ana ly sis, w hich prov ides a foundation for further exper iment o f res isting A. gos

sipy.
Key words:  Aphis gossipy Catb5 gene RNA i pB i35SC5 Tobacco
收稿日期: 2010
03
29
作者简介:李晓明,女,硕士生,研究方向:植物基因工程; E
m ai:l b luerain2068@ s ina. com
通讯作者:崔百明,博士, E
m ai:l bm cu i_2006@ yahoo. com. cn
RNA干扰 ( RNA interference, RNA i)是广泛存
在于真核生物中,高度保守的发生在转录后特异性
降解靶基因 mRNA的基因沉默机制。细胞内双链
RNA在 D icer酶的作用下可形成 22 bp大小的小干
扰 RNA ( sm all interfering RNAs, siRNA s)。 siRNAs
可进一步掺入 RNA诱导的沉默复合体 ( RNA
in

duced silencing comp lex, RISC ) , 一种多组分核酸酶
中,后者精确地降解与该 siRNAs序列相同的 mRNA,
从而抑制了该基因在细胞内的翻译和表达。RNA i
技术已经成为一种基因功能分析的有力证据。
棉蚜 (Aphis G ossipy )是危害棉花的重要害虫之
一。成蚜、若蚜聚集在叶背面刺吸汁液,破坏细胞组
织,使叶片萎缩变形,造成卷叶或发黄脱落, 严重者
死苗。棉花蕾铃期受伏蚜危害, 会造成蕾铃大量脱
落,严重影响着棉花的产量。棉蚜的防治主要依赖
化学杀虫剂,但大量喷施化学杀虫剂,不仅会增强棉
蚜的抗药性,而且严重污染环境,提高生产成本, 破
坏生态平衡。 1981年 Schnepfh等首次从苏云金芽
孢杆菌中分离并克隆了 B t毒素基因 [ 1]。通过表达
毒蛋白来抑制或杀死害虫。但同样存在问题, 棉蚜
通过多代的选择后可能产生抗性。所以寻找一种新
型的抗虫策略, 既能够有效地抵抗蚜虫, 又是安全
的, 就成为一种迫切的要求。
1998年, F ire等 [ 2 ]报道线虫在取食表达 GFP基
因的 dsRNA的细菌时, 可以将 dsRNA吸收到体内
抑制线虫中的 GFP基因表达。2006年, Huang等 [ 3]
生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2010年第 8期
报道了拟南芥表达了根结线虫 16D10的 dsRNA,根
结线虫取食了 dsRNA后可以抑制本身 16D10基因
的表达, 降低根结线虫的数量。 2007年, 陈小亚
等 [ 4]报道棉铃虫在取食了拟南芥表达的棉铃虫
P450单氧合酶基因的 dsRNA后, 可以降低棉铃虫
的数量。同年, Baum 等 [ 5 ]报道了 V
ATPase基因
dsRNA被玉米根虫取食后, 显著降低玉米根虫的数
量。这种利用植物表达与昆虫特定基因匹配的双链
RNA分子,当昆虫取食这类植物后, 其靶基因的表
达被明显降低的技术不仅为昆虫的功能基因组研究
提供了便捷的方法, 也为农业害虫的防治提供了特
异性更强且环境安全的新思路、新技术。
根据植物介导的昆虫 RNA干扰策略, 选取了一
种棉蚜的持家基因 Catb5组织蛋白酶基因,构建了
pB i35SC5干扰载体, 并通过农杆菌介导的方法转到
烟草中,旨在为下一步的抗虫试验奠定基础。
1 材料与方法
1. 1 材料
111 棉蚜 采集于新疆石河子市农学实验站,经
鉴定为棉蚜后,于网室中培养待用。
112 菌种和试剂 大肠杆菌 DH5
、农杆菌
GV3101和质粒载体 pB i35SG12, 由本实验室保存。
逆转录酶试剂盒 (M
MLV )、限制性内切酶、T4 DNA
连接酶和 PCR试剂盒, 购自 Fermentas公司; 试剂
盒、W izard DNA C lean
up K it凝胶回收试剂盒购自
Promega公司; M S培养基各成分购自上海生工; T r

izo l试剂购自 Inv itrogen公司; 其它试剂是国产分
析纯。
12 方法
12. 1 棉蚜的鉴定 棉蚜的分子鉴定依据细胞色素
氧化酶亚基 序列的多态性设计 [ 6]。以棉蚜特异性
引物; AG. ID1: 5!
CCAGATATATCTTTTCCACGAC
3!
和 AG. ID2: 5!
ACCAGCTAATACAGGTAAGGA
3!, 蚜
虫 DNA为模板进行 PCR反应,反应程序: 94∀ 预变性
5 m in; 94∀ 30 s, 60∀ 30 s, 72∀ 60 s, 共 30个循环;
最后在 72∀ 下延伸 7 m in。 PCR产物经 10 g /L琼脂
糖电泳后确定片段大小,鉴定是否是棉蚜。
12. 2 棉蚜 RNA的提取及 cDNA的合成 取 100
mg的棉蚜放入液氮中研磨后,加入 1mL T rizo l试剂
混匀, 再加入 200 L氯仿,剧烈振荡混匀 30 s, 离心
后提取上清加入等体积异丙醇,离心后 70%乙醇洗
涤两次, 吹干后加入 30 L DEPC
H 2O溶解。然后
用逆转录酶试剂盒 (M
MLV )合成 cDNA, 具体操作
参照产品说明书。
12. 3 棉蚜 Catb5基因的扩增 根据 GenBank登
记的棉蚜 cathepsin B基因 mRNA序列 (登录号:
BK006305 ) 设计一对引物: SP /BK5, 6: 5!
ATG

GCTAGGGTATTAATTTTATTGTC
3!和 3! IN /BK05:
5!
TGTTTCTTAAAACGTTCCCAT
3!;以合成的 cDNA
为模板进行 PCR反应, 反应程序: 94∀ 预变性 5
m in; 94∀ 30 s, 65∀ 30 s, 72∀ 60 s, 共 30个循环;最
后在 72∀ 下延伸 8 m in。PCR产物经 10 g /L琼脂
糖电泳后用W izard DNA C lean
up K it试剂盒回收,
并将回收的目的条带用 T4DNA连接酶连到 T
Easy
Vector上, 然后用热激法将克隆载体导入大肠杆菌
DH5
中, 经蓝白斑筛选、E coR I单酶切初步鉴定
后, 再将阳性克隆送到上海生工公司测序,序列分析
结果由分子生物学软件包 VectorNT辅助完成。
12. 4 RNA i载体的构建 蚜虫 Catb5干扰片段从
克隆到 T载体的片段扩增,两侧通过 PCR方法引入
酶切位点: Xba I、Sac I和 Sp e I、Bgl II, 然后将 Sac I/
Sp e I双酶切片段和 Xba I/Bgl II双酶切片段分别插
入到中间载体 piRDG34,成为 piRDC5;将 p iRDC5中
间载体的 Xba I和 Sac I双切片段连接到 pB i35SG12
相应位点,构建出 pB i35SC5 RNA i载体。
12. 5 烟草转化及 PCR检测 大量提取 pB i35SC5
质粒并纯化, 用电激转化方法导入农杆菌 GV3101
中, 并用菌落 PCR方法鉴定出阳性克隆。采用叶盘
法通过农杆菌介导将 PB i35SC5整合到烟草基因组
中,受侵染的烟草暗培养 (M S+ 0. 1 mg /L IAA (生长
素 ) + 10mg /L 6
BA( 6
苄氨基嘌呤 ) 2 d后,直接转
移到高选择压的分化培养基 [M S+ 01mg /L IAA +
10 mg /L 6
BA + 300 mg /L Car (羧苄霉素 ) + 50
mg /L Kana(卡那霉素 ) ], 出芽后转到生根培养基
(M S+ 300 mg /L C ar+ 50 mg /L Kana)中,培养条件
是 28∀ 、光照 16 h /d。
剪取约 01 g烟草的叶片,液氮研磨成粉末状,
加 05 mL提取缓冲液 ( T ris
C l 01 mo l/L、EDTA

2Na 01 mol /L、N aC l 025 mo l /L、pH8. 0)和 05 mL
10%的 SDS, 65∀ 放置 30 m in后离心收集上清液,
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2010年第 8期 李晓明等:棉蚜 Catb5基因 RNA i载体的构建及其对烟草的转化
然后用无水乙醇沉淀和 75% (体积分数 )乙醇洗涤
2次,晾干后再加 03mL水溶解,静止放置到 4∀ 冰
箱内过夜, 使烟草基因缓慢释放到水中, 然后取 2
L溶液为模板进行 PCR检测抗性烟草植株。
2 结果
2. 1 棉蚜的鉴定
依据细胞色素氧化酶亚基 序列的多态性设计
特异性引物用 PCR技术从蚜虫的 DNA模板中扩增出
约 275 bp大小的目的片段。选择了 13组蚜虫同时做
PCR,发现这 13组蚜虫都为棉蚜 (图 1),将从榆树上采
集的蚜虫作为对照进行 PCR,未能扩增出特异性条带。
1- 13.鉴定正确的棉蚜; 14.空白对照; 15.榆蚜对照
图 1 棉蚜 PCR鉴定产物
2. 2 棉蚜基因的克隆
利用 RT
PCR技术从棉蚜 cDNA中扩增出约
515 bp大小的目标条带 (图 2) , 回收目标带并将
它连接到 T E asy V ector中, 构建出克隆载体, 用
E coR I单酶切鉴定正确后将样品送到上海生工公
司测序, 测序结果 (图 3)经 BLAST比对, 确定为目
的基因。
图 2 Catb5基因 PCR扩增产物
1 ATGGCTAGGG TATTAATTTT ATTGTCTGTT ATTTTGTTCA GTGTCTATAT
51 GACAGAACAA GCATACTTTT TGGAAAAAGA CTACATCAAC AAAATCAATG
101 AAAAAGCATC AACATGGACG GCTGGTTTCA ATTTCGATCC ATCCACACCG
151 AAAGAAGACA TTTTAAAGCT CTTAGGATCA AAAGGTGTAC AAACTCCAAG
201 CAAAATTAAC CTCAAAATGT ACAAATCAGA AGATGAAAAC TATGATAATC
251 TTTTTGGCAG AATTCCAAAG AAATTTGATG CAAGGAAAAA ATGGAGACAT
301 TGTACGACTA TTGGAAAAGT CCGAGACCAA GGAAATTGTG GAAGTTGTTG
351 GGCCTTATCT ACAAGCTCAG CGTTTGCTGA CCGTCTATGT GTAGCTACCA
401 ACGGAGATTT CAATCAATTA TTGTCCGCAG AAGAACTAAC TTTCTGCTGT
451 CACAAGTGTG GATATGGCTG TAATGGAGGA TACCCAATAA AAGCATGGGA
501 ACGTTTTAAG AAACA
图 3 棉蚜 Catb5基因片段核苷酸序列
2. 3 RNA i载体的构建
将由 PCR扩增得到的 Catb5基因经 Sac I/Spe I
双酶切后得到的大小为 444 bp的片段和经 Xba I/Bgl
II双酶切后大小为 446 bp的片段分别反向和正向插
入到表达载体 pB i35SG12相应位点,构建出 pB i35SC5
RNA i载体。双向插入的 Catb5基因由 35S启动子启
动, NOS终止子终止基因合成。后面连有由双 35S启
动子启动的 NPT#筛选基因 (图 4)。
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生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2010年第 8期
图 4 pB i35SC5载体构建图
2. 4 烟草的转化及 PCR的检测
用电激转化方法将 pB i35SC5质粒导入农杆菌
GV3101中,菌落 PCR鉴定出阳性克隆 (图 5) , 利用
农杆菌通过叶盘法将质粒导入烟草基因组中, 得到
18株烟草再生苗。提取 11株生根烟草植株叶片基
因组进行 PCR检测 (图 6) , 共获得 10个转基因烟
草株系,表明干扰基因已经成功地整合到烟草基因
组中。 l- 6.转化农杆菌; + .阳性对照; - .阴性对照图 5 GV3101 /pB i35SC5菌落 PCR鉴定
1- 10转基因植株; + .阳性对照; - .未转化烟草对照
图 6 转基因烟草植株的 PCR检测
3 讨论
1990年, Napo li等 [ 7]发布了一个令人惊讶的发
现:在矮牵牛 (P etum ia hybrida )花中发现共抑制现
象又被称为转录后基因沉默 ( post
tran
scriptional
gene silenc ing, PTGS)。W aterhouse等 [ 8] 首先发现
在植物中,双链 RNA分子能诱导 PTGS现象。这些
发现说明 RNA干扰 (RNA i)技术在植物保护方面是
一种非常有用的新技术。
本研究利用植物介导的昆虫 RNA i方法, 寻找
一种有效、安全的抗棉蚜的方法。棉蚜繁殖力很强,
平均每 3 d就可以繁殖一代, 对棉花等农作物的危
害极大。长期以来,大量喷施化学杀虫剂,不仅会增
强棉蚜的抗药性,使益虫及其它生态区系遭受破坏,
而且严重污染环境,提高生产成本, 破坏生态平衡。
目前, 抗蚜基因工程均使用毒性基因,通过表达毒蛋
白来抑制或杀死害虫。但同样存在问题, 棉蚜通过
多代的选择后可能产生抗性。本研究选用 RNA i方
法,在植物中表达 dsRNA, 蚜虫取食后可以有效地
抑制靶基因的表达,从而达到抑制棉蚜数量的作用。
我们优先选取了棉蚜的持家基因组织蛋白酶基
因作为棉蚜的靶基因,而没有选取一些特异性表达
的基因,持家基因能够在蚜虫体内广泛的表达, 当
RNA i作用到靶基因时能够引起蚜虫系统性的沉默,
提高蚜虫的致死率。希望通过这种安全有效的方
法, 能够最大程度地抑制棉蚜,为以后蚜虫这类害虫
的防治提供一种有效的途径。
参 考 文 献
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