全 文 ：综述与专论
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 12期
M icroRNA研究进展
赵奎 庞全海
(山西农业大学动物科技学院,太谷 030801)
摘 要: M icroRNA ( m iRNA)是生物体内源长度约为 21- 25个核苷酸的非编码小 RNA, 通过与靶 mRNA互补配对而在
转录水平上对基因的表达进行负调控,导致 mRNA的翻译抑制或降解。m iRNA虽然微小, 但它在真核生物发育和基因表达中
通过与靶 mRNA形成完全或不完全互补配对从而扮演着重要角色。它们参与动物体发育、细胞增殖与死亡、细胞分化等各种
过程。综述了 m iRNA的发现、生物合成、特征与功能、靶基因的预测等方面的研究进展。
关键词: m iRNA 生物学功能 靶基因预测
The Research Progress ofM icroRNA
Zhao Ku i PangQuanha i
(College of Animal Science and Veterinary M edicine, Shanx iAgriculture University, T aigu 030801)
Abstrac:t M icroRNA( m iRNA) a re a class o f endogenous noncod ing sing lestranded RNA w ith about 21- 25 nuc leo tides leng th.
M icroRNA func tion as sequencespec ific nega tive regu la tors in posttransc riptiona l g ene silencing by base pa ir ing w ith target mRNA s,
wh ich leads to mRNA cleavage or transla tiona l repression. A lthough they are tiny, in eukaryotes, m icroRNA play im po rtant ro les in gene
expression regu lation, typ ica lly by fo rm ing pe rfect or imperfect duplexes w ith targe t m essenger RNAs. These m iRNA are invo lved in
physica l deve lopm ent, death pro liferation, and d ifferentiation of ce l.l This rev iew tries to have a br ief introduction on the prog resses of
m iRNA study, such as the d iscove ry, b iogenesis, feature and func tions, and gene pred ic tion.
Key words: m iRNA B io log ica l function Gene prediction
收稿日期: 20100607
基金项目:国家自然科学基金项目 ( 30972223) ,山西农业大学基金项目 ( 412528, 614114)
作者简介:赵奎,男,硕士研究生,研究方向:动物临床疾病的细胞及分子生物学研究; Em ai:l zhaoku ihappy@ 163. com
通讯作者:庞全海,教授,博士生导师, Em ai:l pangquanha@i 126. com
M icroRNA ( m iRNA )是一类大小约 21 - 25个
核苷酸 ( n t)的 RNA分子, 一般来源于染色体的非
编码区域, 由大约 70 n t大小的可形成发夹结构的
前体加工而来, 其作用是在转录水平上对基因表
达产生抑制性作用 [ 1 ]。作为 21世纪生命科学研
究重大发现之一,越来越多的资料显示, m iRNA在
动物的基因表达调控、细胞分化等过程中起着重
要的作用。
1 m iRNA的发现和命名
1993年, Lee等 [ 2]在秀丽隐杆线虫中利用定位
克隆法克隆了第 1个能阶段性调控胚胎后期发育的
基因 lin4,该基因不编码蛋白质, 但是编码长度约
22 nt的 m iRNA。L in4的发现及其翻译抑制作用提
示,在生长发育过程中存在着一种新的基因调节机
制。L in4是在生物生长发育过程中起重要作用的
lin14和 lin28的负性调节因子。 2000年, Re inhart
等 [ 3]又在线虫中找到了第 2个调控时序性发育的基
因 let7,其转录物也被加工成大小为 21个核苷酸的
m iRNA,也是一个负调节因子。人们逐渐认识到
m iRNA是一类进化保守,在生物进化和疾病发展过
程中起着调控作用的重要分子, 通过抑制靶基因的
表达产生基因沉默效应 [ 4- 6]。此后, 人们逐渐在人
类、果蝇、小鼠等多种生物中开展了 m iRNA s的研
究, 结果发现了数以百计的 m iRNAs。到 2009年 3
月, m iRB ase数据库已更新到 13. 0版本, 共发布 9
539种 m iRNA。
英国的 Sanger中心专门成立了 m iRNA的数据
库 ( h ttp: / /www. sanger. ac. uk / Softw are /R fam /m ir
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 12期
na), 以对发现的 m iRNA进行统一的归类和编号。
所有 m iRNA以 m iR!作为前缀,在其后加上唯一的
标示性识别号码,如 m iR2、m iR89等, 而编码 m iR
NA的基因也用同样的三字母前缀, 但应当注意的
是,根据生物体惯用的不同, 有的生物体中需要大
写,用连字符。如在线虫和果蝇体内为 m iR1, 而在
拟南芥中,应为 M IR156。识别码是按顺序给出,不同
的生物体,同样的 m iRNA有相同的识别码,非常相近
的同源物也可以有相同的识别码, 如果蝇体内的
m iR1和线虫及人类的 m iR1。同一物种中相同或非
常相近的 m iRNA序列可以有相同的识别码,用字母
或数字后缀区别,如果蝇的 m iR13a和 m iR13b,指序
列有轻微差异的转录本;而 m iR61和 m iR62则为
相同的转录本 [ 7]。
2 m iRNA的生物合成过程
研究发现,动物细胞内的 m iRNA都是一组非编
码蛋白质的短序列 RNA [ 8] , 具有较高的保守性 [ 9]。
m iRNA是由 RNA聚合酶 II在基因组的不同区域转
录形成较长的 prem iRNA, 通常有几百至上千个核苷
酸,含有帽子和 polyA尾巴结构,二级结构呈特殊的
发夹形茎环, 然后加工而成 [ 10]。经过核酸内切酶∀
Drosha及其辅助因子 DGCR8的识别和作用, prim iR
NA去除帽子和尾巴结构,形成了 60- 75 nt的 m iR
NA前体 ( prem iRNA )。 prem iRNA的 5#带有磷酸基
团, 3#有 2 nt的突出。 prem iRNA被核内转运蛋白 ex
port in5转运出细胞核进入细胞质。第二个核酸内切
酶∀D icer和 TRBP [ Tar ( H IV1 ) RNA b ind ing pro
tein]复合物对 prem iRNA进行切割形成短小的 m iR
NA双链体, 然后双链体降解成为单链的成熟 m iR
NA
[ 11]
,成熟的 m iRNA通过与一种类似 R ISC ( RNA
induced silencing complex ) 的核糖核蛋白结合形成
m iRNP,识别靶基因从而发挥生物功能 [ 12] (图 1)。
3 m iRNA的特征与功能
3. 1 m iRNA的特征
m iRNA有几个明显的特征: ( 1)广泛存在于真
核生物中,是一组不编码蛋白质的短序列 RNA, 它
本身不具有开放阅读框架 ( 0RF)及蛋白质编码基因
的特点,而是由不同于 mRNA的独立转录单位表达
的; ( 2)通常的长度为 21 - 25 n,t但在 3#端可以有
1- 2个碱基的长度变化; ( 3)成熟的 m iRNA是由
D icer酶从折叠的发夹状转录前体的一条臂上切割
得来; ( 4)m iRNA定位于能潜在编码其前体发夹结
构的蛋白质非编码区域; ( 5)成熟 m iRNA的序列和
预测的发夹结构在不同物种间具有高度的进化保守
性, 在线虫中所发现的 m iRNA 85% 都可以在 C.
briggsae基因组中找到同源序列, 同样, 拟南芥中也
有 m iRNA与水稻中的 m iRNA找到了完全一样的序
列,在拟南芥、水稻和烟草中也发现 m iR171相似序
列 [ 14] ; ( 6)表达具有严格的时空性和组织特异性,
试验证明, m iR3- m iR7基因只在果蝇早期胚胎形
成时表达,而 m iRl、m iR8和 m iR12的含量在果蝇
幼虫阶段急剧上升并在成虫期维持在较高水平, 与
此同时, m iR9和 m iR1 l的含量却急剧减少。在组
织培养的 S2细胞 ( Schne ider2细胞 )可发现 m iR12
等, 却无法找到 m iR3 - m iR6; 类似地, m iR171
( m iR39)在拟南芥的花序和花组织中高水平表达,
而在茎、叶组织中却没有表达的迹象 [ 15]。根据以上
特征都暗示着 m iRNA可能参与了深远而复杂的基
因表达调控,并决定发育和行为等的变化 [ 16, 17]。
图 1 m iRNA生物合成成模式图 [ 13]
3. 2 m iRNA的生物学功能
在生物的整个发育过程中, m iRNA可能有调节
细胞早期发育,参与细胞分化和组织发育,调控基因
表达的生物功能, 主要的作用是调控基因表达。通
过两种机制调节靶基因的表达: ( 1)结合到靶 mR
NA 3#端非翻译区 ( 3#UTRs) ,抑制其翻译; ( 2)像 siR
NA作用一样结合到靶上并降解靶 mRNA。m iRNA
与 siRNA的功能相似, 并且二者从前体加工过程中
都依赖于相同的 D icer酶的参与。
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2010年第 12期 赵奎等: M icroRNA研究进展
3. 2. 1 m iRNA调节细胞的早期发育 Tang等 [ 18]
通过实时定量 PCR方法比较鼠未成熟卵子、成熟卵
子、合子 m iRNA表达谱,结果显示,未成熟卵子在逐
渐发育成熟过程中 m iRNA的表达呈现动态变化,但
检测可见成熟卵子与合子的 m iRNA表达谱基本一
致,而随着合子发育由单细胞分裂增殖形成 2细胞
胚时, m iRNA不断被降解导致其总量下降达 60% ;
在 2细胞发育到 4细胞期时, m iRNA的表达又开始
上调,其中 m iR290簇上调达 15倍。比较正常小鼠
与 D icer突变体鼠的成熟卵子基因表达谱可见, 大
部分母源性的基因表达受胞内 m iRNA分子的直接
或间接调控,从而表明母源性来源的 m iRNA分子对
小鼠早期的胚胎发育是必需的。
3. 2. 2 m iRNA 参与细胞分化和组织发育 Tay
等 [ 19]研究结果发现,小鼠胚胎干细胞在视黄酸诱导
下第 4天高表达 m iR134,在 N2B27诱导下第 2天
高表达 m iR134。单独上调 m iR134的表达, 可以
促进小鼠胚胎干细胞向外胚层分化, 且这一作用可
被 m iR134的抑制剂阻断。在肌肉发育方面, C lop
等 [ 20]证实, Texel绵羊中的 GDF8基因的 3#UTR内
的一个点突变产生了可以在骨骼肌内高度表达的两
个 m iRNA,即 m iRl和 m iR206,它们同时作用的靶
位点, 从而引起 m iRNA介导的 myostatin浓度在转
录后降低而造成肌肉肥大; Chen等 [ 21]证实, m iRl
通过作用于 HDAC4而促进成肌细胞分化为成熟的
肌肉细胞,抑制细胞扩增, m iR133则通过抑制 SRF
而促进成肌细胞扩增,抑制其分化。
3. 2. 3 m iRNA参与调节基因的表达 在各类小分
子 RNA中, m iRNA具有最广泛的基因调节功能 [ 22 ]。
在培养的人 293T细胞试验中发现 m iRNA和 siRNA
可能通过相似的机制抑制 mRNA的表达。内源性
人的 m iR21通过与靶位完全互补诱导 mRNA剪
切,这种特性一度被认为是 siRNA的特性之一。相
反,将合成的 siRNA通过与靶位点错配可以下调
mRNA的表达, 由此说明 m iRNA和 siRNA可利用相
似的机制抑制 mRNA的表达,而最终选择哪几种机
制也许在很大程度上完全取决于其与靶 mRNA的
互补程度。
3. 2. 4 m iRNA与肿瘤 m iRNA不仅在肿瘤诊断和
治疗中发挥作用, 而且可以指导预后。 Chan等 [ 23]
用实时定量聚合酶链反应对比胃癌组织与正常组织
m iRNA21的表达,发现 92% ( 34 /37)的胃癌标本中
有 m iRNA21高表达,但 m iRNA21高表达与不良颁
后不相关, 因此认为 m iRNA21的表达程度可以作
为胃癌的诊断标志物,但不能反映肿瘤复发及预后
情况。B loom ston等 [ 24]将胰腺癌组织与癌旁正常组
织及慢性胰腺炎组织对比发现 3种组织中 m iRNA
表达不同, m iRNA196a2与胰腺癌组织的不良预后
相关。
3. 2. 5 m iRNA与动物病毒性疾病 Lecellier等 [ 25]
将 PFV1病毒所含有的病毒基因序列与一种附有
报告基因绿色荧光蛋白 ( GFP)链接在一起, 然后使
它们与人体胚胎肾脏细胞一起染上病毒,结果显示,
F11架构中的绿色荧光蛋白与 F11 mRNA聚集中所
含有的绿色荧光蛋白比例完全不同。同时, 他们利
用 D IANAm ieroT运算法则计算后发现 F11序列与
人体 m iR32具有高度的相似性。进一步的研究表
明, m iR32沉默受到 P19表达细胞的压抑。同样,
受抗 m iR32细胞控制的核酸低聚核苷酸使子代病
毒的繁殖量增加了一倍,并不是像抗 m iR32细胞所
起的作用一样, 这意味着 m iR32起着直接反病毒
作用。
3. 2. 6 m iRNA调控干细胞的自我更新 自我更新
是干细胞的一个重要特征,从这个层面来说,干细胞
与肿瘤细胞一样都可以持续分裂。因此,如何调节
恰当的细胞分裂, 使其不会因为太少导致组织发生
缺陷,又不至于过分增殖恶化为肿瘤,是干细胞生物
学研究的一个攸关问题。
在多能胚胎干细胞中,有特殊 m iRNA的簇集表
达, 这些 m iRNA明显区别于分化之后的胚胎和成
体 [ 26] , 暗示这些 m iRNA对于干细胞的自我更新具
有一定作用。决定细胞继续增殖还是停止分裂或分
化, 在 G1期由周期依赖性蛋白激酶抑制子 p21所
调控 [ 27]。
有研究者通过使用果蝇胚胎作为模型系统, 证
明了 m iRNA1有助于早期胚胎阶段的心脏祖细胞
(即干细胞 )的决定。m iRNA1有助于维护末期胚
胎阶段中的心脏前体,可以调节心脏细胞的分化机
制。这都说明 m iRNA s调控了干细胞的自我更新。
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 12期
4 m iRNA靶基因预测的方法
尽管数百种 m iRNA在最近几年中被发现了,但
是只有非常少量的 m iRNA被确定其作用,许多其他
的 m iRNA基因的作用还没有被阐明。因此发现
m iRNA的作用靶点成为了解其在不同的生理过程
中的功能的关键。
研究 m iRNA靶基因的传统方法主要有正向遗
传学分析法、反向遗传学分析法、基因克隆等, 应用
这些方法可对基因进行定位。目前, 计算机发展迅
速,还可以用计算机预测和生物学鉴定法,该方法依
据 m iRNA二级发夹结构的基本特性、m iRNA序列
和结构的保守性、发夹结构的动力学稳定性和序列
结构的相似性。利用计算机对各类生物基因组序列
进行搜索,预测潜在的 m iRNA,然后运用 RTPCR或
N orthern试验验证鉴定。M iR scan是由 L im等 [ 28]依
据与已知 m iRNA相似性开发、设计的, 通过该软件
分别在线虫和人类中预测了 35个和 107个新的
m iRNA,其中许多都经过了试验验证。M icroTar是
Thadani等 [ 29]开发的 m iRNA靶基因预测软件, 该软
件同样从 m iRNA和靶基因的互补和 m iRNA靶基因
二聚体热力学稳定性设计算法,和以往此类软件不
同的是, M icroT ar首先计算 mRNA分子内部自由能,
然后计算 m iRNA和靶基因二聚体自由能。如 m iR
NA和靶基因二聚体自由能小于 mRNA分子内部自
由能, 且符合 m iRNA种子序列 ( m iRNA 5#端 1 - 7
nt或 2- 8 nt)和靶基因互补, 然后通过极值分布对
m iRNA靶基因二聚体统计性分析, 从而预测 m iRNA
靶基因。M icroTar同样也不要求靶基因跨物种保
守。除此之外,根据 m iRNA -靶标复合体热力学稳
定性这一特性建立的预测法有 D IANA m icroT[ 30 ]、
P icTar
[ 31]、RNAH ybrid[ 32 ]。
5 结论与展望
虽然对 m iRNA的研究取得了很大的进展, 特别
是 m iRNA在细胞分化、组织发育、基因调节与疾病
调控中的作用,但是目前对 m iRNA的研究仍属于初
始阶段,不少基因还未被发现, 已发现的大多数基因
的功能和作用机制还不清楚, 这极大地限制了 m iR
NA与靶之间对应关系的确认, 使得现有的研究报
道中可能存在较多的假阳性结果。虽然通过缺失或
过量表达可研究某些 m iRNA的功能,但对它们如何
实现时空特异表达以及如何协同调控靶 mRNA仍
然知之甚少。因此, 其在细胞分化、组织发育、基因
调节和疾病调控中的作用, 很多还处于假设推断阶
段。目前主要的工作仍是不断发现新的 m iRNA并
弄清其功能和作用机制,相信随着研究的深入, m iR
NA在动物基因中调控的功能和作用机制将在医
学、兽医学及农业等领域给人类带来更多的福音。
参 考 文 献
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