全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 5期
短蛸 AFLP分子标记分析体系的优化与建立
张龙岗 1, 2 杨建敏1 刘相全1
( 1山东省海洋水产研究所,烟台 264006; 2山东省淡水水产研究所,济南 250117)
摘 要: 本研究构建了短蛸扩增片段长度多态性 ( AFLP )分析体系,对 DNA提取、双酶切反应、连接反应、预扩增反应、
选择性扩增反应和银染等步骤进行了分析。得到了一种适于短蛸 AFLP技术分析的优化体系,该体系中各优化因素为: 模板
DNA浓度为 200 ng /L;酶切体系中,M se I和 EcoR I各加入 5 units, 缓冲液使用 M se I bufferTango, 反应时间为 3- 4 h;连接最
适反应时间为 12 h;预扩增产物最适稀释倍数为 20倍。该体系的构建为 AFLP技术在短蛸分子遗传多样性研究中的应用奠
定了基础。
关键词: AFLP 短蛸 反应体系优化
The Establishment of AFLP Analysis System forOctopus ocellatus
Zhang Longgang
1, 2 Yang Jianm in 1 L iu X iangquan1
(
1
Shandong Marine FisheriesR esearch Institute, Yantai 264006;
2
Fresh Water Fishery R esearch Institute of Shandong Provinc, J inan 250117)
Abstrac:t AFLP ( amp lified fragm ent leng th po lym orphism ) ana ly sis system forO ctopus ocellatus was established in th is study, w ith
the re lative processes be ing presented, inc lud ingDNA ex traction, double enzym es digestion reaction, adapter liga tion reaction, pream pli
fication and selective amp lification reac tions, and argent dye ing. In th is paper, som e factors affecting the AFLP researching sy stem w ere
stud ied and an advanced technica l system was established. The ascerta ined factors in the system inc lude concentration o f tem plate DNA
is 200 ng /L; 5 un its o fM se I and EcoR I are added into d igest system w ithM se I bufferTango and 3- 4 hours is enough to reaction;
the tim e o f ligation shou ld be 12 hours at least; the products o f pream plification are diluted to 20 tim es fo r selectiv e amp lification. The
establishment o f the system m igh t lay a foundation for the app lica tion o f AFLP techniques to the re la tive research o fOctopus ocellatus.
Key words: Amp lified fragment length po lym orphism Octopus ocellatus Advanced techn ica l system
收稿日期: 20091207
基金项目:山东省优秀中青年科学家奖励基金项目 ( 2006BS06010 ) , 山东省科技攻关项目 ( 2006GG2205028 ) , 国家 863!计划项目
( 2007AA09Z433 )
作者简介:张龙岗,研究实习员,主要从事水产动物遗传育种和分子生物学研究; Em ai:l zlg0302@ 163 com
通讯作者:杨建敏,博士,研究员, Em a i:l ladd erup@ 126 com
短蛸 (O ctopus ocellatus )属头足纲, 蛸亚纲, 蛸
科。又称短脚蛸、饭蛸、岩章等, 我国南北沿海均有
分布, 主要群体栖居于温带偏北海域, 在黄、渤海产
量较大,山东的青岛、烟台、威海,辽宁的大连、营口,
河北的乐亭产量较多, 是我国北部沿海蛸类中最重
要的经济种之一 [ 1]。其可食部分在 95%以上, 富含
蛋白质,特别是干制品质地优良、味美, 在医学上还
有补血益气收敛生肌的作用。但是近年来, 由于捕
捞强度的加大和消费需求的增加, 其自然资源严重
衰减。因此,了解短蛸不同群体的遗传结构研究及
优良种质的选育, 开展短蛸人工养殖, 是十分必
要的。
AFLP技术是由荷兰科学家 Zebeau和 Vos[ 2]发
明创建的一种 DNA分子标记新技术, 它结合了
RFLP技术的可靠性和 RAPD技术的高效性,其标记
具有信息量大,多态性丰富, 灵敏度高,快速高效等
优点。AFLP所用的引物具有一定随机引物的特
点, 在不知道基因组 DNA序列信息的前提下, 即可
对酶切片段进行 PCR扩增。目前 AFLP技术在水产
动物群体结构及遗传多样性分析, 遗传连锁图谱构
建, 亲缘关系鉴定, 基因表达调控研究、分子标记辅
助选择等方面经有了广泛的应用 [ 3 - 8 ]。目前对蛸类
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 5期
的遗传信息了解不多的前提下, AFLP技术因所具
有如前所述的种种优点, 将其应用于蛸类的分子标
记分析非常合适,可望在较短的时间内提供大量稳
定可靠的遗传标记。国内尚未见利用 AFLP技术对
短蛸进行分析的报道。本研究参照 Vos等 [ 9]的试验
方法, 建立了短蛸 AFLP分析体系, 并对其各步骤进
行完善,以期为 AFLP技术在短蛸相关研究中的应
用奠定基础。
1 材料与方法
11 材料
试验用短蛸购自烟台水产批发市场, 体重在
50- 150 g,共 30只。活体运回实验室, 取腕部肌
肉和胴体部肌肉于 - 80∀ 保存。试验用内切酶、
Taq酶和引物接头等都购自上海生工生物工程技
术服务有限公司。T4DNA连接酶及 M arker等购自
宝生物工程 (大连 )有限公司。接头及引物序列如
表 1。
12 基因组 DNA提取
短蛸基因组 DNA的提取采用 CTAB法并稍加
改动:取 100mg左右的组织,于离心管内剪碎, 加入
450mL的 CTAB裂解缓冲液。然后加入终浓度为
100mg /mL的蛋白酶 K,在 55∀ 下消化 3 h左右,或
37∀ 消化过夜,直至澄清。加入等体积的苯酚, 抽提
一遍。混匀 10m in后在 12 000 r/m in的离心机上离
心 10m in。取上清液, 加入等体积的苯酚 #异戊醇
( 1#1) , 混匀 10 m in后 12 000 r /m in离心 10 m in。
再取上清液, 加入等体积的异戊醇,混匀, 12 000 r/
m in下离心 10 m in。取上清液, 加入 2倍体积的无
水乙醇 - 20∀ 下沉淀过夜。沉淀后再在 12 000 r/
m in下离心 10m in。倒掉上面的无水乙醇, 用 70%
的酒精洗涤两遍。在无菌操作台上自然晾干。加入
100mL的灭菌水溶解。溶解后加入 RNase A, 终浓
度为20 g /mL, 37∀ 消化 30m in左右。 - 20∀ 下保
存备用。
13 双酶切反应
双酶切反应体系为 40 L, 含有 5 U E coR I, 5
UM se I, 4 L 双酶切反应缓冲液, 1 g基因组
DNA,灭菌双蒸水补足体积至 40 L。酶切在 37∀
进行 3- 4 h, 70∀ 灭活 20 m in, 然后置 4∀ 保存
备用。
表 1 用于 AFLP分析的接头与引物序列
引物 /接头 序列
M se I接头 5∃GACGATGAGTCCTGAG3∃
3∃TACTCAGGACTCAT5∃
M 00 (通用引物 ) GATGAGTCCTGAGTAA
M se I + 1引物: M02 M00 + C
M se I + 3引物: M47 M00 + CAA
M48 M00 + CAC
M49 M 00 + CGA
M50 M 00 + CCT
M51 M 00 + CCA
M54 M00 + CCT
M55 M00 + CGA
M58 M 00 + CGT
M59 M 00 + CTA
M60 M00 + CTC
M61 M 00 + CTG
M62 M00 + CTT
E coR I接头 5∃CTCGTAGACTGCGTACC3∃
3∃CTGACGCATGGTTAA5∃
E00(通用引物 ) GACTGCGTACCAATTC
E coR I + 1引物: E02 E 00 + A
E coR I + 3引物: E32 E 00 + AAC
E33 E00 + AAG
E35 E 00 + ACA
E38 E00 + ACT
E 39 E00 + AGA
E42 E00 + AGT
E 44 E00 + ATC
E 45 E00 + ATG
14 连接反应
在 20 L基因组 DNA酶切反应中加入下列 10
L的混合物: 10 L E coR I接头 ( 5 pmo l) , 10 L
M se I接头 ( 50 pmo l), 10 L 10 mM ATP, 20 L 5
% RLbuffer, 1单位 T4 DNA连接酶, 加无菌蒸馏水
至 10 L。连接反应在 16∀ 连接过夜, ( 8 - 12 h ),
65∀ 灭活 10 m in,反应完成后,产物置 4∀ 保存。
15 预扩增反应
预扩增反应使用带有 1个选择性碱基的引物
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2010年第 5期 张龙岗等:短蛸 AFLP分子标记分析体系的优化与建立
( E02、M02)。体系为 40 L, 含有 4 L连接样品,
75 ngE coR I引物 E02, 75 ngM se I引物 M02, 4 L
10 % PCR 反应缓冲液, 25 mmol /L M gC12, 025
mmo l /L dNTPs, 1 U Taq DNA聚合酶,灭菌双蒸水补
足体积至 40 L。预扩增反应程序: 94∀ 2 m in;
94∀ 30 s, 56∀ 30 s, 72∀ 60 s,共 30个循环。预扩
增产物用 1%琼脂糖凝胶电泳检测,以 DNA M arker
( DL2000)作为对照,根据电泳后凝胶条带的亮度估
计预扩增产物浓度,初步确定稀释倍数。用灭菌双
蒸水分别按 5、10、20、40倍的比例稀释预扩增产物,
作为选择性扩增的模板。
16 选择性扩增反应
选择性扩增反应体系为 20 L,含有 2 L预扩
增稀释产物, 3 mmol /L E coR I引物, 3 mmo l/LM se I
引物, 2 L 10 % PCR反应缓冲液, 2 mmo l/L M gC12,
02mmo l/L dNTPs, 1 U Taq DNA聚合酶,灭菌双蒸
水补足体积至 20 L。选择性扩增反应程序为 94∀
2 m in; 94∀ 30 s, 65∀ 30 s, 72∀ 60 s, 13个循环 (每
循环退火温度降低 07∀ ) ; 13个循环后变为: 94∀
30 s, 56∀ 30 s, 72∀ 60 s, 23个循环。反应产物置
于 4∀ 保存备用。
为检验不同引物组合的选择性扩增效果, 作者
对 E32- E45, M 47- M 62组成的 96对选择性扩增
引物组合进行引物筛选试验, 并对所选 E coR I/M se
I引物组合分别按照 20 L选择性扩增反应体系中
E coR I选择性引物与M se I选择性引物的量 5 ng#5
ng, 5 ng#30 ng, 30 ng#5 ng, 30 ng#30 ng等 4个比例
进行对比试验,以确定合适的选择性引物浓度配比。
17 聚丙烯酰胺凝胶电泳
采用 6%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对选择性
扩增反应产物进行检测。DYY12型电泳仪恒功率
60W预电泳 05 h, 然后将选择性扩增产物加等体
积上样缓冲液 ( 98% 甲酰胺, 10 mmol /L EDTA,
025% 溴酚蓝, 025% 二甲苯氰 )于 95∀ 变性
5 m in,迅速放冰上冷却。然后每个样品取 5 L上
样,恒功率 60W电泳 15- 2 h,待二甲苯氰指示剂
电泳到胶板的 2 /3处后结束电泳。
18 银染
电泳完毕后, 撬下凹板, 将凝胶平板置 10%冰
乙酸中固定 30m in,均匀摇动直至指示剂颜色脱尽;
双蒸水洗涤 3次,每次 2 m in;染色液 ( 15 g硝酸银
溶于 15 L双蒸水,再加 37%甲醛 225 L)中染色
30m in;双蒸水洗涤 1次,不超过 10 s;再转至 4∀ 预
冷的显影液 ( 45 g Na2 CO3, 225 mL 37%甲醛, 300
L硫代硫酸钠溶于 15 L双蒸水 )中显影 5 - 10
m in左右,直至条带清晰;最后用 10%冰乙酸中和显
影液,蒸馏水浸泡洗涤, 自然干燥, 图片扫描到电脑
中保存。
2 结果
21 基因组 DNA
提取的短蛸基因组 DNA经紫外分光光度计测
定,显示 OD260 /OD280的值均在 18- 20之间,凝胶电
泳结果显示基因组 DNA主带清晰, 没有 RNA等污
染,没有明显的拖尾降解现象。表明提取的短蛸基因
组 DNA纯度高, 蛋白质和 RNA含量少,可以用于后
续的 AFLP试验。基因组 DNA电泳结果见图 1。
图 1 短蛸基因组 DNA电泳结果
22 基因组 DNA双酶切结果
AFLP分析酶切为双酶切, 即采用稀有碱基切
点酶和常见碱基切点酶同时进行酶切。本试验采
用 E coR I为 6个碱基切点内切酶, 基因组中切点
数量少, 酶切片段较大,M se I为 4个碱基切点的内
切酶, 基因组中切点数量多, 酶切片段较前者小的
多,一般在 50- 500 bp。同时进行双酶切后, 片段
大小类似 M se& , 同样大多在 50- 500 pb范围内。
基因组 DNA经 E coR I/M se I双酶切后, 产物经琼
脂糖凝胶电泳, 结果显示原基因组 DNA主带消
失,电泳条带呈 Sm ear!状,表明基因组 DNA酶切
完全, 完全可用于连接反应。双酶切后基因组
DNA电泳结果见图 2。每个酶切样品旁边设一个
没有酶切的基因组对照。
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 5期
图 2 基因组 DNA双酶切后电泳结果
23 预扩增结果
本试验采用带有 1个选择性碱基的引物 (MO2
和 EO2)作为预扩增的引物。电泳结果表明, 预扩
增片段范围适中,一般在 100- 1 000 pb范围内,扩
增信号较强,各样品间相对一致。说明本试验预扩
增效果很好,为随后进行的选择性扩增提供了理想
的模板。同时也表明,前面基因组 DNA的提取和双
酶切以及连接也符合要求 (图 3)。
24 选择性扩增结果
241 预扩增产物稀释倍数 对预扩增产物 4个
稀释倍数的选择性扩增效果进行试验,结果表明,稀
释 5倍时所得电泳条带模糊不清, 非特异性条带较
多;稀释 10、20倍均可得到好的扩增效果, 二者差别
不是很大,但以 20倍时更稳定; 稀释 40倍所得电泳
条带信号较弱,不易识别。故而确定预扩增产物最
图 3 部分短蛸个体的预扩增结果
佳稀释倍数为 20倍。
242 引物浓度配比试验结果 引物浓度配比试
验扩增结果表明, 不同引物浓度配比直接影响 PCR
产物的多少。所选 4组引物浓度都能扩增出产物,
但是除 5 ng#5 ng的引物配比组 PCR产物量较少、
染色时间长、背景模糊、条带弱不易识别外,其它组引
物配比都能染出条带, 但是 5 ng#30 ng和30 ng#5 ng
组的条带弱,不稳定。本试验中得出的结果是引物量
30 ng#30 ng得到的指纹图谱更加清晰易辨,所以本试
验选用的引物浓度配比为 30 ng#30 ng, 这和郑红
梅 [ 10]的结果相一致。
243 引物组合筛选结果 从所选 96对引物组合
中筛选出了 6对多态性高; 条带数目适中且分散良
好; 条带清晰的引物组合,分别为 E35M 58, E33M 54,
E39M 54, E42M 58, E44M 60, E44M 61 部 分 结 果
见图 4。
图 4 不同引物组合选择性扩增结果
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2010年第 5期 张龙岗等:短蛸 AFLP分子标记分析体系的优化与建立
3 讨论
31 基因组 DNA
对于 AFLP而言, 模板 DNA制备的好坏直接关
系着试验的成败。短蛸肌肉组织中蛋白含量很高,
约占 808% [ 11] ,因此本试验采用改良的 CTAB法提
取组织 DNA,提取的 DNA产量高, 多糖和蛋白质含
量低。在用琼脂糖凝胶电泳检测时, 发现 DNA条带
整齐、明亮, 无拖尾现象。表明符合 AFLPF分析技
术的要求。
32 双酶切及连接反应
内切酶的种类和酶切效果是决定酶切片段多少
的关键因素。本研究选择四碱基的 E coR I和六碱
基的M se I两种内切酶对短蛸基因组进行酶切, 得
到的酶切片段的大小和数量适合进行 AFLP分析。
在对植物和已发表的水产动物的 AFLP分析中主要
选用 E coR I和M se I [ 12, 13]。试验中, 将酶切时间和
酶浓度各做了梯度对比,发现酶切延长至 4 h, 内切
酶用量为 5U时, 酶切的最完全。连接效率的高低
主要取决于 T4 DNA 连接酶的用量、连接温度及连
接时间等 [ 14]。本研究参考刘相全 [ 15]的方法 T4连
接酶用量 1U,同时把连接反应设在 T4 DNA连接酶
的最适反应温度 16∀ 下进行, 反应时间为连接过
夜,以保证连接充分。另外,双酶切和连接反应分开
进行, 避免了由于限制性内切酶和连接酶对缓冲液
及最佳反应温度的要求不一致带来的不利影响,可
以获得高的酶切及连接效率。连接反应安排在晚上
过夜, 这样不仅能使连接反应有充分的时间,还能最
大限度的节省时间和提高工作效率。
33 预扩增产物稀释倍数
预扩增产物的稀释倍数会对整体试验结果产生
比较大的影响 [ 16]。当预扩增产物稀释倍数较低时,
即选择性扩增模板 DNA浓度较大时, 电泳条带模糊
不清,可能是因为模板 DNA浓度过大造成的非特异
性扩增所致。而稀释倍数较大时, 所得电泳条带信
号弱, 图像发虚。因此,通过试验摸索出一个合适的
预扩增产物稀释倍数十分关键。本试验中, 发现预
扩增产物稀释 20倍时效果最好。据雷永等 [ 17]报
道,预扩增产物的最佳稀释倍数一般在 10- 50倍之
间,不同反应体系有所差异,造成这种差异的可能原
因是预扩及连接的效率不同。
34 引物浓度及浓度配比
不同的引物浓度及浓度配比均会对 PCR反应
的结果产生影响。不合适的引物浓度会造成不对称
扩增或非特异性扩增,二者都有可能造成假阳性或
假阴性结果。因此,选择合适的引物浓度及浓度配
比十分关键。从试验结果看, 20 L选择性扩增体
系中 30 ng的引物量, 1#1(w#w )的 E coR I /M se I选
择性引物浓度配比是合适的, 这与季士治 [ 18]在大菱
鲆中得到的 1#6稍有不同。
35 引物组合对选择性扩增的影响
不同引物组合扩增结果不同,如果基因组 DNA
中与选择性碱基所匹配的位点数较多,则扩增出的
条带的数目就较多;反之则较少。本试验从 96对引
物中筛选出了 6对条带数量适中、条带清晰、多态性
好的引物。如图 4所示, 在相同的选择性扩增体系
中, 采用 E44M 60作引物时扩增出的条带比采用
E35M 58时多。
36 银染过程中常出现的问题及对策
银染过程中,常发现板上出现黄色小斑点,不利
观察,这往往是因为硝酸银没有溶解完全所致,因此
在配制银染液时,要使硝酸银颗粒充分溶解,以免颗
粒嵌入胶中,使板上出现黄色斑点。对于 白板!现
象的出现,这要求由银染液转换至显影液时,中间的
水漂洗时间不宜过长,否则会导致条带模糊甚至消
失, 一般漂洗时间不超过 10 s; 显影时胶板背景颜色
太深,致使条带模糊难以观察,这常与显影时间过长
有关,应待目标条带清晰可辨时, 立即放入固定液中
固定 3 - 5 m in即可。另外,在电泳与染色过程中,
胶的质量好坏同样也影响结果的优劣。其中尿素的
质量是关键因素, 尿素质量不好, 不能使样品 DNA
变性, 产生拖尾现象, 致使条带模糊。在胶的制备
中, 要避免出现气泡, 因为胶中的气泡会使条带变
形, 不利观察。银染过程中发现, 凝胶上部显色快,
下部显色慢。如果把整个胶板完全平放染色则会导
致凝胶上下两部分显色不均一, 容易出现上部显色
过了而下部还没显清楚。为了避免这个问题, 作者
参考并根据实验室条件修改了季士治等 [ 18]的显影
方法,显影时把凝胶上部所在的的染色用托盘一头
用塑料板垫起一个合适的高度, 使塑料托盘倾斜放
置, 利用晃动液体时的冲刷作用对凝胶上部进行显
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 5期
色;而凝胶下部则始终完全浸在显色液中反应。经
过这样改进以后,可以获得背景清晰、显色均匀的凝
胶图像。
4 结论
AFLP技术多态性强,灵敏度高, 稳定可靠。近
几年来, AFLP技术已广泛应用于水生生物的群体
结构及遗传多样性分析、遗传连锁图谱构建、亲缘关
系鉴定、基因表达调控研究等方面。短蛸作为一种
富含高蛋白的水产品,越来越受到群众的喜欢。随
着捕捞强度的增大,其资源量越来越少,了解其遗传
信息,开展人工育苗和养殖将是大势所趋。但至今
对其分子水平研究较少,尚不知其基因组 DNA序列
信息,限制了微卫星等需要利用 DNA序列信息的分
子标记技术的大规模应用; RAPD技术存在重复性
差的问题; RFLP而则费时耗力。AFLP技术无需预
先知道其 DNA序列信息,是目前可以应用于短蛸的
一种较好的分子标记技术。本研究建立了一套稳定
的 AFLP反应体系, 为今后利用该技术开展短蛸的
相关研究奠定了基础。
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