全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·技术与方法· 2008年第 6期
收稿日期：2008-05-08
基金项目：国家自然科学基金项目（30670035），北京市教委科技发展面上项目（KM200510028011）
作者简介：耿伟平（1983-），女，硕士研究生，研究方向：分子细菌学
通讯作者：杨志伟（1967-），女，副教授，硕士生导师；Tel：010-68902327，E-mail：yangzw@mail.cnu.edu.cn
蛋白质组学是指研究一个细胞、一个组织或一
种生物在给定的时期、特殊条件下表达的所有蛋白
质的总和。 蛋白质组远比基因组庞大和复杂，在细
胞增殖、分化、衰老和凋亡等重大生命活动中及外
界环境的刺激下，蛋白质在表达时序、表达量上表
现出很大差异， 出现复杂的连锁反应和级联反应，
所有这些变化皆处于一个相互交错和精密调控的
代谢网络中。蛋白质组学研究通过对生物体内表达
的各种蛋白质进行识别和定量分析，确定它们在细
胞内外的定位、修饰、相互作用和功能，以期获得对
生命本质和活动规律的全景式认识。
微生物蛋白质组学研究进展很快。 自从 1995
年的流感嗜血杆菌基因组测序完成之后 ， 相继有
200 多种微生物的基因组完成了测序，其中大约有
40%是重要的人类病原菌，为进行微生物蛋白质组
学的研究奠定了良好的基础。 在微生物中，基于基
因组、 转录组分析的蛋白质全谱研究已有成功报
道，采用微生物材料进行蛋白质组学研究具有一些
显而易见的优势。 微生物结构简单，易于培养和处
理，突变株容易获得；基因组相对较小，许多微生物
已完成基因组测序，很多哺乳动物代谢过程中所需
基因在微生物体系中也是保守的，因此微生物是研
究蛋白质网络体系的理想模式生物。
1 研究策略和技术
1.1 自上而下蛋白质组学分析（Top-down）
Top-down 利用高分辨质谱直接对完整蛋白质
进行研究，且在质谱分析前不需要对蛋白质进行酶
解，从而有利于蛋白质的一级结构和蛋白质修饰的
分析。目前，此方法已经成功地用于确定 Bacillus 芽
孢的起源 [1]及 Enterobacter skazakii 病原性生物标记
的研究 [2]。 这一方法的局限性在于对于不易离子化
和分子量大于 60kD 的蛋白质很难精确测定。
蛋白质组学分析技术在微生物研究中的应用
耿伟平 吴晨紫 杨志伟
（首都师范大学生命科学学院，北京 100048）
摘 要： 随着后基因组时代的到来，蛋白质组学分析为研究微生物的生命活动和细胞功能提供了一个广阔的视
角。综述了大规模分析微生物蛋白质组的策略和方法，包括自上而下的蛋白质组学分析、自下而上的蛋白质组学分析、蛋
白质组定量分析技术、蛋白质修饰研究方法和蛋白质芯片技术。最后，对沙门氏菌蛋白质组学的研究进展进行了简要介
绍。
关键词： 微生物 蛋白质组学 鼠伤寒沙门氏菌
Application of Proteomic Techniques in Microbial Research
Geng Weiping Wu Chenzi Yang Zhiwei
（College of Life Sciences，Capital Normal University，Beijing 100048）
Abstract： With the coming of the post genomic era，proteomics analysis provides a wide platform into
understanding cellular processes and function of microorganisms. This review gave a brief overview on proteomic
techniques for the large scale analysis of microorganisms，including top-down analysis，b ttom-up analysis，quantifiable
expressional analysis，methods for analyzing protein modifications and protein chips. Finally，current progress on a microbial
proteomics case study within the Salmonella was also described.
Key words： Microorganism Proteomics Salmonella typhimurium
2008年第 6期
1.2 自下而上蛋白质组学分析（Bottom-up）
这种方法首先将蛋白质样品经过凝胶电泳或
液相色谱进行分离， 经酶解消化后进行质谱分析。
常用技术路线有 3 条， 即双向电泳-质谱、 多维色
谱-质谱和毛细管电泳-质谱分析。
1.2.1 双向电泳-质谱技术 迄今，双向凝胶电泳技
术 （2D-PAGE） 是最常用的蛋白质组学分析技术。
2D-PAGE 能够在一块胶上得到 10 000 个蛋白质 。
通常第一向利用等电点进行分离蛋白，第二向利用
分子量进行分离。 2D-PAGE 一般对于 pI3~10，分子
量 10~200kD 的蛋白能够较好分离。 2D-PAGE 的明
显缺陷是：（1）对于疏水性蛋白质（包括膜蛋白）、分
子量极大或极小的蛋白质、极酸或极碱的蛋白质不
能很好分离；（2）某些样品因表达丰度低，在 2D 胶
上无法观察到；（3） 蛋白质点从胶上切离和水解等
工作比较费时、费力，且难于与质谱联用实现自动
化。
传统的 2D-PAGE 比较一般需要 2 块凝胶 ，而
且因上样、胶条转移、染色等人为差异可能导致分
析误差，克服这些问题最有效的方法就是在一块胶
上分析不同的蛋白质样品。而荧光双向差异凝胶电
泳法 （Fluorescence Two-Dimensional Differential Gel
Electrophoresis，DIGE）可以达到这一要求。将待比较
的蛋白质样品预先经不同的荧光染料 ， 如 Cy2，
Cy3，Cy5 标记（其中 Cy2 作为用 Cy3、Cy5 标记蛋白
质的内标），然后等量混合进行电泳，蛋白质之间的
差异可以通过蛋白质斑点不同荧光信号的比率来
决定，因此，可以直接从一张胶图上得到差异点。该
方法可以检测到 100～200pg 的蛋白质，提高了定量
准确性。
1.2.2 色谱-质谱联用技术 色谱质谱联用技术近
几年发展迅速。 与双向电泳相比，色谱质谱联用技
术提高了对极端 pI 蛋白质、 膜蛋白和低丰度蛋白
质鉴定的准确性，同时实现了仪器的自动化 ，提高
了分析的通量。
“鸟枪法”（Short gun） 是一种十分经典的分析
蛋白质表达谱的方法，基本技术路线是直接对全蛋
白混合物酶解（不需对每个蛋白质纯化），然后对肽
混合物进行多维毛细管液相色谱分离和串联质谱
分析以及数据库检索，从而确定细胞中绝大部分蛋
白质的种类。 “鸟枪法 ”又包括 LC-MS/MS，MudPIT
等技术。
多维蛋白质鉴定技术 （Multidimensional Protein
Identification Technology，MUDPIT） 是具有高分辨力
的多维液相色谱 （LC/LC，2D-LC）、 串联质谱（MS/
MS）以及相关数据库分析软件的结合。 整个系统以
自动化的模式运行， 短时间内可完成高通量分析。
该方法早期已经成功应用于酿酒酵母核糖体蛋白
质的分析 ，在 1 次 （24h）试验中鉴定出 100 多个蛋
白质。 之后，Washburn等[3]利用这一技术在 1次（27h）
操作中从酿酒酵母蛋白质组鉴定了 1 484 个蛋白
质。
1.2.3 毛细管电泳-质谱联用 （CE-MS） 二维毛细
管电泳（2D-CE）、液相色谱-毛细管电泳（LC-CE）等
新型分离技术与 MS 的结合，日益成为分析微量蛋
白质样品的强有力工具 [4]。 毛细管电泳技术兼有高
压电泳及高效液相色谱等优点，其突出特点是所需
样品量少（30nl）、分离度高、分析速度快。
1.3 蛋白质组定量分析技术
确定微生物系统中蛋白表达的定量变化依然
是蛋白表达谱分析的根本要求。目前常用的方法包
括无标记的 emPAI、依赖标记的 ICAT、iTRAQ、代谢
标记以及 DIGE。
1.3.1 emPAI（Exponentially Modified Protein Abunda
nce Index） emPAI 是一种用来估计样品中绝对蛋
白质丰度的无标签方法。通过蛋白的鉴定肽段数与
理论酶切肽段数的比值来反映蛋白丰度的高低，可
用于分析 LC-MS /MS 中得到的肽段定量数据。但由
于有些肽段不容易离子化，其检测丰度低于真实丰
度。 对较低丰度的肽段，依赖数据的检测模式使得
当高丰度肽段和低丰度肽段共同洗脱时，低丰度肽
段不易检测出来 [5]。
1.3.2 ICAT （Isotope Coded Affinity Tagging） Gygi
等 [6]首次利用 ICAT 研究了酿酒酵母在以半乳糖或
乙醇为碳源时，代谢酶的表达差异。 ICAT 是一类能
够特异性地与半胱氨酸残基相互作用的试剂，具有
一个同位素标记的连结子区域 （轻型 H8 或重型
D8）， 一个生物素亲和标签和一个巯基特异的反应
基团 ，第 2 代 ICAT 试剂 （cleavable ICAT，cICAT）在
连接子和生物素标签之间引入酸剪切位点，可在质
耿伟平等：蛋白质组学分析技术在微生物研究中的应用 61
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2008年第 6期
谱分析前去除亲和标签，提高了分析灵敏度 ；同位
素标记改为轻型 C12、重型 C13，以克服差异洗脱的
问题。 ICAT 法的基本步骤：将 2 种蛋白质样品分别
用轻型 H8 或重型 D8 标记， 之后混合 2 种样品，酶
解，通过亲和层析收集标记蛋白 ，然后进行 LC-MS
分析。 ICAT 的缺点是无法标记不含 Cys 的蛋白质，
在酵母菌中约有 8%的蛋白质不含 Cys， 细菌蛋白
质的平均半胱氨酸含量也非常低， 且有 50%~60%
的蛋白质不含或只含有 1~2 个半胱氨酸，这样不利
于一些蛋白质的定量分析。
1.3.3 iTRAQ（Isobaric Tag for Relative and Absolute
Quantification） Ross 等 [7]利用 iTRAQ 成功地比较
分析了野生型和突变型酿酒酵母全蛋白质的表达。
iTRAQ 包括一组（4 或 8 种）同量的胺活性试剂，每
一种胺活性试剂由一个胺专一的反应基团、一个平
衡基团和一个报告基团组成。 iTRAQ 的一般操作程
序如下：首先酶解蛋白质，然后用 iTRAQ 试剂进行
差异标记，再将标记的样品混合，采用 MudPIT 技术
进行分析。同 ICAT 相比，iTRAQ 试剂具有以下几个
优点：（1）可以同时标记 4 种，甚至 8 种不同的蛋白
质样品；（2） 可标记任何含有自由氨基的肽段，而
ICAT 只能标记含有半胱氨酸蛋白质 。 ICAT 和
iTRAQ 技术的共同缺陷在于只能对相对丰度进行
比较。
1.3.4 代谢标签 （Metabolic Labeling） 代谢标签
法是一种最全面的研究微生物蛋白质组的方法。最
简单的例子是研究正常和胁迫条件下蛋白质表达
的差异， 首先在含有 N15 和 N14 的培养基上分别培
养两种不同条件下的微生物，然后测量 2 种条件下
被标记的蛋白质中 N14 和 N15 的比率， 从而可分析
蛋白质表达水平的变化。 Washburn[8]等人用将此法
成功地用于酿酒酵母的研究。也可以选择其他同位
素，例如重氢和 C13 标记蛋白质。此法能将待分析的
细胞或生物体在蛋白提取之前合并，因此能够排除
蛋白提取过程本身的差异。
1.4 蛋白质修饰的研究方法
目前已报道 200 多种翻译后修饰，绝大多数在
真核生物中发现。 其中，蛋白质磷酸化是一种关键
的翻译后修饰，磷酸化级联反应在真核系统中非常
广泛 ，在原核生物中也十分常见，最典型的是细菌
的双组分信号转导系统中的磷酸化级联反应。
1.4.1 蛋白质磷酸化的方法 [9，10] （1）2D-PAGE 平
行图谱法：磷酸化蛋白质会发生 pI 的改变，因此在
2D-PAGE 胶上， 磷酸化蛋白质和源蛋白质一般会
在水平或垂直方向排列成一串蛋白点。磷酸化蛋白
质由于负电荷增加，会移向更为酸性的区域。 然后
采用顺序显色技术，先用 Pro QTM Diamond 使磷酸
化蛋白显色， 拍照后用 Sypro Ruby 使全蛋白显色，
重新拍照，再分析 2 张谱图。 另外一种有用的方法
是， 采用化学或酶解法去除磷酸基团 ， 然后进行
2D-PAGE，与未处理前相比，去除磷酸基团后，磷酸
化的蛋白点将会从胶上消失。 （2）将放射性同位素
标记的正磷酸盐参入蛋白质中， 通过 2D-PAGE 和
放射自显影鉴定。 这种方法缺陷在于，只能在活体
内进行，而且 DNA 和 RNA 会产生背景干扰。 （3）在
体外，可利用磷酰特异性抗体对磷酸化蛋白点进行
免疫鉴定。 抗体识别磷酰酪氨酸效果非常好，但是
识别磷酰丝氨酸和磷酰苏氨酸的效果较差。 （4）各
种色谱-质谱联用技术已经用于鉴定多肽和蛋白质
的磷酸化位点。但存在的问题是磷酸化蛋白质一般
丰度很低且不易离子化 [11]。
1.4.2 磷酸化蛋白质的富集方法 通常采用免疫
沉淀法，即利用抗体直接结合磷酸化酪氨酸。 磷酸
化肽段的富集可采用固定金属亲和层析 （IMAC）、
石墨或氧化钛柱层析等。 Ficarro 等 [12]利用 IMAC 富
集酿酒酵母的磷酸化肽段 ， 经过 nanoflow HPLC-
ESI-MS 进行分析， 检测到 1 000 多个磷酸化肽段，
并鉴定了位于 216 个肽段上的 383 个磷酸化位点。
1.5 蛋白质芯片技术
蛋白质芯片技术是一种高通量 、微型化 、自动
化的蛋白质分析技术，大致可分为 2 类，一类是以
色谱原理设计的蛋白质芯片，芯片上的介质可通过
疏水力、静电力、金属螯合力等与待测样品中蛋白
质非特异性结合， 代表技术为 SELDI- TOF- MS 技
术 （表面增强激光解吸电离-飞行时间质谱 ）；另一
类是将生物活性分子（抗体、配体、核酸等），甚至活
生物体（细菌、酵母等），结合到芯片表面，来捕获样
品中感兴趣的靶蛋白。通过蛋白质芯片和质谱分析
相结合，可对样品中 fmol（10-15）级的蛋白质进行分
子量和丰度鉴定。 但蛋白质芯片及相关试剂较昂
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贵，限制了该技术大规模的应用。另一方面，由于样
品分析的多样化和复杂性，需要经验丰富的研究人
员。
SELDI-TOF-MS 技术已在艾滋病 、SARS、 兔热
菌、鼠疫杆菌、分支杆菌等病原微生物的特异性抗
原方面得到广泛应用。 此外，在研究结肠细菌微生
态系统中乳糖不耐症产生的代谢途径，He 等 [13]利用
SELDI-TOF-MS 研究了双歧杆菌在以不同碳源 （乳
糖、 葡萄糖、 半乳糖） 生长时蛋白质表达的差异。
Bouffartigues 等 [14]利用 SPR-LC-MS 和 SELDI-TOF-MS
研究可被 DNA 分子表面捕捉的蛋白质， 为研究生
物大分子之间的相互作用提供了一种研究思路。
2 沙门氏菌（Salmonella）蛋白质组学研究
沙门氏菌属肠杆菌科，为革兰氏阴性杆菌。 菌
型繁多，具有 2 000 种以上的血清型。 代表种有伤
寒沙门氏菌（S. typhi），鼠伤寒沙门氏菌（S. typhjimu
rium），S. Enteritidis 等。 许多沙门氏菌是病原菌，据
统计沙门氏菌每年造成全球约 1 600 万感染病例 ，
其中 60 万例死亡。 由于其致病机理复杂， 临床分
型、治疗都较为困难，因此，对沙门氏菌基因组和蛋
白质组进行解析，可以为基础和临床研究提供重要
的生物信息数据，并为预防、诊断和治疗打下基础。
目前，沙门氏菌已完成测序的有 12 种，包括 S.
typhi Ty2、CT18；S. typhjimurium LT2、SL1344；S. En-
teritidis PT4；Salmonella bongori 1249 等 。 其 中 S.
typhjimurium LT2 基因组全长 4 857kb， 具有 4 330
个开放阅读框，是一个广泛用于微生物遗传和分子
生物学研究的模式菌株 [15]。
在蛋白质组学分析方面 ，Ansong 等 [16]采用 LC-
MS 第一次大规模鉴定了对数期、 静止期和低 pH/
低 Mn 条件下 S. typhi Ty2 的蛋白质组，总共鉴定了
2 066 个蛋白质 。 为了找到 S. typhi 专一的毒性因
子， 他们将获得的数据与 S. typhimurium LT2 蛋白
质相比较， 发现在 S. typhi Ty2 存在一组高表达蛋
白，包括 CdtB，HlyE 等，并推测这些蛋白与 S. typhi
的病原性和宿主专一性有关。
采集被鼠伤寒沙门氏菌 （S. typjimurium，STM）
感染的小鼠巨噬细胞，并利用 LC-FT-MS 技术对巨
噬细胞中的 STM 蛋白进行检测，发现有 39 种蛋白
质的数量在繁殖和侵染过程中明显上升，其中包括
STM 3117 和 STM3118-3119。 敲除编码 STM3117 蛋
白的基因后，STM 在巨噬细胞中的繁殖能力丧失 ，
而 STM 3118-3119 参与了细胞壁肽聚糖的合成和
修饰 [17]。 以上结果为寻找新的毒力基因、探究病原
菌和宿主相互关系提供了信息，对于病原菌的诊断
治疗和疫苗开发具有重要意义。
鼠伤寒沙门氏菌的抗生素抗性研究也是人们
关注热点。 S. typhimurium SL1344 在用氟喹诺酮类
（fluoroquinolone） 抗生素处理后 ，HPLC-MS 鉴定显
示 ，在 SL1344 中 17 个蛋白质上调 ，其中 F1F0-ATP
合酶 ，TolC and Imp 上调 8 倍 ； 在多抗性 （multiple
antibiotic resistant，MAR）菌株中，43 个蛋白质上调，
包括 AcrAB/TolC 外排泵 。 这些结果表明 ，AcrAB/
TolC 与抗生素抗性增强有关， 而 F1F0-ATP 合酶和
Imp 表达的提高只是针对氟喹诺酮产生的反应 [18]。
胁迫条件下鼠伤寒沙门氏菌蛋白质组的研究
也十分活跃。 CadC 是一个酸耐受反应的转录激活
因子。采用 2DE-MALDI-MS 分析手段，Lee 等 [19]研究
了 8 种 CadC 诱导的蛋白和 15 种 CadC 阻遏产生的
蛋白。前者包括膜孔蛋白 OmpC 和 OmpF，后者包括
参与酵解、 产能过程等的蛋白质。 结果表明，CadC
是酸适应过程 OmpR 系统的全局调控因子。
本实验室以鼠伤寒沙门氏菌 purR 超阻遏突变
体 （TT12306 诱变株） 为材料 ， 采用 2DE-MALDI-
TOF- MS 分析手段，研究超阻遏现象产生的遗传背
景，并研究在营养胁迫条件下，鼠伤寒沙门氏菌适
应突变（又称胁迫诱导突变，静止期突变）在蛋白质
表达水平发生的变化，以期找到与适应突变发生相
关的蛋白质因子 [20，21]。
3 展望
蛋白质组的研究依赖于基因组 DNA 测序的结
果 ， 但同时也可以对其结果起到修正和补充的作
用。 在未来的几年内，2DE 有可能逐渐从目前蛋白
质组的主导技术逐渐退至非主流，取而代之的将是
具有高分辨率和高通量的分析技术 ， 例如多维色
谱，毛细管电色谱，毛细管电泳，蛋白质芯片技术以
及各种技术的匹配使用；精确质谱分析将会变得更
加重要。 随着多种标记化合物的发明，一种或多种
标准化的蛋白质组定量方法必将出现。同基因组测
序一样，蛋白质组定量方法将朝着全自动操作的方
耿伟平等：蛋白质组学分析技术在微生物研究中的应用 63
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2008年第 6期
（上接第 59页）
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向发展。 微生物是系统生物学研究的理想候选者，
系统微生物领域的发展有望带动生命科学研究中
具有普遍适用性工具和技术的发展。对于模式微生
物蛋白质组学的研究将为原核生物及真核生物提
供一个研究基因和基因组功能的平台。
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