全 文 ：生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 4 期
抗生链霉菌(Streptomyces antibioticus)产吩噁嗪酮
合成酶基因的重组表达
谢迎春 贾红华 谢柏盛 朱清禾 贾丽莎 韦萍
(南京工业大学生物与制药工程学院，南京 210009)
摘 要: 从抗生链霉菌(Streptomyces antibioticus)中提取出目的基因 phs ，构建基于质粒 pET28a 的诱导型表
达载体 pET28a-phs。以 E． coli 为表达宿主，将重组质粒转化入宿主菌之后获得能够高效表达吩噁嗪酮合成酶
(PHS)的重组菌，经 SDS-PAGE 验证在 72. 1 kD 处有明显蛋白条带。通过调整可能影响表达的参数获得 PHS 在大
肠杆菌中的最优表达条件。最终优化后的表达条件是最适 Cu2 +浓度为 1. 5 mmol /L，最适细菌培养温度为 37℃，最
适 pH 值为 7. 0，在 OD600为 0. 6，时加入终浓度为 1. 0 mmol /L 的 IPTG 为最佳诱导条件，30℃诱导 16 h 为最佳诱导
时间。
关键词: 漆酶 吩噁嗪酮合成酶 表达
Optimization of the Expression of Phenoxazinone Synthase
from Streptomyces antibioticus
Xie Yingchun Jia Honghua Xie Baisheng Zhu Qinghe Jia Lisha Wei Ping
(Biotechnology and Pharmaceutical Engineering，Nanjing University of Technology，Nanjing 210009)
Abstract: It was to optimize and increase the expression of per unit of laccase in E． coli expression system BL21． Laccase-depend-
ent Phenoxazinone synthase(phs)from Streptomyces antibioticus was cloned into Escherichia coli and expressed，through constructing the
recombinant plasmid pET-phs，which was then translated into the host E． coli BL21． Furthermore． expression of PHS protein with 72. 1
kD was detected by SDS-PAGE． Factors which might effect the expression were optimized on the basis of process． The optimal parameter
of expressing laccase is:culture the E． coli with the recombinant in 37℃ pH 7. 0 LB culture medium with Cu2 + 1. 5 mmol /L by using
horizontal swing bed 180 r /min． While OD600 goes to 0. 6 adding IPTG to final concentration 1. 0 mmol /L，collects the bacterial precipi-
tation by centrifugation after the E． coli has been induced for 16 hours in 30℃ ．
Key words: Laccase PHS Overexpression
收稿日期:2010-10-13
基金项目:国家自然科学基金资助项目(20906048)
作者简介:谢迎春，女，硕士研究生，研究方向:分子生物学;E-mail:ziling958@ sohu． com
通讯作者:贾红华，讲师，E-mail:hhjia@ njut． edu． cn
漆酶(Laccase． EC 1. 10. 3. 2)作为含铜的多酚
氧化酶，与植物中的抗坏血酸氧化酶、哺乳动物中的
血浆铜蓝蛋白同属蓝色多酮氧化酶家族。迄今为
止，已发现漆酶广泛存在于自然界的植物、真菌及原
核生物中［1 － 4］。吩噁嗪酮合成酶(Phenoxazinone
synthase，以下简称 PHS)［5］是催化放线菌素 D 生物
合成最后一步的一种多铜氧化酶［6］，按催化特性属
于细菌漆酶类。由于吩噁嗪酮类化合物具有抗菌、
抗炎及抗肿瘤活性，以及因含有发色团而可能用作
染料等潜在应用前景，使得 PHS 作为可专一性催化
合成吩噁嗪酮的重要生物催化剂，激起了人们的
兴趣。
目前，关于细菌漆酶的研究主要集中于国
外［7］。1984 年 George 首次报道 S． antibioticus 产漆
酶，并在 Streptomyces lividans 中成功表达［8］。此后
又先后在 S． lavendulae 、S． griseus、Bacillus subtilis、
2011 年第 4 期 谢迎春等:抗生链霉菌(Streptomyces antibioticus)产吩噁嗪酮合成酶基因的重组表达
Oceanobacillus iheyensis 等发现漆酶。相对而言，国
内在此领域则显得较为滞后，相关研究较少，链霉
菌属中尤其是关于 S． antibioticus 产漆酶的报道几
乎没有。本研究利用抗生链霉菌(S． antibioticus)
产出 PHS，并在大肠杆菌中成功表达在国内尚属
首次，通过改变诱导环境获得较优的表达条件［9］，
旨在提高酶产量，为细菌漆酶的生产提供了新的
途径。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 菌株及载体 试验中所用菌株 E． coli BL21
(DE3)、载体 pET-28a 为实验室保存。
1. 1. 2 主要试剂 异丙基硫代-β-D-半乳糖苷
(IPTG)、卡那霉素均购自 Merck 公司;DNA Marker
购于宝生物(大连)生物工程有限公司(TaKaRa) ;
PCR引物由英潍捷基(上海)公司合成;其余试剂和
药品均为进口或国产分析纯。
1. 1. 3 培养基 LB培养基:蛋白胨 1%、酵母提取
物 0. 5%、NaCl 1% (固体培养基需另加入琼脂
粉 2%)。
1. 2 方法
1. 2. 1 phs基因的扩增 根据 GenBank 上公布的
序列，设计扩增 phs 基因的两条引物。引物 1:5-
GGATATCCATATGATCGAGCAGAGCGA-3(下划线
部分为 Nde I 酶切位点) ;引物 2:5-CGGAAT-
TCTCAGCCCGTGTGACC-3(下划线部分为 EcoR I
酶切位点)。通过 PCR方法扩增出目的基因两端带
有不同酶切位点的 DNA 片段。PCR 反应条件为:
96℃ 预变性 4 min，再按下列参数进行循环反应，
96℃ 变性 30 s，52 － 58℃ 1 min，72 ℃ 延伸 4 min，
31 个循环，结束反应。
1. 2. 2 基因克隆和载体构建 将扩增出的 phs 基
因经测序确定基因的正确性，经过双酶切克隆到载
体 pET28a上，构建重组质粒 pET-phs。按分子克隆
手册上方法(CaCl2法)将重组质粒转化入宿主 E．
coli BL21(DE3)中。
1. 2. 3 细菌漆酶的表达 将含有阳性克隆的菌
株挑取单菌落接种 5 mL 含卡纳霉素 30 mg /L 的
LB 液体培养基，37 ℃，180 r /min 过夜培养后，按
1 ∶ 50 接种量接种至新鲜 LB 培养基 50 mL 中，
37℃，180 r /min 培养至 OD600到 0. 4 － 1 时(最好
0. 6) ，加入终浓度为 1 mmol /L IPTG 进行诱导。
1. 2. 4 粗酶液制备 取经诱导的菌液离心(4℃，
8 000 r /min，15 min) ，弃上清，用 1 /25 培养基体积
的缓冲液(1 mol /L Tris-HCl缓冲 pH7. 0)重悬，超声
破碎细胞，4℃，8 000 r /min 离心 15 min，收集上清，
即为粗酶液。
1. 2. 5 酶活测定 将制备好的粗酶液加入到 4. 5
mL 反应体系中(2 mL 1 mmol /L 儿茶酚，2 mL 0. 05
mol /L醋酸缓冲 pH6. 0) ，室温反应 3 min，在 450
nm 处测定吸光值的上升［10］。酶活单位定义为 1
min 内氧化 1 mol 邻苯二酚生成产物需要的酶量。
1. 2. 6 SDS-PAGE 检测表达产物 取诱导后的菌
液超声破碎后，离心取上清进行 SDS-PAGE，测定
phs基因的表达量。考马斯亮蓝 R250 染色，脱
色至条带能清晰可见，采用凝胶成像系统分析、拍
照。
1. 2. 7 优化表达条件 成功表达后，分别考查下列
可能影响表达的参数，同时固定其他参数，挑选每个
参数的最适值。每个试验重复 3 次。诱导表达后，
处理样本进行电泳(下同)。pH 的最适值:调整原
有试验方案的 LB 培养液 pH 分别为 6. 0、6. 5、7. 0、
7. 5 和 8. 0，其他条件不变。OD600的最适值:调整原
有试验方案的 OD600分别为 0. 2、0. 4、0. 6、0. 8 和
1. 0。IPTG 终浓度的最适值:调整原有试验方案的
IPTG 终浓度分别为 0. 2、0. 5、0. 7、1. 0 和 2. 0
mmol /L。诱导时间和诱导温度的最适值:调整原有
试验方案的诱导温度 20℃、24℃、30℃、34℃ 和
37℃，调整原有试验方案的诱导时间分别为 5 、8 、
12 、16 和 20 h;以及铜离子浓度分别为 0、0. 5、1. 0、
1. 5 和2. 0 mmol /L。
2 结果与讨论
2. 1 重组质粒 pET-phs的构建
按照方法 1. 2. 1 和 1. 2. 2 扩增出 phs 基因，
PCR 扩增后电泳检测发现，在 1 973 bp 左右有 1 条
明显条带，这与报道的 phs 序列大小一致(图 1)。
然后构建重组质粒 pET-phs(图 2)。
2. 2 酶活性测定
对于本试验中漆酶的活性测定采用的是分
光光度法［11］，采用底物为儿茶酚，可能在反应的
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过程中除去醌类，还生成了其他的聚合物，而在
450 nm 处只测定了产物醌类物质的数量计算
酶活。
2. 3 SDS-PAGE蛋白电泳检测表达产物
将经诱导后的重组菌 BL21 /pET-phs 破碎后取
上清进行 SDS-PAGE，同时以未经诱导的重组菌作
为对照。从图 3 看出，经诱导后的重细菌 BL21 /
pET-phs 在分子量 72 kD 左右处有一明显条带，这
与 PHS的分子量大小一致，说明 PHS 在大肠杆菌
BL2(DE3)中已成功表达。
1．标品;2，3．扩增后的 phs
图 1 PCR扩增后的 phs
1．标品;2．空载体;3． pET-phs
图 2 重组质粒鉴定
1．蛋白质标准品;2-7． pET-phs + IPTG
图 3 SGS-PAG蛋白
2. 4 优化表达条件［9］
2. 4. 1 温度对酶活性的影响 在 20℃、24℃、
30℃、34℃和 37℃ 温度条件下诱导产酶 16 h，由图
4 可以看出 37℃ 时酶活较低，说明可溶性蛋白的表
达量极低，而较低的温度(30℃)酶活相对较高，这
说明 30℃ 有利于可溶性蛋白的表达，这是可能是由
于 37℃ 生长常常会使一些蛋白累积形成包涵体，而
可溶性蛋白的表达减少。诱导温度除了影响氧的溶
解度以外还从两个方面影响酶促反应的速率。一方
面，升高温度增加底物分子的热能，从而增加酶反应
活性。另一方面，升高温度增加酶本身蛋白结构的分
子热能的同时增加了多重弱的非共价键的互相作用
而破裂的机会，破坏酶的三维结构，导致酶失活。
2. 4. 2 pH 值对酶活性的影响 用 pH分别为 6. 0、
6. 5、7. 0、7. 5 和 8. 0 温度为 37℃ 条件下培养相同
的时间至 OD600为 0. 4 － 1，然后在温度为 30℃ 条件
下诱导产酶 16 h，从图 5 可以看出在 pH7. 0 时酶活
最高。pH 值过低或过高会影响酶分子的构象，致使
酶不稳定从而失活。本试验中的漆酶由抗性链霉
菌产出，与真菌相比，细菌产漆酶具有 PH 值范围
较广的优势，一般真菌产漆酶的最适 pH值范围在
4 － 6 之间，本试验结果显示最适 pH 值为 7. 0，这与
之前的结论相符。
图 4 不同温度下产酶曲线
图 5 不同 pH下产酶曲线
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2011 年第 4 期 谢迎春等:抗生链霉菌(Streptomyces antibioticus)产吩噁嗪酮合成酶基因的重组表达
2. 4. 3 诱导起始 OD 对酶活性的影响 在培养菌
液 OD600值为 0. 2、0. 4、0. 6、0. 8、1. 0，30℃ 条件下进
行诱导产酶 16 h，从图 6可以看出，在 OD600值为 0. 6
时酶活最高。当 OD600小于 0. 6 时，因为外源基因的
表达是采用的强启动子，过早的诱导，菌体吸收的营
养都用于表达外源蛋白，会严重影响它的繁殖，会减
少菌体总量与外源蛋白的表达量;大于 0. 6 时，虽然
可以提高菌体的产量，但减少了外源基因的表达时
间，当 OD600值达到 0. 6 时，此时的菌种密度正好也达
到了对数生长期，是产酶的最佳时期，菌体生长旺盛，
增殖快，对诱导表达而言，会有一个比较好的收率。
图 6 不同 OD600值下产酶曲线
2. 4. 4 IPTG对重组菌产酶的影响 在培养菌液中
分别加入诱导剂 IPTG 使其浓度为 0. 2、0. 5、0. 7、
1. 0 及 2 mmol /L，温度 30℃ 条件下进行诱导，从图
7 可以看出，在 IPTG 浓度为 1. 0 mmol /L 时酶活最
高。IPTG的浓度对目的蛋白产量的影响较大，浓度
过低，会使诱导效率降低，但其浓度过高，则可能会
因为对宿主菌的强烈毒性作用而抑制了细菌自身的
生长繁殖，从而使目的蛋白的产量降低。
图 7 不同 ITPG浓度下产酶曲线
2. 4. 5 Cu2 +对酶活性的影响 用 Cu2 +浓度分别为
0、0. 5、0. 7、1. 0 和 1. 5 mmol /L，温度为 37℃ 条件下
培养相同的时间至 OD600为 0. 4 － 1，然后在温度为
30℃ 条件下诱导产酶 16 h，Cu2 +作为漆酶的辅机因
子，对漆酶的活性是必不可少的［12］，从图 8 可以看
出，在 Cu2 +浓度 1. 5 mmol /L 时酶活最高，当浓度过
高时，Cu2 +会抑制酶的活性，考虑可能是因为 Cu2 +
过多地结合到酶的活性中心，影响了底物与酶的
结合。
图 8 不同 Cu2 +浓度下产酶曲线
2. 4. 6 诱导时间对酶活性的影响 在温度 30℃，
诱导时间为 5、8、12、16 和 20 h 条件下进行诱导产
酶，从图 9 可以看出，在诱导时间为 16 h 时酶活最
高。诱导时间是蛋白表达与降解的一个平衡点，诱
导剂加入后，细菌基本停止生长。由图 9 可以看出，
一定时期内蛋白表达达到最高峰，其后表达量不再
增加，却因不断降解而使产量减少。
图 9 不同诱导时间下产酶曲线
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 4 期
本试验通过获取目的基因，构建基于质粒 pET28a
的重组质粒，并成功在大肠杆菌 BL21(DE3)中表
达，并对其表达条件进行优化。基因的表达受很多
影响因素的影响，它不仅涉及到宿主、载体和外源
基因三者之间关系的影响，同时还有很多外界条
件的影响。我们通过改变一个因素同时固定其
他参数的方法进行最优条件的选择，最终确定的
最佳表达条件是培养基 pH 值 7. 0、Cu2 + 浓度
1. 5 mmol /L、诱导温度 30℃、IPTG 诱导浓度 1
mmol /L、菌体生长密度 OD600达到 0. 6 时加入
IPTG、诱导时间为 16 h。上述研究，为细菌型漆
酶基因工程菌的生产工艺研究提供了可靠的试
验数据。
3 展望
漆酶自发现至今已有很久的历史，但是目前国
内对于细菌漆酶的研究相对于真菌还比较少。根
据细菌漆酶相对于真菌漆酶具有众多优势，在碱
性废水处理、环境保护、食品工业等工业都会有更
大的应用前景。在今后的研究中，以细菌漆酶基
因的结构、功能及表达与调控机制为基础，筛选并
改造细菌漆酶高产菌株的同时，加强漆酶毒理学
研究，可确保其作为食品添加剂的安全稳定性。
此外，进行细菌漆酶的固定化研究，可提高稳定性
和催化效率，使酶能够重复利用，降低酶促成本。
在以后的研究中，可以通过优化表达体系，筛选更
为适合的克隆表达条件，最终提高酶的产量及其
活性，为产漆酶高效工程菌株的构建、漆酶的工业
化生产技术提供技术平台。
参 考 文 献
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(责任编辑 李楠)
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