全 文 ：综述与专论
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011年第 2期
外源基因转化棉花育种研究的进展与应用
王志才 张富春
(新疆大学生命科学与技术学院 新疆生物资源基因工程重点实验室,乌鲁木齐 830046 )
摘 要: 棉花作为重要的经济作物, 新品种的选育和应用对于促进棉花生产至关重要。通过转基因技术将外源基因转
化棉花, 是棉花育种的新手段。尤其是抗逆、抗除草剂、抗虫、抗病和提高棉花品质的转基因技术研究, 有助于加速棉花新品
种的培育。棉花的转基因技术主要包括农杆菌介导法、基因枪轰击法和花粉管通道法。利用不同的转基因技术在棉花外源
基因遗传转化的育种研究中取得了明显成效,探讨外源基因转化棉花育种研究的进展与应用, 为新疆陆地棉的转基因育种研
究提供重要参考。
关键词: 棉花 外源基因 转基因技术 育种
Advances and Application of Transgenic Technology in Cotton Breeding
W ang Zhica i Zhang Fuchun
(X injiang K ey Laboratory of BiologicalR esources and Genetic Engineering, College of Life Science and T echnology,
X injiang University, Urumqi 830046)
Abstrac:t C rea tion and applica tion o f new co tton cu ltivars are sign ificant im portance for im prov ing the production o f cotton,
wh ich is an im po rtant econom ica l crop wor ldw ide. H eterogeneous genes, espec ially stress to lerant, herbic ide resistant and qua lity im
provem ent genes, w ere introduced into cotton through genetic transfo rm ation is a new m ethod for cotton breeding, w hich could a lso fa
cilitated the breeding process. Currently, three me thods w ere be ing used to pe rfo rm genetic transfo rm ation in cotton, nam elyAgrobacte
riumm ed iated gene tic transfo rm ation, partic le bom bardm ent and po llen tube pathw ay. The positive effects have been shown in co tton
genetic transform ation in recen t yea rs. T o rev iew the advances and applica tion o f transgen ic techno logy in co tton breed ing perform h igh
re ference value for genetic transform a tion o f X injiang upland co ttons.
Key words: Cotton H e terogeneous genes T ransgenic technology B reeding
收稿日期: 20100826
基金项目:转基因生物新品种培育科技重大专项转基因棉花新品种培育课题 ( 2009ZX08005022B)
作者简介:王志才,男,硕士研究生, 研究方向:植物分子生物学; Em ai:l w zcx jnu. 5525@ 163. com
通讯作者:张富春,博士,教授,硕士生导师,研究方向:植物分子生物学研究; Em ai:l zfc@ x ju. edu. cn
新疆是我国最大的产棉省区, 植棉产值占种植
业总产值的 65% - 70%。而新疆为干旱荒漠半荒
漠灌溉农业,现有耕地中 31. 1%的面积受到盐渍化
危害, 其中 80%为次生盐渍化 [ 1]。本实验室前期研
究结果表明,新疆主栽棉花品种大都具有一定的耐
盐性, 但盐分耐受在不同品种之间差异很大 (未发
表 )。因而, 赋予或提高新疆陆地棉的耐盐性, 对于
培育出适应新疆特殊土壤环境的棉花新品种具有十
分重要的意义。由于春季新疆的特殊气候条件,棉
花在苗期常常遭受 倒春寒的侵袭, 造成生产的极
大损失。常规育种方法很难提高棉花的耐盐性,而
转基因技术为快速培育抗寒棉花新品种提供了新的
有力手段。另外,虽然新疆棉花的产量较高,但综合
品质却处于全国的末位。因此,提高棉花的比强、产
量和抗病性等综合品质是必须的 [ 2 ]。
传统育种方法在农艺性状改良方面已经取得了
一些成果,但一些更高经济性状的改良面临困难。
另外,传统育种方法得到新品种一般要经过 6 - 10
年, 只能通过亲缘关系较近的品种进行杂交,使得可
供选用的基因十分有限。而用植物转基因技术可以
很好地克服这些困难,理论上所有外源基因都可导
入棉花。我国的棉花转基因研究始于上世纪 70年
2011年第 2期 王志才等:外源基因转化棉花育种研究的进展与应用
代,经过较长时间的摸索, 这方面研究已经取得了长
足进展 [ 3]。目前, 向棉花中转入的外源基因主要涉
及纤维品质改良、抗虫、抗药、抗除草剂、抗冻和耐盐
碱的相关基因。转化受体主要包括体细胞、花器官、
茎尖分生组织和叶片和胚轴等。常用的遗传转化方
法主要有花粉管通道法、基因枪轰击法和农杆菌介
导法等 [ 4]。利用转基因基因技术可将优良性状基
因转入棉花中,打破了物种界限,而且转基因技术灵
活多样,可根据转化受体和外源 DNA特性的不同而
选用最为合适的转化方法, 可供利用的基因资源也
丰富多样。将常规育种技术与基因工程技术相结合
培育出高产、优质、多抗类型的优质棉花新品种,具
有明显的经济效益和社会效益。因此, 转基因技术
在棉花育种中发挥着越来越重要的作用。本研究旨
在针对近年来较常采用的农杆菌介导法、基因枪轰
击法和花粉管通道法在棉花遗传转化中的研究进展
与应用进行综述,并作比较分析,为新疆陆地棉转基
因研究的开展提供重要参考。
1 农杆菌介导法
农杆菌包括根癌农杆菌 (含有 T i质粒 )和发根
农杆菌 (含有 R i质粒 )两类,属于革兰氏阴性菌。T i
质粒和 R i质粒能在一些包裹蛋白的作用下将外源
DNA转移到植物受体细胞中。棉花的遗传转化大
都采用根癌农杆菌, 但不同菌株对不同棉花品种的
亲和力也不一样, 直接影响转化效率。该方法已经
广泛用于外源基因对棉花的遗传转化, 且后代具有
较低的外源基因拷贝数 [ 5]。
1. 1 适用于农杆菌浸染的受体类型
1. 1. 1 外源基因直接转化法 在幼苗期以棉花茎
尖分生组织为受体转入外源基因, 就有可能在由茎
尖分化出的茎叶、花等组织和器官中整合进外源基
因。特别是在花器官中, 外源基因整合到合子细胞
中,进一步发育成种子,得到转基因个体。利用茎尖
分生组织作为受体直接导入外源基因, 避免了植物
组织和细胞培养过程,减小操作难度,也能大大缩短
试验周期。利用棉花茎尖分生组织分裂能力强的特
点,孙旭等 [ 6 ]选取棉花的茎尖为受体, 用农杆菌介
导法将抗除草剂基因 bar导入华抗 6号和 06S62两
个棉花品种。吕素莲等 [ 7]以棉花种子无菌苗裸露
的茎尖分生组织为转化受体,用农杆菌介导法将胆
碱脱氢酶基因 betA和突变的乙酰乳酸合成酶基因
als导入到 3个棉花优良品种中, 通过抗性筛选, 最
终获得了对除草剂氯磺隆具有抗性和耐盐性提高的
转基因植株。
1. 1. 2 通过组织培养转入外源基因
1. 1. 2. 1 通过胚性愈伤组织转入外源基因 在棉
花的遗传转化中, 传统的农杆菌介导法惯于用下胚
轴或子叶作为外植体,通过体细胞胚发生途径获得
再生植株 [ 8]。鉴于继代培养 1. 5- 2年的棉花胚性
愈伤组织仍然能够迅速起始胚胎发生和细胞的快速
增殖, W u等 [ 9]优化了棉花体细胞胚发生的培养条
件, 认为黄色、疏松、呈指状的胚性愈伤具有较高的
转化效率。在进行抗性筛选时, 低密度的愈伤有利
于和培养基充分接触, 从而提高筛选效率。也有研
究者将成熟或未成熟的 Coker310棉花胚性细胞进
一步培养成胚性愈伤组织, 利用农杆菌介导法将
cry1Ia5基因导入,得到抗虫性提高的再生植株 [ 10]。
这些研究表明,胚性愈伤组织能够提供大量易于农
杆菌浸染的类似感受态的受体细胞, 从而大大提高
了转化效率。
1. 1. 2. 2 通过茎尖分生组织转入外源基因 以茎
尖分生组织为外植体进行组织培养时,由于茎尖分
生组织能够直接产生不定芽, 具有基因型依赖性弱
等优点,能够在较短时间内获得再生植株。剥离的
茎尖预培养 1- 2 d后用农杆菌浸染, 在 M S培养基
上共培养。利用和外源基因偶联的抗性筛选标记,
可筛选出阳性苗。李明等 [ 11]剥取棉花茎尖, 与农杆
菌共孵育 7- 10 m in,然后将茎尖转移至共培养基上
培养, 48 h后再将茎尖移至筛选培养基上筛选, 得
到了转化率为 0. 11%的除草剂抗性植株。但切取
抗性苗的顶芽再做组织培养, 再生植株中未检测到
目的基因的存在。推测可能的原因是首次浸染得到
的阳性苗为嵌合体,第二次切取的顶芽正好是非转
化细胞。 Balasubram ani等 [ 12]以不同生长期的棉花
茎尖为受体, 利用农杆菌介导法将 B tcry lA ( b)基因
转入印度栽培棉品种 Anjli( LRK516)和 LRA5166
中。分子检测发现,该基因已经整合到基因组中,但
这些转基因株系并未达到预期的抗鳞翅目昆虫的效
果。尽管如此,该方案仍适用于对其他重要经济性
状基因进行的非基因依赖性转化。然而,以棉花茎
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2011年第 2期
尖为受体进行农杆菌浸染时,茎尖材料的准备费时
费力, 得到的转基因当代植株嵌合体严重,且转化条
件等多种因素的影响使得转化效率低下 [ 13 ]。
1. 1. 2. 3 通过下胚轴转入外源基因 用适当浓度
的农杆菌菌液直接浸染棉花的下胚轴, 在加有抗生
素的培养基上建立植株再生体系, 可获得转基因再
生植株。该方法要求棉花品种具有高效的体胚发生
和植株再生能力。将大豆的几丁质酶基因 ( Chiti
nase )用农杆菌介导法转入棉花下胚轴,从转基因株
中提取的几丁质酶对引起黄萎病的轮枝菌 ( Verticil
lium dahliae )有很强的抑制作用 [ 14 ]。
1. 2 提高农杆菌转化效率的方法
在农杆菌浸染受体时控制适当条件, 会极大地
提高外源基因的转化效率。如真空渗透处理法辅助
农杆菌浸染可提高外源基因的转化率, 可能是渗透
造成的负压使得更多的农杆菌吸附到外植体表面,
进而增加了农杆菌进入的机会。 Ikram等 [ 15]采用真
空渗透处理辅助农杆菌浸染将卡那霉素抗性基因和
GUS转入棉花品种 (Gossyp ium hirsutum L. cv. ) Cock
er312的胚性愈伤组织中,与未经渗透处理的对照
相比, 渗透处理使得转化效率提高了 2倍。
2 基因枪轰击法
基因枪轰击法 ( gene gun bom bardm ent)又叫微
弹轰击法,利用火药或其他动力将包裹 DNA的微粒
加速后直接射入受体细胞中,使得外源 DNA能与细
胞遗传物质相接触,进而有效地整合到基因组中,达
到遗传转化的目的。基因枪轰击法在棉花中的应用
始于 1990年 [ 16 ]。
2. 1 适用于基因枪轰击的转化受体类型
基因枪转化效率随受体不同而有较大差异,一
般来说,良好的受体具有易于转化、再生容易和取材
方便等特点。虽然基因枪转化法在许多受体种类中
都有成功的报道,但某一具体品种可供选择的受体
材料是有限的。基因枪轰击法进行棉花遗传转化时
常用的受体有茎尖分生组织 [ 17]、胚性愈伤组织和悬
浮培养细胞 [ 18 ]。选用茎尖为受体在轰击前进行培
养时, 在培养基中加入适量的活性炭,可模拟土壤的
黑暗环境,有利于根的生长。同时,刺激茎尖的迅速
萌动, 吸收切口部位渗出的酚类物质,从而减少褐化
的外植体比例, 提高其存活率 [ 19 ]。黄全生等 [ 20]用
海岛棉茎尖作为基因枪转化的靶材料,建立了可重
复的海岛棉转化体系。李秋伶等 [ 21]利用基因枪法
将植酸酶基因 ( Phya)导入农大 KB18的茎尖分生组
织, 经筛选、再生和分子检测等过程获得了转基因植
株。研究表明,轰击距离及卡那霉素的起始筛选时
间、筛选浓度梯度对转化周期和转化率有直接影响。
另外,利用再生能力强的棉花胚性悬浮培养物作转
化受体,通过基因枪轰击法可望导入大片段的外源
基因,也可用于多质粒的共转化, 在提高转化效率的
同时,转化周期也大大缩短 [ 16]。用微弹轰击悬浮培
养的胚性细胞, Ra jasekaran等 [ 22]得到了转化频率较
高的转基因植株。
2. 2 提高基因枪转化转效率的方法
受体细胞的内在因素和基因枪轰击参数会影响
外源基因的转化效率。受体自身的因素包括外植体
种类、细胞的生理状态、细胞潜在的再生能力、轰击
前后对细胞的处理以及细胞内环境对外源 DNA的
接受能力等。基因枪轰击参数一般要考虑到轰击压
力、轰击距离、微弹的分散范围、程度和轰击次数。
在轰击前和轰击后对细胞进行适当的渗透处理会增
加外源 DNA进入细胞的机会, 同时这种处理造成的
轻度质壁分离可减少胞质渗漏, 提高转化细胞存活
率。通过多次轰击及抗生素梯度筛选等措施可大大
提高转化频率 [ 22]。耿立召等 [ 23]探讨了基因枪法转
化棉花胚性愈伤过程的影响因素时认为,在轰击前
4 h,轰击后 16 h采用 0. 3 m o l/L的甘露醇做渗透处
理, 轰击距离 9 cm,轰击 2次的效果最好。
3 花粉管通道法
花粉管通道法是 20世纪 80年代初周光宇最早
提出的 [ 24] ,在深入分析植物远源杂交成功经验的基
础上,提出了小片段 DNA杂交假设, 认为注入的外
源基因在大部分被降解的同时, 会有一部分短小基
因以冈崎片段的形式整合到基因组中,使植物发生
性状改变,并与植物自身基因组一起在后代中稳定
遗传。我国大面积种植的转基因抗虫棉就是运用这
种方法育成的。
目前, 通过花粉管通道法导入的基因种类主要
为构建的重组基因和质粒。转化方法主要包括微注
射法、柱头滴加法和花粉粒携带法。后代材料的鉴
定可通过形态观察、抗性检测、荧光检测及利用 RAPD、
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2011年第 2期 王志才等:外源基因转化棉花育种研究的进展与应用
PCR、EL ISA以及 Southern b lo t等分子生物学手段检
测 [ 25]。利用花粉管通道法导入外源 DNA的常用方
法有以下几种: ( 1)子房注射法。先将柱头去掉,用
微量注射器直接将 DNA打入胚囊中, 该方法适用于
花器官较大的作物。 ( 2)柱头滴加法。剪去柱头的
一半或全部,然后将 DNA溶液滴加到花柱切口处,
该方法适用于花器官较小的作物。 ( 3)花粉粒携带
法。外源基因与花粉共孵育一段时间, 待花粉粒干
燥后再进行人工授粉,该方法模拟自然授粉过程,对
植株伤害小。棉花的花器官较大, 转基因主要采用
子房注射法。采用花粉管通道法, 本实验室马纪
等 [ 26]将抗冻蛋白基因 MpAFP149转入新疆主栽棉
品种新陆早 17中,期望得到抗寒性提高的棉花新品
种,及时有效地预防 倒春寒 对棉花的伤害, 后续
筛选培育工作还在进行中。
4 几种外源基因遗传转化体系的比较
4. 1 农杆菌转化体系的特点及局限性
农杆菌 T i质粒介导的基因遗传转化具有以下
特点: ( 1) T i质粒转化系统是天然存在的植物遗传
转化系统,转化机理较为清楚。在一些农杆菌产生
的蛋白包裹下进入植物细胞,使得外源 DNA免受核
酸酶降解。 ( 2)位于左右边界之间的外源插入 DNA
片段能够完整地整合进植物基因组,片段可长达 50
kb。 ( 3)外源基因以单拷贝或低拷贝形式整合到染
色体上,遗传稳定性好,后代大都符合经典的孟德尔
遗传规律。 ( 4)操作成本低且外源基因在转化过程
中的变异小 [ 27 ]。但应用该方法需要建立起完整的
组织培养和植株再生体系, 而目前对于大多数棉花
品种来说还难以实现。农杆菌介导茎尖的基因遗传
转化体系虽然具有基因型依赖性小的优势, 但转化
工作量大且后代嵌合体现象严重 [ 28, 29 ] ,大多数品种
的棉花茎尖愈伤难以产生丛生芽, 所以该方法也只
适用于少数品种。
4. 2 基因枪转化体系的特点及局限性
基因枪法的优点有: ( 1)受体材料来源广泛,可
以是茎尖、未成熟胚及愈伤组织等。 ( 2)可控度高,
通过各种基因枪轰击参数的优化组合, 可使外源基
因进入特定层次的细胞中。但该方法转化效率低,
嵌合体严重,外源基因通常以多拷贝数整合进植物
基因组,后代中目的基因不按孟德尔规律遗传。降
低包裹金粒的外源 DNA浓度和优化基因枪轰击参
数能够得到单拷贝的外源基因转化植株 [ 30] ,如 Agra
w al等 [ 31 ]采用此方法得到了约 75%的显性单拷贝
插入的外源基因转化株。
以棉花茎尖分生组织为受体进行基因枪遗传转
化, 在不受宿主基因型和操作时间的限制方面优于
农杆菌介导法和花粉管通道技术 [ 32]。基因枪轰击
法转化棉花茎尖分生组织一般仅用 1. 5 - 4个月即
可得到转基因植株,是一种较为高效的遗传转化体
系。但该方法也存在着明显的缺点, 如外源基因整
合位点较多、转化效率偏低、存在假阳性和嵌合体且
转入的外源基因遗传稳定性差等 [ 33]。利用外源激
素调控可使比顶端分生组织更为敏感的子叶节、初
生叶和再生叶产生 3- 8个茎尖,用多茎尖转化法可
在一定程度上提高基因枪的转化效率 [ 34]。用基因
枪法转化受体细胞时通常只有表层细胞被转化。通
过划伤分生组织以暴露出第二和第三层细胞, 可使
更多的细胞被转化,再结合加强筛选压力和延长筛
选时间等方法,能在一定程度上降低嵌合体数量 [ 35 ]。
基因枪轰击时的误差较大,因为金粉悬液为悬浊液,
吸取相同体积的悬液中金粉的含量不同;金粉微粒
高速冲出时,由于人为或机械原因而出现偏差,没能
打到愈伤组织同心圆上, 或者打偏。可通过设置大
量重复试验以消除随机误差造成的影响,再结合统
计学方法进行分析就能得到可靠性较好的结果 [ 36]。
虽然基因枪介导法适用于多个棉花品种, 但转化
效率低, 花费也高于农杆菌等介导法, 多数实验室
无法采用。而农杆菌介导法因其转化机理比较清
楚,转化效率也有很大提升, 其应用前景更为广
阔 [ 37]。
4. 3 花粉管通道转化体系的特点及局限性
花粉管通道法具有以下优点: ( 1)可适用于任
何单胚珠、多胚珠的单子叶和双子叶显花植物,只需
要了解其开花习性,花器官构造及授粉过程,把准最
适的外源基因注入时间即可应用。得到的种子含有
转基因个体,可直接用于常规育种 [ 38]。 ( 2)操作简
单方便,不需要复杂精密的试验仪器。 ( 3)育种时
间短, 3- 4代就可得到纯合子。该方法也存在一定
的局限性,如只适用于开花植物; 对花期的把握及操
作的熟练程度都会极大地影响外源基因的转化效
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2011年第 2期
率,这也是该方法介导的植物遗传转化效率低的原
因之一 [ 39]。
花粉管通道法因其特有的优势而为许多研究者
所喜爱,在国内有广泛应用。但由于花粉管通道法
的转化机理目前还不是很清楚,大多数采用该方法
转化外源基因成功的例子目前仍缺乏足够的分子生
物学证据和详实的转基因植株后代分析数据, 且国
外有学者在大豆等作物中对该方法进行验证未取得
理想结果 [ 40 ]。因此,今后需细致地设计目的性更强
的试验来验证该方法的可行性 [ 41] , 并逐步阐明其转
化机理,使该方法能被更多的人接受和使用。3种
转基因方法的比较,见表 1。
表 1 三种基因转化方法的比较
转基因方法 分子机理 常用受体 成本 场所要求 转化效率 拷贝数 基因型依赖性
农杆菌介导法 清楚 叶片,下胚轴茎尖分生组织等 低 实验室 较低 少 有
基因枪法 清楚 叶片,愈伤等 高 实验室 低 多 有
花粉管通道法 不清楚 花 较高 大田 较高 较少 无
5 展望
新疆是我国最大的商品棉生产基地, 植棉面积
与产量逐年上升。但是, 干旱的气候条件造就了新
疆为盐渍化大区,现有耕地面积的 31. 1%受到盐碱
危害,极大地限制了农业生产。充分开发利用耐盐
植物基因资源,培育和筛选抗盐碱的棉花新品种,能
进一步提高盐碱地的生产能力。借助转基因技术培
育抗寒棉花新品种, 预防和抵抗 倒春寒 的侵袭,
可减少生产损失,为推动新疆棉花生产及相关产业
的发展作出重要贡献。综合农杆菌转化和基因枪轰
击等方法的优点,有望摸索出更为高效的转化新体
系。在不久的将来, 更多的优良性状和多价抗逆基
因将通过不断优化和发展的转基因技术转入棉花,
从而获得综合性状理想的新品种。
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(责任编辑 狄艳红 )
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