全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
B IO TECHNOLO GY　BULL ETIN 2009年第 9期
L eERF2基因对旱稻耐盐性的影响
常英芬 1 　丁在松 2 　高聚林 1
(1 内蒙古农业大学农学院 ,呼和浩特 010019; 2 中国农业科学院作物科学研究所 ,北京 100081)
　　摘 　要 : 　采用 T2代转 LeERF2基因旱稻 (旱 297)为材料 ,研究分蘖期盐胁迫下植株光合性能和生理反应。结果表明 , 50
mM NaCl胁迫条件下 ,转基因植株 ( T)和野生型对照 (W T)的各项光合参数差异不明显 ,但在 100 mM NaCl胁迫条件下 ,转基
因植株仍能维持较高的光合速率和气孔导度。随着 NaCl胁迫浓度增加 ,野生型旱稻和转基因旱稻植株叶片 SOD活性增加幅
度加大 ,但都表现为转基因植株增幅更明显 ,而 MDA含量则表现为野生型植株增幅更明显 ,表明 L eERF2基因增强了旱稻盐
胁迫下抗氧化能力 ,提高了耐盐性 ,能维持较高光合速率。
关键词 : 　LeER F2基因 　旱稻 　盐胁迫 　响应
Effects of L eERF2 Gene to Salt2tolerance of Aerobic Rice
Chang Yingfen1 　D ing Zaisong2 　Gao Julin1
(1 College of Agronom y, InnerM ongolia Agricultural University, Huhhot 010019; 2 Institu te of Crop Science,
Chinese Academ y of Agricultural Sciences, B eijing 100081)
　　Abs trac t: 　W e now report on the regulatory role of LeERF2 to photosynthetic and antioxidation system in salt response during aer2
obic rice tillering stage. The results suggested that, after treated by 100 mM NaCl stress , the transgenic aerobic rice maintained higher
photosynthesis ( Pn) and stomatal conductance ( Gs) than wild type. W hereas, after the 50 mM NaCl stress treatment, there was no
obvious difference between the wild type and transgenic aerobic rice. The antioxidation system results showed that the transgenic aerobic
rice significantly increased SOD activity, and lower level ofMDA content than the wild type, further more, the amp litude of variation
increases with NaCl stress concentration. It is suggested that the transgenic aerobic rice maintain higher antioxidation ability under salt
stress, which is helpful to maintain the higher photosynthesis.
Key wo rds: 　L eERF2 Gene　Aerobic rice　Salt stress　Response
收稿日期 : 2009204213
基金项目 :中央级公益性科研院所基本科研业务费专项 ,国家“十一五”科技支撑计划粮食丰产科技工程项目 (2006BAD02A13)
作者简介 :常英芬 (19812) ,女 ,河北邢台人 ,研究方向 :作物光合生理 ; E2mail: changyf@yeah. net
通讯作者 :高聚林 , E2mail: gaojulin@yahoo. com. cn　　通过转基因手段将调控植物胁迫相关转录因子转入受体材料 ,提高植株抗逆性 ,成为近些年作物育种和植物生理学领域重点研究内容 ,对于转录因子结构与功能的认识也在逐步加深。番茄乙烯应答因子 (LeERF2)是 ERF转录因子家族成员 ,据前人研究报道 [ 1～6 ] ,番茄 ERF因子 JERFs在整合乙烯和ABA信号途径形成的调控网络中发挥着重要作用 ,而且 JERFs通过调节与植物胁迫相关基因的表达 ,提高了转基因植物的耐盐性、耐旱性、耐冷性和抗病性。另有研究报道 [ 7, 8 ] ,烟草 Tsi1受盐、水杨酸、茉莉酸甲酯、乙烯和伤害的诱导表达 ,与 GCC2box和 DRE /CRT等元件结合 ,激活植物抗病相关基因和抗渗透胁迫相关基因的表达 ,提高转基因烟草和辣椒的抗病性和耐盐性。张执金等 [ 9 ]研究发现 ,在盐、甘露醇和糖的胁迫下 ,转 L eER F2基因烟草在种子萌发率、植株的耐冻性方面均比对照有显著提高。但前人研究多着重从抗性相关基因表达以及表达量增加方向来揭示抗性机理 ,很少有从光合和生理角度进行阐述。本实验室的石云鹭等 [ 10 ]将调控 O smotin表达的 LeERF2转录因子转入旱稻 ,得到转基因旱稻植株。高等植物 90 %以上的生物量来自光合
2009年第 9期 常英芬等 : L eER F2基因对旱稻耐盐性的影响
作用的碳同化 [ 11 ] ,光合作用易受外界环境的影
响 ,尤其是干旱、高盐等渗透胁迫直接影响作物
的光合性能。因此 ,本研究采用转 L eER F2 基因
旱稻为材料 ,进一步研究 N aC l胁迫下转 L eER F2
基因旱稻的光合性能以及抗性生理机制 ,使旱稻
植株光合和抗逆性同步协调提高 ,达到高效指导
农业生产的目的。
1　材料与方法
111　试验材料及处理
试验于 2008年在中国农业科学院作物科学研
究所温室进行。选择 T2 代转 L eERF2基因旱稻 (选
用一个纯株系 )和其野生型旱稻 ( H297)品种为材
料 ,文中分别用 T和 W t表示。7月 15日土培 ,三叶
期后转移到 60 L塑料盆中采用 Hoagland完全营养
液水培 , pH5. 0。9 月 10 号进行 50 mM、100 mM
NaCl胁迫 ,处理 10 d,再恢复 5 d, 2次重复。
112　转基因植株 PCR鉴定
采用 CTAB 法提取转基因单株叶片基因组总
DNA,用 LeERF2内部特异引物扩增 ,以未转化株为阴
性对照 ,抗性株总 DNA为模板对目的片段进行扩增。
LeERF2的正向引物 : 3′2TACTAGTCTCAATTCTTCCTA2
ATTCG25′,反向引物 : 5′2CGCCGCGCCTATGCCCGAT2
TCATACAC23′。
113　旱稻剑叶气体交换参数测定
在旱稻胁迫第 10天和恢复第 5天的上午 9: 00～
11: 30时 ,分别对生长在温室内的 T2 代转 LeERF2基
因旱稻 (经 PCR鉴定为阳性的植株 )和其野生型旱稻
(H297)进行气体交换参数的测定 ,采用美国 L I2COR
公司生产的 L I26400便携式光合仪 ,测定旱稻剑叶净
二氧化碳同化速率 ( Pn) ,气孔导度 ( Gs) ,细胞间隙
CO2 浓度 (C i)。测定的条件为大气 CO2 浓度 (395 ±
5)μmol mol- 1 ,相对湿度 (60 ±5) % ,温度为 28℃,使
用仪器自带的 LED光源控制光强 ,测定时 PPFD为
1 200μmol photons m22 ·s21。
114　SOD活性和 MDA含量的测定
取 PCR鉴定为阳性的植株叶片 ,测定其 SOD
活性和 MDA含量 ,其中 ,超氧化物歧化酶 ( SOD )
活性的测定方法参照 Gannopolitis等 [ 12 ]的方法。
丙二醛 (MDA )含量采用硫代巴比妥酸比色法 [ 13 ]
测定。
2　结果与分析
211　转 L eER F2基因旱稻 PCR鉴定
由于转基因后代植株存在分离现象 ,与图 1显
示的 PCR结果一致 ,所以对呈阳性的植株挂牌标
记 ,以进行后期其他其指标的测定。
1～16. 转 LeERF2基因植株 ; 17～18. 野生型对照
图 1　转 L eERF 2基因植株 T2 代 PCR检测
212　NaCl胁迫下旱稻剑叶气体交换特
图 22A , B表明 , NaCl胁迫 10 d后 ,转基因和野
生型旱稻的光合速率 ( Pn)都有明显下降 ,恢复培养
5 d后略有回升 ,但在 100 mM NaCl胁迫下 ,野生型
和转基因株系相比 ,其光合速率下降幅度更大 ,下降
幅度分别为 70%和 43% ,转基因株系表现出很强的
优势 ; 50 mM NaCl胁迫下 ,野生型和转基因株系的
光合速率没表现出差异 ,也就是说 ,随胁迫程度增
加 ,转基因植株优势越明显。由图 22C, D 可以看
出 ,植株叶片气孔导度 (Gs)和光合速率 ( Pn)变化趋
势类似。图 22E, F显示 ,在 100 mM NaCl胁迫下 ,野
生型和转基因植株的胞间 CO2 浓度 (C i)都明显增
加 ,但后者的 C i值明显高于前者 ; 50 mM NaCl胁迫
下 ,野生型和转基因植株的胞间 CO2 浓度 (C i)都明
显降低 ,但后者的 Ci值始终略高于前者。图 22G,
图 22H表明 ,在 100 mM NaCl胁迫下 ,野生型和转基
因植株的气孔限制值 (L s)都明显降低 ,但后者的 L s
明显低于前者 ;在 50 mM NaCl胁迫下 ,野生型和转
基因植株的气孔限制值 (L s)都明显增加 ,但后者的
L s值明显低于前者。以上结果表明 ,高盐胁迫下 ,
L eER F2基因可有效提高旱稻耐盐性。Tang等 [ 14 ]也
指出 , ERF蛋白在植物适应非生物胁迫中发挥着重
要作用 , 如 ,干旱、低温、高盐、氧化胁迫和 ABA
响应。
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 9期
W T. 未转基因的对照植株 ; T. 转 LeERF2基因一个
株系以上数据均是 3次测定的平均值
图 2　分蘖期不同盐浓度胁迫处理下的气体交换特征
综合分析图 2,各气体交换参数数值 , NaCl胁迫
下 ,植物光合速率降低 ,影响其降低的因子包括气孔
限制和非气孔限制。很多实验已证实 ,盐胁迫下气
孔会发生非均匀关闭 [ 15 ]。许大全等 [ 16 ]研究认为 ,
盐胁迫下 ,植物体内的 ABA含量增加 ,可能是引起
气孔非均匀关闭的重要因素。但也有研究认为 ,气
孔的不均匀关闭并不限制 CO2 进入叶片 ,也不会影
响细胞间隙 CO2 浓度值 [ 17 ]。本试验中 , 50 mM NaCl
胁迫下 ,野生型和转基因植株各光合参数变化趋势
以及变化幅度类似 ,都表现为 , Gs和 C i下降 , L s增
加 , Pn降低 ,表明气孔限制成为主要因子 ;而在 100
mM NaCl胁迫下 ,野生型和转基因植株各光合参数
变化趋势类似但变化幅度和所处水平不同 ,都表现
为 Gs大幅下降 , C i稍有上升 , L s下降 , Pn降低 ,表
明此时叶肉因素成为主要限制因子 ,说明非气孔限
制成了光合速率降低的主要因素。但野生型植株变
化幅度较大 ,表明 L eER F2基因增强了植株对 NaCl
的耐受性。光合作用的非气孔限制可能是由于参与
光合反应的关键酶 ———RuBP羧化酶活性的下降所
致 ,而 RuBP羧化酶活性受多种因素影响 ,如 RuBP
羧化酶含量的减少 [ 18 ]、再生能力的下降 [ 19 ]、PSⅡ对
NaCl的敏感性 [ 20 ]等。
213　SOD活性和 MDA含量
W T. 未转基因的对照植株 ; T. 转 LeERF2基因一个株系
以上数据均是 2次测定的平均值
图 3　不同盐浓度胁迫处理下的叶片 SOD活性
( A、B)和 MDA( C、D )含量
SOD是植物体内清除活性氧自由基的关键酶 ,
其活性的强弱与植物抗氧化能力密切相关。研究认
为 SOD在抗氧化胁迫上具有重要的作用 [ 21, 22 ]。因
此 ,光介导的活性氧的清除 ,抗氧化能力强弱是衡量
作物抗逆性的重要指标之一 [ 23 ]。
由图 32A、图 32B可以看出 ,野生型和转基因植
株 SOD活性在 50 mM NaCl和 100 mM NaCl两个浓
度胁迫下都表现出升高趋势 ,且两个浓度梯度下都
表现为转基因植株增幅更明显 ,但 100 mM NaCl胁
迫下野生型和转基因植株 SOD活性整体增幅较大 ,
分别增至胁迫前的 1135 倍和 1154 倍 ,而 50 mM
NaCl胁迫下 ,野生型和转基因植株 SOD活性分别仅
增至胁迫前的 1116倍和 1131倍 ,对这两种胁迫恢
复处理后 ,野生型和转基因植株 SOD活性都有一定
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2009年第 9期 常英芬等 : L eER F2基因对旱稻耐盐性的影响
程度的回落。
MDA是膜质过氧化的产物之一 ,植物受到胁迫
时 ,细胞保护系统受到破坏 ,损伤细胞膜结构 ,体内
自由基含量增加 ,膜质过氧化程度加大 ,MDA含量
增加 ,所以 MDA含量多少与植物细胞膜稳定性密
切相关。图 32C、图 3D显示 , 50 mM NaCl胁迫下 ,
野生型和转基因植株 MDA含量几乎没有差异 ,且
和胁迫前相比 , MDA 含量增加幅度很小 ,表明 50
mM NaCl胁迫对旱稻细胞膜损伤程度较弱 , 转
L eER F2基因旱稻优势不明显。100 mM NaCl胁迫
下 ,野生型和转基因植株 MDA含量都明显增加 ,但
野生型植株 MDA含量增幅较大 ,分别为胁迫前的
2146倍和 2107倍。表明 100 mM NaCl胁迫下 ,旱
稻细胞膜结构遭到损伤 ,而 L eER F2基因对于维持
旱稻细胞膜稳定性具有一定作用。
3　结论与讨论
通过转基因手段 ,将调控胁迫相关基因转入受
体材料且高效表达 ,以提高作物抗逆性是作物育种
家和植物生理学家关注的热点问题。但之前的转基
因技术只是转入单一抗性基因 ,效果不明显 ,近些
年 ,大家将关注点转向转录因子 ,转录因子与顺式作
用元件结合 ,可以调控与同类抗逆性状有关的多个
基因表达 ,有效改善植物综合抗性。本研究用转
ERF类转录因子 L eER F2旱稻为材料 ,结果表明 , 50
mM NaCl胁迫下 ,野生型和转 L eER F2基因旱稻光
合速率 ( Pn)都呈下降趋势 ,但两者没有差异 (图 22
B ) ,而 100 mM NaCl胁迫下 ,转 L eER F2基因旱稻较
野生型旱稻相比 ,其仍能维持较高的光合速率 ( Pn)
(图 22A) ,主要是通过相对较高的气孔导度 (Gs)和
胞间 CO2 浓度 (C i)实现 (图 22C、图 22E)。石云鹭
等 [ 10 ]从光保护机制方面分析认为 ,在干旱、高盐、低
温胁迫下 ,转 L eER F2基因旱稻具有较强的 CO2 同
化力和光能转换能力 ,从而可以维持较高的光合速
率 ( Pn )。前人研究 [ 24～26 ] 多针对逆境条件下 ,转
ERF类转录因子植株萌发率和生长量提高来说明
该类转录因子提高了植株抗逆性 ,而本试验着重从
各光合特征参数来揭示 ,高盐胁迫下 , L eER F2基因
对于维持旱稻较高光合能力具有一定作用 ,这有利
于物质的积累和分配。但是 ,随着 NaCl胁迫浓度再
增加 ,转 L eER F2基因旱稻的各光合特征参数值如
何变化 ,以及逆境条件下其仍能维持较高光合速率 ,
这是否与光合作用关键酶 RuBP、PEPC酶活和含量
有关还需进一步研究。
刘文奇等 [ 27 ]报道 , ERF类转录因子 OPBP1基
因的超表达可以提高烟草的耐盐能力。Jung等 [ 28 ]
报道 ,燕麦的 ERF类转录因子 HvRAF基因增强拟
南芥盐胁迫和抗病能力。W u等 [ 5 ]报道 , ERF类转
录因子 JERF1基因通过调控脱落酸生理合成基因
的表达进而提高烟草耐盐和低温能力。本研究也发
现 , NaCl胁迫下 ,转 L eERF2基因旱稻具有较强的抗
氧化能力 (图 32A ,图 32B) ,较高的 SOD活性是植物
抗逆的生理基础 ,本研究中转 L eER F2基因旱稻盐
胁迫条件下比野生型对照显著增加 SOD活性 ,利于
清除活性氧 ,使得膜脂过氧化程度较低 ,保证膜系统
的完整 ,MDA含量增加幅度小于野生型对照 (图 32
C,图 32D )。尽管 50 mM 和 100 mM NaCl胁迫下 ,
植株叶片 SOD活性和 MDA含量变化趋势相同 ,但
100 mM NaCl胁迫下 ,转基因植株较野生型对照的
变幅更小 ,优势效果更明显。结果表明 , L eERF2基
因可使旱稻具有较强的抗氧化能力 ,可使植株受到
伤害减轻 ,提高耐盐性 ,有利于光合作用的维持和物
质的积累。然而关于在其它生育时期和其它逆境胁
迫条件下 , L eER F2基因对于旱稻耐盐性调控方面是
否仍具有同样优势以及如何调控等问题还需进一步
深入研究。
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食品免疫化学与分析
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