全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011年第 2期
完全重瓣型山茶花品种 红十八学士
CjHDEF基因 cDNA的序列分析
朱高浦1 李纪元 1 范正琪 1 倪穗 1, 2
( 1中国林业科学研究院亚热带林业研究所,富阳 311400;
2宁波大学生命科学与生物工程学院,宁波 315211)
摘 要: 我国完全重瓣型山茶花品种红十八学士 (Cam ellia jap on ica H ongsh ibaxuesh i ) C Hj DEF基因的 cDNA序列
( GenBank登录号 : HM 773024)生物信息学分析表明, 该基因属于花发育 B类功能基因的 AP3基因家族成员, 其 cDNA全长
1 013 bp中有一个完整的 681 bp开放阅读框 ,编码 226个氨基酸。该基因编码蛋白质分子量 26 09 kD, 理论等电点 903;
不稳定系数达 43 20,表明该蛋白为不稳定蛋白 ;其编码蛋白属于 M IKC型蛋白, 该蛋白预测的二级结构和三级结构结果相
符 ,主要以 -螺旋和无规卷曲为主 ,延伸链所占比重最小; 含有 6个蛋白激酶 C磷酸化位点 , 表明该基因与 红十八学士
花器官发育的细胞生长和分化密切相关; 有多达 11个磷酸化特定位点, 说明该基因在花器官发育的细胞信号传递过程中
占有重要地位。
关键词: 山茶 完全重瓣 红十八学士 CHj DEF基因 序列分析
Sequence Analysis of CjHDEF Gene cDNA from Camellia japonica
Hongshibaxueshi of FormalDouble Variety
Zhu Gaopu
1 L i J iyuan1 Fan Zhengqi1 N i Sui1, 2
(
1
Research Institute of Sub trop ical Forestry, ChineseA cademy of Forestry, Fuyang 311400;
2
Faculty of L ife Science and B io technology, N ingbo University, N ingbo 315211)
Abstrac:t To analyse C Hj DEF gene cDNA sequence from C. japon ica H ongshibaxuesh i of fo rm al doub le var ie ty. The resu lts of
b io info rm atics m ethods show ed tha t the gene be long to B c lass of plant flow er developm ent and cDNA fu ll leng th is 1 013 bp that contain
a comp le tely open read ing fram e( ORF) w ith 681 bp leng th that encoded 226 am ino ac ids. Them o lecularw e ight o f the prote in by C Hj -
DEF genew as 26. 09 kD, iso-e lectr ic po in tw as 9 03, and the instab ility index w as 43 20. The cod ing prote in w as be long ing toM IKC
types. M a in ly alpha-he lix and random co i,l ex tend strand was the sma llest proportions bo th tertiary and seconda ry structure. Inc luding six
prote in kinase C phosphory lation sites show ed the prote in kept c lose ly re lated w ith flow er o rgan o f H ongsh ibaxuesh i betw een cell
g row th and differentiation. It was an im po rtant position in cell signal transm iss ion o f flow er o rgan because the prote in has e lev en phos-
phory la tion sites.
Key words: Cam ellia jap onica Forma l doub le flowe rs H ongshibaxuesh i CHj DEF gene Sequence ana lysis
收稿日期: 2010-09-28
基金项目:林业公益性行业科研专项 ( 200704028) ,林业 948项目 ( 2007-4-04 ), 浙江省国际合作重大项目 ( 2008C14066) ,浙江省院合作林业
科技项目 ( 2008SY008)
作者简介:朱高浦,男,博士研究生,研究方向:园林植物与观赏园艺; E-m ai:l zhugaopu@ 163 com
通讯作者:李纪元,男,博士,研究员,研究方向:观赏植物与花卉分子育种; E-m ai:l J iyuan _l@i 126 com
重瓣花植物的花器官具有富于变化、层次多、
立体感强等特点, 因此观赏价值较高。在市场上
几乎所有观赏植物都有重瓣花类型并占较大份
额, 所以重瓣花育种是所有观赏植物育种重要目
标之一。有关重瓣花起源有多种可能性, 包括积
累起源、苞片起源、雌雄蕊起源、台阁起源、重复起
源和花序起源等 6种 [ 1] , 正是重瓣花起源方式多
样及遗传规律复杂, 使得观赏植物重瓣性的分子
2011年第 2期 朱高浦等 :完全重瓣型山茶花品种 红十八学士 CHj DEF基因 cDNA的序列分析
机制研究变得很困难。有关花器官属性决定的分
子机制, 理论依据最早来自 Coen等 [ 2]的 ABC模
型。该模型认为, 有 A、B、C 3类同源异型基因分
别单独或组合调控 4轮花器官的特征。其中 A类
基因单独调控萼片; A和 B类基因共同调控花瓣;
B和 C类基因一起控制雄蕊; C类基因单独控制心
皮。A、C类基因互相拮抗。近年来的研究发现了
一些参与调控花瓣、雄蕊、心皮和胚珠发育的 E类
基因 [ 3] , 使得 ABC模型得到了完善和发展。目前
对重瓣花分子机理的研究大多集中在 C功能基因
突变导致下游和其相互作用的因子方面 [ 4- 9] , 对 A
类基因也有一些研究 [ 10]。然而, 在重瓣花形成的
6种起源中, 以雌雄蕊起源方式的重瓣花在重瓣花
形成中占有重要地位, 赵印泉等 [ 1]认为山茶重瓣
花形成即属于此种起源方式。
本研究对从完全重瓣型品种 红十八学士 中
克隆到的一个 B类功能基因的 cDNA全长进行生
物信息学分析, 以期为对该基因的纵深研究提供
参考。
1 材料与方法
11 材料
采用同源克隆的方法从 红十八学士 花芽中
获得 DEF基因同源片段,采用 RACE ( rap id amplif-i
cation o f cDNA end)技术分别得到该基因 cDNA的
5、3末端序列, 电子拼接后获得全长序列为 1 013
bp, 据此全长序列设计引物用高保真酶获得包含
开放阅读框序列片段, 将该片段测序后与全长序
列比对, 用以验证电子拼接全长序列的准确性。
将该基因 cDNA全长登录, 命名为 CHj DEF, G en-
Bank登录号为 HM7 73024, 其编码蛋白质登录号
为 ADL574121。
12 红十八学士 CHj DEF基因编码蛋白质的生
物信息学分析方法
利用 NCB I( http: / /wwwncb inlmnihgov)提供的
B last在线进行结构域分析等,采用 ORF Finder在线查
找 CHj DEF基因 cDNA开放阅读框。利用瑞士生物信
息学研究所 (H ttp: / /cnexpasyorg)提供的 ProtParam
软件进行氨基酸残基数目、组成、蛋白质相对分子量、
理论等电点参数的在线分析;利用 ProtScale、HNN软件
等在线分析 -螺旋 (A lpha-helix )、-转角 ( Beta turn)、
无规卷曲 ( random coil)、延伸链 ( extend strand)及疏水
性等。利 用 SignalP 进 行信号 肽分 析 ( http: / /
wwwcbsdtudk/ serv ices/S igna lP / );采用 SW ISS-MOD-
EL( http: / /www. expasy. org /sw issmod)同源建模 ( ho-
mo logy modeling)预测该基因编码蛋白质的三维结构。
利用 PROSCAN ( http: / /npsa-pb il ibcpfr)进行预测编
码蛋白质的特定位点分析。
2 结果与分析
21 CHj DEF基因 cDNA核苷酸序列与其他物种比
对分析
采用最大似然法 (M ax imum Like lihood, ML)构
建的系统发育树 (图 1)表明, 红十八学士 CHj -
DEF属于 AP3基因家族成员, 且与近缘短柄山茶聚
在一起。
22 CHj DEF基因预测编码蛋白质序列一级结构
分析
开放阅读框分析显示, 红十八学士 CHj DEF
基因 cDNA全长有多个转录起始位点 atg (图 2), 经
B last比对后发现完整开放阅读框位于 97 - 777区
域, 编码蛋白质包含 226个氨基酸残基。预测蛋白
质的分子量 2609 kD, 理论等电点 903, 酸性氨基
酸残基总数 (A sp+ G lu)为 29,碱性氨基酸残基总数
( A rg+ Lys)为 35,原子总数为 3665,分子式为 C1131
H 1836N 338O 350 S10。不稳定系数为 4320, 表明该蛋白
为不稳定蛋白。
根据氨基酸分值越低亲水性越强, 相反则疏水
性越强的原则可知,在 150- 155区域分值最低接近
- 25,表明此处亲水性最强; 而疏水性较强的区域
有 3个,分别位于 45- 48、75- 80、195- 205个氨基
酸残基 (图 3)。该基因编码蛋白的信号肽分析结果
表明,无信号肽存在 (图 4)。
23 CHj DEF基因编码蛋白质二级结构分析
从图 5可以看出, CHj DEF基因预测蛋白质的
二级结构主要以 -螺旋为主, 达 4248% , 并且主
要分布在氨基酸残基的 66- 167区域; 其次为无
规卷曲达 4071%, 主要分布于整个氨基酸残基的
两端; 最少的延伸链也占 1681%。无 -转角分布
区域。
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2011年第 2期
方括号中为该序列的 GenBank登录号
图 1 红十八学士 CjHDEF基因 cDNA全长序列与其他物种构建的系统发育树
图 2 红十八学士 C jHDEF基因开放阅读框分析
24 CHj DEF基因编码蛋白质三级结构分析
蛋白质的功能很大程度上取决于其空间结构,
其中 -螺旋主要功能是对蛋白质骨架起到稳定作
用,而无规卷曲结构决定了蛋白质的功能,特别是酶
的功能部位常常处于这种构象区域, 通过对蛋白质
三级结构预测与分析, 对理解该蛋白质功能与结构
之间的关系有着重要意义。从图 6可以看出, CHj -
DEF基因预测的编码蛋白质三级结构主要以 -螺
旋为主,并占最大比重, 其次为无规卷曲,而延伸链
所占比重最小,这与二级结构所预测结果相符。
25 CHj DEF基因预测编码蛋白质结构域分析
通过 NCB I B last分析发现, CHj DEF基因编码
的蛋白质具有典型的 MADS-box蛋白质结构域, 编
码蛋白类型为 M IKC型 (图 7)。
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2011年第 2期 朱高浦等 :完全重瓣型山茶花品种 红十八学士 CHj DEF基因 cDNA的序列分析
图 3 红十八学士 C jHDEF基因预测编码
蛋白质亲 /疏水性分析
图 4 红十八学士 CjHDEF基因预测编码
蛋白质信号肽分析
-螺旋占 4248% (最长竖线 ) ;无规卷曲占 4071% (最短竖线 ) ;延伸链
占 1681% (中长竖线 )
图 5 红十八学士 CjHDEF基因预测编码蛋白质二级结构分析
图 6 红十八学士 C jHDEF基因推导的
编码蛋白质三级结构 [ 11- 13]
图 7 红十八学士 C jHDEF基因编码蛋白质的 Blast结果
26 CHj DEF基因编码蛋白质特定位点分析
从表 1特定位点分析表明, CHj DEF基因预
测编码的蛋白质以蛋白激酶 C磷酸化位点最多,
分布在 15 - 151氨基酸残基中, 平均每隔 225
个氨基酸残基就有一个蛋白激酶 C磷酸化位点
出现; 其次为酪蛋白激酶 磷酸化和 N-豆蔻酰化
位点, 各为 3个, 其中 N-豆蔻酰化主要分布氨基
酸残基的 C-末端; 而磷酸化位点合计有 11个, 集
中分布在氨基酸残基的 15 - 177区域, 平均每
148个氨基酸残基中就有一个出现, 在该蛋白质
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2011年第 2期
组成的总共 226个氨基酸残基中, 平均每 206
个中就有一个磷酸化位点。特定位点分析还表
明, 其蛋白质家族标志位于 3 - 57氨基酸残基
区域。
表 1 红十八学士 C jHDEF基因预测编码蛋白质特定位点
位点名称 位点分布 位点数
N-糖基化 13- 16( NSTN) 1
蛋白激酶 C磷酸化 15- 17( TNR) ; 22- 24 ( SKR) ; 51- 53( TGK );
63- 65( STK) ; 131- 133( SVK) ; 149- 151( TQK )
6
酪蛋白激酶磷酸化 82- 85( SHYE) ; 117- 120( SYEE ) ;
170- 173 ( SKEE )
3
酪氨酸激酶磷酸化 171- 177 (KEEDPQY) ;
133- 140 (K IIRDRKY )
2
N-豆蔻酰化 178- 183 (GLVDNG ); 183- 188 (GVDYNS) ;
216- 221 (GSDLTT )
3
MADS-box家族蛋白标志 3- 57( RGK IQIKRIENSTNRQVTYSKRRNGLF
KKANELTVLCDAKVSIIMVSSTGKLHEF )
1
3 小结与讨论
从完全重瓣山茶 红十八学士 中得到 CHj DEF
基因 cDNA全长,利用生物信息学分析软件对该基
因编码的蛋白质结构进行了预测和分析。 CHj DEF
基因 cDNA全长 1 013 bp, 有一个完整的开放阅读
框,编码 226个氨基酸。预测的该蛋白不稳定系数
达 4320,表明该蛋白为不稳定蛋白,这与 DEF基因
只在植物开花期特异表达相符。没有信号肽出现。
预测蛋白质的高级结构发现,该蛋白质通过以 -螺
旋、无规卷曲以及延伸链等 3种构象存在, 无 -转
角等结构。该蛋白具有典型的 MADS-box结构域,
属于 M IKC型蛋白。
蛋白激酶 C是 G蛋白偶联受体系统中的效
应物, 受 Ca2 +的作用而被激活, 蛋白激酶 C能激
活细胞质中的靶酶参与生化反应的调控, 同时也
能作用于细胞核中的转录因子, 参与基因表达的
调控。 C Hj DEF基因 cDNA全长中有 6个蛋白激
酶 C磷酸化位点, 表明该基因与 红十八学士 花
器官发育细胞的生长和分化密切相关。此外, 分
析的特定位点共有 11个为磷酸化位点, 这就说明
该基因在花器官发育的细胞信号传递过程中占有重要
地位。本研究通过生物信息学方法分析了 CHj DEF基
因编码蛋白质的结构及功能,其在山茶重瓣花器官发
育中的作用尚需深入探讨。
参 考 文 献
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