全 文 ：·综述与专论·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 10 期
单链抗体的表达
代鹏 周广青 马军武
(中国农业科学院兰州兽医研究所 家畜疫病病原生物学国家重点实验室 国家口蹄疫参考实验室
甘肃省生物检测工程技术研究中心，兰州 730046)
摘 要: 单链抗体(scFv)是具有抗体活性的最小功能结构单位，是基因工程抗体研究领域中的热点，具有比单克隆抗
体在生物病原体、微生物污染和寄生虫病等预防、检测和治疗的独特优点和应用前景。鉴于其重要性，单链抗体在不同的表
达系统中得到表达与研究。简要综述了 scFv的表达。
关键词: 单链抗体 表达系统 外源基因
Expression of Single-chain Variable Fragment
Dai Peng Zhou Guangqing Ma Junwu
(State Key Laboratory of Veterinary Etiological Biology，National Foot and Mouth Disease Reference Laborator，
Gansu Provincial Engineering and Technique Research Centre on Biological Detection，Lanzhou Veterinary
Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Lanzhou 730046)
Abstract: Single chain Fragment variable(scFv)is the smallest function structure units with antibody active and the hot spots in
the field of genetic engineering antibody． Compared with monoclonal antibodies，scFv features much unique advantages and application
prospect in prevention，detection and treatment of biological pathogens，microbial contamination and parasitic disease． As its importance，
scFv has got expressed and researched in different expression systems． scFv expression were summarized briefly．
Key words: Single-chain variable fragment Expression system Heterologous gene
收稿日期:2011-05-04
基金项目:中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金项目(B2F100306)
作者简介:代鹏，男，硕士研究生，研究方向:动物病毒病免疫学与诊断;E-mail:rarfen@ 163． com
通讯作者:马军武，男，博士，研究员，研究方向:兽医病毒病免疫和分子诊断技术;E-mail:majunwu88@ tom． com
单链抗体(single-chain variable fragment，scFv)
是由一段适当的寡核苷酸(Linker)在 DNA 水平上
将抗体轻链和重链可变区基因连接起来，使之在生
物体内表现为单一肽链，具有抗体活性的最小功能
结构单位，并能与多种效应分子相连构建成新功能
抗体分子的理想元件，是基因工程抗体研究领域中
的热点之一［1］。如今，scFv 逐渐替代单克隆抗体
(mAb)成为治疗和检测肿瘤、炎症、自身免疫病、乙
肝及艾滋病等疾病的有价值分子，在生物病原体、寄
生虫和微生物污染等预防和检测具有很大的应用前
景。Kim 等［2］将超顺磁性氧化铁纳米颗粒(SPI-
ONs)和 scFv 组成 abf-SPIONs，对治疗癌胚抗原
(CEA)具有潜在作用。Shanta 等［3］应用针对淀粉
样前体蛋白(APP)的 scFv 抑制阿尔茨海默氏病细
胞 β-分泌酶的活性，解决了 mAb 在治疗过程的
困难。
scFv已在不同的表达系统表达，包括原核表达
系统(如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌)和真核表达系统
(如酿酒酵母、毕赤酵母、昆虫细胞、植物细胞和动
物细胞)。影响 scFv 表达产量和活性的因素很多，
例如 scFv 的大小、溶解性、稳定性和氨基酸序列。
因此，在表达 scFv时要根据不同类型 scFv的表达要
求以及产品最终所需的纯度和数量来选择最佳表达
系统［4］。
1 scFv的表达
1. 1 细菌表达
在细菌表达系统中，大肠杆菌(E． coli)是应用
最广泛，遗传背景相对清楚，具有使用安全、操作简
2011 年第 10 期 代鹏等:单链抗体的表达
单、能够大量表达外源基因的表达系统。E． coli 表
达系统主要表达非糖基化的包括 scFvs 在内的抗体
分子［5］。与哺乳动物细胞系相比较，E． coli 表达系
统是较快速和容易表达抗体，因此适用于抗体的大
规模筛选和生产［6］。此外，利用 E． coli 表达体系可
以获得高浓度的多克隆抗体(rAb) ，且有报道表达
量达到 2 g /L。然而，E． coli不适合于表达糖基化蛋
白，因此若要表达糖基化蛋白，如 scFv-Fc 融合蛋
白，则需要选择其他的表达体系。
E． coli 表达系统针对表达不同活性 rAbs 而存
在不同的表达部位，包括分泌到胞外、周质间隙、膜
外或内部和细胞质内［7］。利用启动子如 lac、trp 和
tac诱导抗体表达，这些启动子可被 lac 阻碍物调节
和异丙基-β-半乳糖苷酶(IPTG)诱导。细胞质减少
的情况下，表达可以得到高浓度抗体，但容易积累形
成包涵体，因此需要变性试剂进行处理，然后复性。
不同抗体的复性效率也不同，尤其是 scFv［8］。Gou
等［9］用镍螯合色谱层析柱复性的方法，从包涵体中
成功复性浓度大于 40 mg /L 具有活性的 IP10-scFv
融合蛋白。另外，scFv的表达可以在 pelB 前导序列
调控和氧化环境下，分泌到周质间［10］或使用 E． coli
α-溶血素(HylA)系统分泌到培养基上清液［11］。
HylA是 E． coli 内外膜之间形成的Ⅰ型蛋白分泌通
道，溶血毒素可以通过这个蛋白通道分泌出去。这
个系统已证实有分泌包括 scFv 在内的外源蛋白
能力。
E． coli 表达系统表达非糖基化 scFv 有一定优
势，但表达产量取决于 scFv 的特性。已报道 E． coli
表达系统表达了几种不同类型的 scFv，包括单价和
多价 scFv、scDbs、taFvs、scFv-免疫毒素轭合物和多
价 scFv复合物如三聚物、四价微型抗体［12］。
外源基因表达过程是一个复杂的过程，包括基
因的转录、转译、转译后加工、细胞代谢和细胞内基
因与蛋白、蛋白与蛋白之间的相互作用。进入后基
因时代后，E． coli 首选为研究蛋白组学、基因功能、
蛋白质网络等新课题的模型，揭示基因表达的未知
领域，为发展 E． coli 表达系统提供了渠道。随着对
E． coli表达系统不断深入研究，更多表达机理和影
响因素会被发现，会更加完善 E． coli表达系统。
1. 2 酵母和丝状真菌表达
酵母和丝状真菌兼具有原核和真核细胞表达系
统的优点，能对蛋白质进行加工、折叠和转译后修
饰，表达 scFv 具有成本低和效益高的特点［13］。此
外，分泌到培养基上清液的抗体能够快速且轻易纯
化。与细菌表达系统相比较，酵母和丝状真菌表达
系统具有外源蛋白的分拣途径，并能利用酵母和丝
状真菌的信号序列，使抗体正确转译、折叠、加工和
分泌到培养介质中，且纯化后的蛋白含有较少的内
毒素。另外，scFv在酵母和丝状真菌表达系统中常
形成可溶性蛋白。与哺乳动物细胞不同，酵母和丝
状真菌可以在简单廉价的培养基中快速生长，因此
临床研究和工业化生产的重要蛋白可选择有潜力的
酵母和丝状真菌表达系统。染色体外繁殖的非整合
附着型载体和同源重组整合到染色体的整合型载体
两种载体已经用于酵母和真菌表达系统［4］。
酵母和丝状真菌表达系统已表达出完整的抗
体，其结合活性与来源于杂交瘤细胞相对应物的结
合活性相似［14］。基于 scFv 的微型抗体，如双链抗
体与双链抗体 －免疫毒素轭合物［15］和 scFv-Fcs［16］
在酵母和丝状真菌(如啤酒酵母细胞、毕赤酵母细
胞、泡盛曲霉和乳酸克鲁维斯酵母细胞)表达系统
中成功表达，例如裂殖酵母细胞表达抗荧光素 scFv，
毕赤酵母细胞表达抗重组人类白血病抑制因子
scFv。蛋白表达需要诱导，例如毕赤酵母细胞表达
rAb需要严格调控型的甲醇调控醇氧化酶Ⅰ型基因
启动子，有助于 rAb 在细胞外用分批处理或连续培
养的方法高水平表达［13］。最新比较毕赤酵母细胞
分批处理和连续培养方法显示，连续培养方法通过
“甲醇进量浓度的控制”增加了 scFv生产效率，从而
有希望用于抗体工业规模化生产［17］。
最近，研究者比较啤酒酵母细胞、毕赤酵母细胞
和大肠杆菌细胞表达系统，结论是大肠杆菌表达细
胞是获得纯化 scFv 速度最快表达系统［18］。然而，
酵母细胞表达人类 N-糖基化 scFv 的最新研究进展
表明［19］，酵母细胞表达系统有可能代替哺乳动物表
达系统来表达糖基化 scFv-Fc 类型抗体。今后，丝
状真菌表达系统可能用来完善在细菌或哺乳动物细
胞培养等传统方法不易表达抗体的领域，成为表达
糖基化 mAb和 scFv-Fc的取代系统。
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 10 期
1. 3 昆虫表达
昆虫杆状病毒表达系统是目前国内外常用的真
核表达系统。利用杆状病毒作为载体，在昆虫细胞
或虫体内表达外源基因，形成了昆虫杆状病毒载体
表达系统。昆虫表达系统具有真核表达系统的转译
后加工功能，如二硫键的形成、糖基化及磷酸化等，
使重组蛋白在结构和功能上更接近天然蛋白;利用
重组杆状病毒在昆虫细胞中表达有功能活性外源蛋
白可达 200 kD，因此昆虫细胞表达系统比哺乳动物
细胞表达系统有更重要的意义。杆状病毒有高度的
寄主限制范围，使得其比哺乳动物表达系统安
全［4］。此外，建立在昆虫细胞稳定转化的基础之上
的新型昆虫表达系统，具有稳定和表达效率高的优
点。目前，昆虫表达系统成功地表达了鼠源 mAb、
人 －鼠嵌合抗体及 scFv等抗体，这些抗体多数能够
正确组装，完成糖基化过程，具有相应的活性。
昆虫表达系统采用一个或多个杆状病毒启动
子，将外源目的基因插入到启动子后获得重组病毒，
并能在昆虫细胞或虫体内复制，同时表达多个外源
基因。昆虫表达系统是否能表达更高水平糖基化蛋
白是要考虑的，尽管昆虫细胞内可以完成蛋白糖基
化，与哺乳动物细胞表达系统有相同的 N-糖基化位
点，但作用方式和哺乳动物有所不同，寡糖链有本质
区别［20］。这可能是由于昆虫细胞不具有哺乳动物
细胞对成熟寡糖加工的能力。此外，不同蛋白前体
切割位点也是很重要的，虽然哺乳动物分泌信号可
以在昆虫细胞中得到精准加工，但带有信号肽序列
的未必能分泌成蛋白［21］。昆虫细胞中表达上游含
有蜂毒素信号肽的 scFv时，只获得了胞内不可溶的
前体蛋白，因为杆状病毒表达系统存在对前体蛋白
分子加工不足的缺陷;将枯草杆菌的信号肽和 scFv
共表达，在昆虫细胞的裂解液中就检测不到未经加
工的前体蛋白，分泌量也有所增加。
昆虫表达系统最大的优点是高水平表达外源蛋
白［22］。一般地讲，昆虫细胞中重组蛋白的表达量在
感染后期可占总蛋白的一半，比大肠杆菌效率要高
许多。然而外源蛋白的表达还要受到高质量的培养
基、相对较高的氧浓度以及高活性且生长在对数期的
细胞等诸多因素的影响。除此之外，所表达外源基因
的特性也会影响表达水平，例如抗泛癌抗原 scFv 与
IL-2的融合蛋白在杆状病毒表达系统中表达水平有
显著差异［23］。稳定转化的新型昆虫表达系统也应用
于 scFv的表达。抗 E-选择素应用稳定转化的新型昆
虫表达系统获得表达，产量达到0. 2 －0. 4 mg /L，但应
用细菌表达系统表达时检测不到蛋白［24］。杆状病
毒的感染可能会导致细胞裂解或虫体死亡，而许多
蛋白在胞内加工都在病毒感染的晚期进行，所以这
将使一些蛋白得不到完整的修饰。另外，昆虫细胞
与哺乳动物细胞的糖基化不完全相同，所表达出的
部分蛋白与其天然结构仍存在差异，这些问题有待
于研究。
1. 4 植物表达
scFv 是转基因植物最通常表达的基因工程抗
体。利用植物表达系统表达治疗型抗体有几个优
势，包括投资费用低，根据市场需求有可变的生产能
力，植物中不具有哺乳动物的病原体。与细菌表达
系统相比较，植物表达系统降低了内毒素的污染。
然而，植物表达系统在技术上还是存在一些障碍，如
生产周期长、调控因素的不确定性和植物多聚糖是
否能用于人类疗法［6］。上述因素可以解释至今还
没有出现商业化植物表达系统的原因。
植物表达系统和净化问题是目前研究的目标。
例如，利用烟草表达系统，通过一种连续离子交换层
析和蛋白 A 亲和层析法获得高纯度、高产量的抗
体［25］。抗体分泌到质体内或外，或定向表达到小麦
或水稻的种子中是提高抗体(如 scFv)产量的表达
策略［12］。在这些系统中，scFv在蔬菜器官表达系统
能积累高浓度的总可溶性蛋白(TSP)。在种子储藏
调控序列控制下，拟南芥纯合种子表达目标蛋白中
的 TSP比在花椰菜花叶病毒 35S启动子控制下增加
大约 36. 5%。源于转基因植物糖源型抗体的功能
与源于中国仓鼠卵巢细胞(CHO)抗体的功能是无
法区别的，但转基因植物拟南芥种子中过量产生
scFv-Fc 导致 30% － 40% 存在低糖基化，原因是
scFv-Fc在内质网中滞留和蛋白分泌途径中蛋白分
类拣选机制被干扰［26，27］。因此，种子中目标抗体过
量产生需要进行糖基化修饰。
植物没有对具有治疗作用蛋白质的稳定、折叠
和生物活性的人类 N-糖基化的能力［28］，因此植物
中生产 N-糖基化蛋白的几种工艺策略已经出现，包
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2011 年第 10 期 代鹏等:单链抗体的表达
括糖蛋白亚细胞定位、抑制植物特定糖基转运或增
加人类特定糖基转运。尽管存在一些问题，但已证
实植物表达的 scFv 与 mAbs 有类似的亲和力，并在
体外能够招募免疫效应因子的功能。另外，几种不
同类型的 scFv 已经在转基因植物中成功的表达和
纯化，包括二聚物、高价多聚体和双特异性 scFv［12］。
总之，许多抗体(例如 scFv 和 scFv 二聚体)通
过内膜系统不需要加工，因此这类型抗体在大肠杆
菌比在植物中更容易商业化的生产［29］。植物表达
系统从适用、经济和蛋白生产的安全角度考虑是
有益的，但是许多蛋白质的生产技术依然存在障
碍。未来，转基因植物可能成为比较便宜的生产
平台，用于抗体治疗中大规模生产或促进开发下
一代对抗生化恐怖试剂如肉毒菌神经毒素的抗体
表达［30］。
1. 5 哺乳动物细胞表达
哺乳动物细胞表达系统能够剪切前体 mRNA
为成熟 mRNA，具有遗传稳定性和可重复性，重组质
粒转染效率高，可带有复杂的糖链结构，和人源糖蛋
白糖链结构较为相似，故成为目前主要的外源糖蛋
白表达系统［31］。与其他系统相比，哺乳动物细胞表
达系统能够指导蛋白质正确折叠，提供复杂的 N 型
糖基化和准确的 O 型糖基化等多种转译后加工功
能，因而表达产物在分子结构、理化特性和生物学功
能方面最接近天然高等生物蛋白质分子。CHO 和
非分泌型鼠骨髓瘤细胞(NSO)细胞是常用表达重组
蛋白的哺乳动物细胞表达系统［31］。哺乳动物表达
系统选择表达载体取决于诱导外源基因进入哺乳动
物细胞的方法、使用 mRNA 表达的有效方法和蛋白
合成的控制元件。两种传统诱导外源 DNA 进入哺
乳动物细胞的方法:一是病毒感染介导的诱导方法;
二是化学试剂(脂质体、钙、磷酸盐、DEAE-右旋糖酐
和聚凝胺)和物理方法(电击和显微注射)直接介导
外源 DNA进入细胞。此外，使用外源启动子、增强
子和基因标记，可以增加抗体的产量。
哺乳动物细胞表达系统已表达基于 scFv 的微
型抗体，包括 scFv-Fcs［32］、双特异性 scFv2-Fcs
［33］、
(scFv-CH3)2 s
［34］和四价双特异性 scFv-Fcs［35］。这
些抗体需要 Fc 结构域的糖基化来调节效应功能。
scFv和 scFv-IL-2 融合蛋白在 CHO细胞中表达已被
作为一种替代细菌表达 scFv的表达系统［36］。
2 结论
大多数原核和真核生物的细胞、组织和器官都
可以作为表达系统，但每一种表达系统都有自己的
优点和局限性(表 1) ，因此在表达 scFv 时，应充分
考虑各种因素，例如 scFv 性质、生产成本、表达水
平、安全性、表达周期等来选择表达系统。大肠杆菌
表达系统是使用最早，研究最为深入，表达非糖基化
小分子蛋白的首选表达系统。酵母和昆虫细胞表达
系统有一定的转译后修饰功能，但表达的外源蛋白
与天然蛋白存在差异。昆虫表达系统能够高水平表
达外源蛋白。植物表达系统是适用、经济和安全的
蛋白生产系统，可是技术上存在一些障碍。哺乳动
物细胞表达系统具有完整的转译后修饰功能，但表
达量低、成本高、周期长。
表 1 几种产生外源蛋白的表达系统比较
系统 生产成本 表达周期 表达水平 糖基化 安全性 成本
细菌 低 短 高 无 内毒素 适中
酵母 中等 中等 低 －高 高度甘露糖基化 低 适中
昆虫细胞 高 中等 低 －高 高度甘露糖基化 高 昂贵
哺乳动物细胞 高 长 低 －适中 与人类相似 病毒和朊病毒 昂贵
转基因动物 高 很长 适中 －高 与人类相似 病毒和朊病毒 昂贵
植物细胞 低 短 适中 －高 差异细微 低 便宜
转基因植物 很低 长 适中 －高 差异细微 低 便宜
糖基化作用是与人类相比较而言
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 10 期
此外，为了达到治疗目的，需要大剂量的抗体。
在某些情况下，一个病人一年需要超过 1 g 的抗体，
因此，有必要开发效益高且成本低的抗体生产系统。
相信随着遗传改造、蛋白质组学及分子生物学的发
展，外源基因的表达系统不断优化和完善，scFv 的
表达系统也更加完善。
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(责任编辑 狄艳红)
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