全 文 ：·附4· 中草莠 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第7期2006年7月
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单链抗体技术及其在药用植物研究中的应用
马丽玲1，晁志弘，田中宏幸3
(1．广州医学院护理学院药检学科组，广东广州 510182；2．南方医科大学中医药学院，
广东广州 510515；3．九州大学大学院药学研究院，日本福冈812—8582)
抗原刺激动物免疫系统产生抗体，抗体识别抗原的部位
在其重链和轻链的可变区(variableregion)。如果将抗体的
可变区(VH和VL)通过弹性多肽接头(peptidelinker)稳定
地连接在一起，即为单链抗体(singlechainfragmentsvari—
able，scFv)。scFv大小仅为完整抗体的1／6，但其完全保持了
抗体的抗原特异性及抗原的结合能力，同时由于为单链，在
大肠杆菌或植物体内等容易表达，无须组装即能保持活性。
在植物研究领域，其可用于植物病理诊断、植物生物活性成
分的检测、定量分析与分离精制}而将单链抗体基因转入植
物细胞，更可使转基因植物获得渚如增强对病毒、除草剂等
的抗性，体内生理活性物质增加，次生代谢产物量提高等新
的特性。特别是通过转入单链抗体基因，提高药用植物中具
生物活性的次生代谢产物量的技术，可望发展成为一种新的
分子育种方法，可以在不需要明了目标成分的生物合成途径
的情况下，提高其产量。
1单链抗体的构建[I]
基因工程单链抗体技术的基本原理是：首先从杂交瘤细
胞[2j、外周血淋巴细胞[33中提纯mRNA，再经逆转录一聚合酶
链反应(RT—PCR)分别扩增抗体的重链可变区和轻链可变
区编码基因，人工合成一条寡核苷酸序列(即多肽接头)，将
VL的C端与VH的N端或Vn的C端与V。的N端相连接，
构建成单链抗体基因，在一定的表达系统中得以表达。
人工合成的寡核苷酸多肽接头序列，在单链抗体的构建
中十分重要，接头必须能使重、轻链可变区自由折叠，使抗原
结合位点处于适当的构型，并不引起分子动力学改变，目前
使用最多的接头序列是Huston根据X射线晶衍射分析抗
体可变区结构的15肽序列(Gly。Ser)。，许多研究者应用此序
列构建单链抗体基因并表达出活性产物。
单链抗体的C末端可以引入半胱氨酸尾、酪蛋白激酶
底物尾、E尾等结构，有助于标记和偶联其他分子；也可以引
入钙调蛋白尾、c—myc尾、葡萄球菌A蛋白尾、脂类标签、组
氨酸尾等，使表达产物易于检测和纯化。
常用的单链抗体表达系统有细菌(最常用为大肠杆菌
Escherichiacoli)、酵母、动物细胞(昆虫细胞、COS细胞、
CHO细胞等，最常用为乳腺细胞)、植物细胞、噬菌体等。其
中使用噬菌体的表达技术称为噬菌体展示(phagedisplay)，
是近年来常用的一种手段。
2单链抗体技术在植物研究中的应用
单链抗体技术在肿瘤的诊断和生物治疗方面显示良好
的应用前景[4]，备受瞩目以外，随着近年来抗体工程学的进
步，在植物学研究领域，scFv及其应用也日益受到重视。
2．1植物病理诊断：Harper等“]从合成的噬菌体抗体库中
筛选出了针对马铃薯卷叶黄症病毒(potatoleafroll
luteovirus，PLRV)特异的单链抗体；然后将编码此scFv的
DNA重组至pDAP2质粒中，转化大肠杆菌，用异丙基一pD一
硫代半乳糖苷(IPTG)诱导其产生抗PLRV单链抗体——碱
收藕日期：2006—01—16
基金硬且：国家自然科学基金项且(30500652)
作者筒介：马丽玲，女，江西高安人，讲师，主要从事生物化学及检验研究。
*通讯作者晁志Tel：(020)61648256E—mail：chaozhi@fimmu．eom
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万方数据
’中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第7期2006年7月·附5·
性磷酸酶融合蛋白(产物质量浓度为10mg／L培养液)。此
融合蛋白能够直接应用于ELISA法，来检测被感染植物汁
液中的PLRV。
2．2增强植物抗病害性：Tavladoraki等[6]将抗朝鲜蓟斑纹
病毒(artichokemottledcrinklevirus，AMCV)外壳蛋白抗
体的scFv的编码基因通过农杆菌介导，转入烟草细胞；再生
的植株体内检测到其表达，具有抗AMCV的特性，针对
AMCV的抗性是和scFv的表达直接相关的。
Fecker等[73对甜菜坏疽黄脉病毒(beetnecroticy llow
veinvirus，BNYVV)的研究也证明了抗BNYVV外壳蛋白
scFv的表达能产生具有防止或减少BNYVV感染能力的烟
草植株。他们分别对表达抗BNYVV外壳蛋白scFv的烟草
植株和对照植株接种BNYVV，发现在前者中检测到感染的
时间长于后者；另外，表达scFv的植株在感染后期，病毒引
起的病症较对照轻。这说明抗BNYVV外壳蛋白scFv在植
物中的表达，增强了植物对BNYVV感染的抵抗能力，延迟
发病，减轻发病后的症状。
Eto等[81将抗除草剂氯苯胺灵(chlorpropham)的scFv
转入拟南芥Arabidopsisthalicana(L．)Heynh．细胞，分别
定位于内质网(endoplasmiereticulum，ER)腔、胞质溶胶
(cytos01)、质外体(apoplasticspace)和质膜上，经检测，除了
胞质溶胶以外，都可以发现抗氯苯胺灵scFv的表达。其中，
在内质网中有高scFv表达量的转基因植物与没有转入scFv
基因的植物相比，对氯苯胺灵的抗性明显增强。
2．3增加植物生理活性物质：Artsaenko[9]在研究脱落酸
(abscisicacid，ABA)的生理功能的过程中，通过农杆菌介导
转入抗ABAscFv基因，在烟草细胞表面表达了具活性的抗
ABAscFv，使得植物体内ABA以和scFv结合体的形式沉
积于内质网，促进植物不断合成ABA，并大量积累，可达
120～1050ng／g植株鲜重，是普通野生型烟草植株(30～
100ng／g)的2～10倍。
3单链抗体应用于药用植物研究
3．i提高药用植物中具生物活性的次生代谢产物量：转入
scFv基因可赋于植物新的特性。基于此，提出了将药用植物
中具生物活性的次生代谢产物的scFv基因，转入基原植物，
以提高该物质在植物中量的设想。毛喉素(forskolin)是腺苷
酸环化酶的直接激动剂，来源于唇形科植物毛喉鞘蕊花
Coleusforskahlii(willd．)Briq．，现作为强心、降压药使用。
由于其结构特殊，化学合成困难而不经济。若将抗毛喉素单
链抗体基因转入毛喉鞘蕊花，可能培育出含毛喉素较高的新
品种，从而提高毛喉素的产量[2]。
在此思想指导下，田中宏幸等[1们针对药用植物喀西茄
SolanumkhasianumC．B．Clarke中的药理活性成分澳洲茄
碱糖苷(solasodineglycosides)制作了单克隆抗体，从分泌抗
体的杂交瘤细胞中提取RNA，扩增出Vn、V。基因并构建了
scFv，通过载体转化发根农杆菌插入Ri质粒T—DNA中，然
后感染喀西茄植株，诱导产生毛状根。在毛状根中检测到
scFv的表达，同时澳洲茄碱糖苷的产量较未转化的普通毛
状根上升了3倍，产量与scFv的表达水平呈正相关。
这种方法可望逐渐发展成为一种新的分子育种方法．特
别是其可以在不需要明了目标成分的生物合成途径的情况
下，提高其量的特性，使其在绝大多数成分的生物合成途径
还未阐明的药用植物研究领域有广阔的应用前景[1“，特别
是一些重要的化合物，如紫杉醇等。
3．2植物生物活性成分的检测、定量分析与分离精制：药用
植物生物活性成分的检测、定量分析与分离精制。目前，单克
隆抗体已经广泛应用于研究[12““。最近的例证表明．单链抗
体具有和单克隆抗体相同的基本特性，因而也有良好的应用
前景。
陆昭华等[171从分泌抗芍药苷单克隆抗体的杂交瘤细胞
株C3189中，克隆了可变区(VH和VI)基因，以(Gly。Ser)s
接头DNA连接；装配成的scFv基因重组至pET28a质粒，
大肠杆菌中表达．得到内涵体形式的重组蛋白；经重折叠
和纯化，从100mL培养液中得到1．89mgscFv。得到的
scFv与母体单克隆抗体(MAbC3189)具有相似的特性，将
其应用于ELISA法，测定白芍药材中芍药苷和芍药内酯苷，
线性范围为0．78～25pg／mL。
4结语
单链抗体技术应用于药用植物研究领域的时间虽然比
较短，这方面的研究还比较少，但其在药用植物的优质品种
培育，以及药用植物生物活性成分的检测、定量分析与分离
精制方面已显示出了其特有的潜力。随着研究的拓展和深
入，可望取得比较大的发展。
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硒多糖的研究与应用进展
李晓坤，闰吉昌’，崔晓莹，翟玉娟，石金娥，闫福成
(东北师范大学化学学院，吉林长春130024)
硒是生命必需的微量元素[I]，是谷胱甘肽过氧化物酶的
主要活性成分，它可以直接或间接地清除体内氧自由基，可
抑制脂氧化或过氧化，并能引起过氧化物的广泛分解或还
原。某些癌症、肿瘤、心血管疾病、克山病、大骨节病和艾滋病
等[2“1都与体内缺硒有关。
但是，硒不能由生物体自主合成，只能通过外吸收获得。
硒在自然界中的存在形式分为无机硒与有机硒2种。与无机
硒相比，有机硒因其具有更高的生物活性和更低的毒性而易
被生物体吸收利用。有机硒包括硒多糖、硒蛋白、硒核酸等。
其中硒多糖又称硒酸酯多糖、硒化卡拉胶(Kappa—Se)，是硒
与活性多糖键合的化合物。硒多糖能发挥微量元素硒和多糖
的双重功能，并且活性高于硒与多糖。目前国外多研究有机
硒药物的合成及在生物体内的作用和代谢机制，但对硒多糖
的研究较少。而我国的中药中，大多数都含有多糖甚至硒多
糖，因此研究和应用较多。近年来，硒多糖在抗氧化、抗肿瘤、
免疫调节、抗衰老等发面发挥越来越多的作用。
1焉多糖的来源与结构
硒多糖一般存在于高等植物、微生物中。硒作为硒多糖
的特征性部分[5]，在硒多糖中的存在形式可能有一SeH和
R。seo：R。2种，其中后者同时含有硒氧单键和硒氧双键。硒
多糖在天然植物或微生物中量甚少。在高硒地区的富硒植物
中，所含硒多糖中硒也仅有百分之一。但利用一定的富硒手
段如人工协迫富硒栽培、富硒酵母培养等可以使硒多糖增
加。Lisk等[6]经过实验证实，市售大蒜的含硒量小于0．05
flg／g，而通过人工富硒培养可达到0．1～1．355mg／g。
不仅硒多糖在植物和微生物中量较少，同时与硒键合的
多糖结构复杂，这都给硒多糖的提取和纯化以及结构分析带
来一定的困难。借助于凝胶色谱和薄层色谱等可进行分离纯
化，借助于紫外、红外和核磁共振等波谱可对硒多糖进行结构
验证。已经有很多研究者进行天然硒多糖的提取、分离和利用
生物或化学手段进行人工合成的研究，并取得一定的成果。
1．1 天然硒多糖的提取：尚德静等口3对灵芝菌丝深层富硒
培养后，利用DEAE—cellulose柱色谱纯化出6种硒多糖，并
对其中的1种SeGLP一1进行了结构分析。经SephadexG—
100、聚丙烯酰胺凝胶电泳和紫外光谱分析鉴定，SeGLP一1为
均一组分；经红外光谱分析，确定SeGLP一1是由a一糖苷键连
接的吡喃多糖。同时，测得SeGLP一1中含硒的量为1．642
mg／g；并利用红外光谱、核磁共振、激光拉曼光谱等推断，
seGLP。中se活性中心的可能为O=Se—O，即se取代了灵
芝多糖GLP。中甲氧基结构上的甲基，从而形成了硒氧双键
结构。
杨铭等利用G25一G200葡萄糖凝胶色谱柱进行滤过，从
湖北高硒地区恩施产的富硒大蒜中提取分离出相对分子质
量为I．5×104的大蒜硒多糖，经高效液相色谱法及纸色谱
检验，其组成化学成分均一，为甘露聚糖与硒的化合物。药现
实验表明，大蒜硒多糖具有清除活性氧自由基的能力，对
Sio。引起的细胞损伤有保护作用，对细胞特异性病变抑制
显示出较好的结果，对人巨细胞病毒形成空斑的抑制率为
38．60A。能阻止高分子蛋白质的形成，在预防紫外照射对晶
状体的氧化拐伤有重要的保护作用。
1．2人工合成：在保留了硫酸酯多糖的基本构型的情况下，
利用硒取代部分硫制备了硒化角叉菜胶。动物实验表明，硒
化角叉菜胶的生物利用性与生理增益效应均优于亚硒酸钠。
刘建林等[93对硒化一一角叉菜胶进行元素分析、红外光谱、拉
收疆日期：2005—09—02
作者筒介：李晓坤(1977一)，女，硕士研究生，分析化学专业，主要从事硒多糖的合成研究。E—mail：lixk011@nenu．edu．ca
*通讯作者囝吉昌
万方数据
单链抗体技术及其在药用植物研究中的应用
作者： 马丽玲， 晁志， 田中宏幸
作者单位： 马丽玲(广州医学院护理学院药检学科组,广东,广州,510182)， 晁志(南方医科大学中医药
学院,广东,广州,510515)， 田中宏幸(九州大学大学院药学研究院,日本,福冈,812-8582)
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2006,37(7)
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