全 文 ：·技术与方法·
生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 11期
cDNA2AFLP和 cDNA2SRAP技术在植物基因
差异表达上的应用及其分析比较
吴建明 1, 2, 3, 4 李杨瑞 1, 2, 4 杨柳 1 王爱勤 1 杨丽涛 1熊发前 2 甘崇昆 5
(1广西大学广西亚热带生物资源保护利用重点实验室 ,南宁 530004; 2广西作物遗传改良生物技术重点开发实验室 ,南宁 530007;
3广西农业科学院经济作物研究所 ,南宁 530007; 4中国农业科学院甘蔗研究中心 ,南宁 530007; 5广西崇左市江州区土肥站 ,崇左 532200)
　　摘 　要 : 　对 cDNA2AFLP和 cDNA2SRAP技术在植物上的应用研究进行了介绍 ,指出 cDNA2AFLP和 cDNA2SRAP技术已
逐渐成为基因表达研究的重要工具 ,是构建转录图谱、定位目标性状位点、研究差异基因表达等研究的主要手段 ,具有广泛广
阔的应用前景。但是 cDNA2AFLP和 cDNA2SRAP技术均具有一定的缺限 ,主要表现在获得的差异片段还不够全面丰富。 cD2
NA2AFLP可以扩增到扩增较多的带 ,但试验程序比较繁琐、昂贵而且耗时较长、操作较困难 ;而 cDNA2SRAP相对比较简便、便
宜而耗时较短 ,较易操作。因而将 cDNA2AFLP与 cDNA2SRAP技术结合起来 ,可望得到更全面丰富的差异片段 ,从而在植物基
因差异表达、新基因发现、抗逆性分子机理研究等方面发挥更大的作用。
关键词 : 　cDNA2AFLP cDNA2SRAP 分子标记 差异表达
收稿日期 : 2009208204
基金项目 :国家科技支撑计划项目 (2007BAD30B03) ,广西科技攻关重点项目 (桂科攻 078200423)
作者简介 :吴建明 (19782) ,男 ,广西宁明县人 ,助理研究员 ,博士研究生 ,从事植物生理生化和生物技术研究 ; E2mail: wujianm ing2004@126. com
通讯作者 :李杨瑞 , E2mail: liyr@ gxaas. net
Applications of cDNA2AFLP and cDNA2SRAP
M ethods for Gene D ifferentia l Expression Analysis
in Plant and the Techn ica l Comparison
W u J ianm ing1, 2, 3, 4 L i Yangrui1, 2, 4 Yang L iu1 W ang A iqin1 Yang L itao1, 4 Xiong Faqian2 　Gan Chongkun5
(1 Guangxi Key Laboratory of Subtropical B ioresources Conservation and U tiliza tion, Guangxi University, N anning 530004;
2 Guangxi C rop Genetic Im provem ent and B iotechnology Lab, N anning 530007; 3 Cash C rops Research Institute, Guangxi
Academ y of Agricultural Sciences, N anning 530007; 4 Sugarcane R esearch Center, Chinese Academ y of Agricultural
Sciences, N anning 530007; 5 Guangxi J iangzhou D istrict Soil and Fertilizer S tation, Chongzuo 532200)
　　Abs trac t: 　The app licationof cDNA2AFLP and cDNA2SRAP in p lant species was reviewed in this paper. Both cDNA2AFLP and
cDNA2SRAP techniques have become important app roaches to study gene exp ressions, especially in constructing transcrip tional map s,
mapp ing objective traits aim characters and gene differential exp ressions in p lant. But both methods have certain lim itations, and the
main p roblem is the obtained differential fragments are not comp letely satisfied. In comparison, the p rotocol of cDNA2AFLP seem s com2
p licated and costly, which could amp lify more polymorphic bends. The p rotocol of cDNA2SRAP is simp ler and cheaper than that of cD2
NA2AFLP. Combination of both cDNA2AFLP and cDNA2SRAP techniques may obtain longer and more comp lete differential fragments
than each individuals, thus could p lay great roles in studying gene differential exp ressions, finding new genes and investigating the mo2
lecular mechanism s of stress resistance in p lants.
Key wo rds: 　cDNA2AFLP cDNA2SRAP Molecular marker Gene differential exp ression
　　基因表达 ( gene exp ression)是指细胞在生命过
程中 ,把储存在 DNA序列中的遗传信息经过转录和
翻译 ,表达成具有生物功能的蛋白质分子。生物体
内的各种功能蛋白质和酶都是由相应的结构基因编
码的。因此研究基因的差异表达对生物的不同特
性、调控机理及基因功能的研究均具有重要意义。
2009年第 11期 　　吴建明等 : cDNA2AFLP和 cDNA2SRAP技术在植物基因差异表达上的应用及其分析比较
目前 ,基因的差异表达研究领域越来越广阔 ,已涵盖
形态发生、胚胎发育、信号传导、细胞衰老凋亡、抗
性、免疫调控及植物生长调控等各个方面 ,在这些领
域里也取得了显著的研究进展 [ 1 ]。主要对 cDNA2
AFLP和 cDNA2SRAP技术在植物上的应用研究进
行了介绍 ,并在原理、方法、试验成本及试验结果等
方面对 cDNA2AFLP和 cDNA2SRAP两种技术进行
了分析比较 ,旨在为两种技术在植物基因差异表达
上的应用提供参考。
1　cD NA2AFL P在植物上的应用
cDNA2AFLP技术是 Bachem等于 1996年发明 ,
并应用于 mRNA差异表达分析。 cDNA2AFLP技术
研究的比较早应用的也比较广泛 ,目前在构建转录
图谱、定位目标性状位点、研究差异表达等方面具有
重要作用。
据 Becham等 [ 2 ]研究表明 ,在未知基因序列的情
况下 ,用 cDNA2AFLP技术分别研究了 3个遗传性杂
合的无性繁殖马铃薯品种的群体单株间和拟南芥自
交系间杂交 F2群体单株间的差异表达。Suarez等 [ 3 ]
利用 cDNA2AFLP技术分析木薯作图群体的一对亲
本 ,获得了 500多个包含基因表达信息的 TDFs( tran2
scrip ts2derived fragments)。王永勤等 [ 4 ]利用 cDNA2
AFLP技术 ,对白菜核雄性不育两用系可育株群和
不育株群进行分析 ,结果表明 :花蕾之间基因表达存
在差异 ;莲座期叶片之间、开花期叶片之间和花茎之
间基因表达无差异 ,叶片、花茎和花蕾之间基因表达
存在差异。潘玉欣等 [ 5 ]用 cDNA2AFLP技术对棉纤
维发育次生壁加厚期基因表达谱进行剖析 ,并构建
了次生壁加厚期转录组图谱。在 75个 TDFs中 , 37
个和已发表的棉纤维 EST同源性较高 , 9个和已克
隆的棉纤维基因同源性高 ,其他 TDFs可能代表棉
纤维发育过程中的新基因片段。马小定等 [ 6 ]应用
cDNA2AFLP技术对棉花 m s5m s6双隐性核雄性不育
两用系的不育株和可育株花粉发育的 3个时期进行
基因差异表达分析 ,共得到 17个差异表达片段 ,其中
14个片段可以在 GenBank数据库中找到同源序列 ,
功能注释分析表明这些片段所编码的蛋白质可能参
与了信号转导、转录、能量代谢、细胞壁发育等相关过
程。张莉等 [ 7 ]以茶树无性系龙井 43种子为材料 ,利
用 cDNA2AFLP差异显示方法 ,从 64对引物筛选出的
差异片段中克隆出 10个低温差异表达片段 ,有 7个
在 GenBank数据库中与小分子量热激蛋白、MYB类
转录因子、衰老相关蛋白、F2box家族蛋白、蛋白激酶、
磷酸二酯酶等基因有较高同源性。Polesani等 [ 8 ]用
cDNA 2AFLP技术分析人工感染易感品种的叶片 ,用
水处理的叶片和抽样纯孢子囊作为对照 ,用 128对引
物 ,在受感染的叶片中得到约 7 000 TDFs, 1 196个片
段有差异表达 ,其中 804个片段被确定为葡萄转录
子 ,而 96个片段被确认为葡萄霜霉病基因。Subhash
等 [ 9 ]通过 cDNA 2AFLP技术分析栝株雄花和雌花的
差异表达 ,结果得到 31个差异片段 , 23个雄性和 8个
雌性 ,通过克隆、测序和分析后 ,得到 1个控制雄性的
片段。刘磊等 [ 10 ]应用 cDNA2AFLP技术 ,对低钾胁迫
下烟草 NC89根系基因表达进行了 mRNA指纹分析 ,
通过 240对引物组合的筛选 ,共得到 324个差异表达
片段 ,其中 7个 TDF涉及逆境响应、氨基酸的转运与
代谢、转录调控及钾吸收 , 2个 TDF为功能未知。以
上说明 cDNA2AFLP是分离差异表达基因的一种选
择 ,可以方便地将不同的组织、不同的生理发育阶段
或同一组织不同处理的差异表达的差异片段分离
出来。
2　cD NA2SRAP在植物上的应用
2001年 L i和 Quiros [ 11 ]提出的一种基于 PCR
的新型分子标记相关序列扩增多态性 ( sequence2re2
lated amp lified polymorphism , SRAP)技术 ,研究还表
明 SRAP也能应用于 cDNA差异表达分析。
cDNA2SRAP技术开发以来 ,目前已经在水稻、甘
蓝、甜瓜等植物上得到应用。L i等 [ 11 ]利用 SRAP技
术对花椰菜与花茎甘蓝的杂交双二倍体的 mRNA进
行反转录后进行扩增 ,用 48对引物组合标记 88个
cDNA样品 ,得到 281个多态性条带。卢泳全等 [ 12 ]应
用 SRAP技术对大米草的耐盐性状进行差异显示研
究 ,鉴定出一个与水稻的β21, 32葡聚糖酶基因有 30%
相似性的差异片段。马爱芬等选用培育 7年的重组
自交系群体 (R IL s) ,利用 cDNA2SRAP法进行了差异
显示研究 , 996对 SRAP引物组合扩增出 2 100条带 , 2
次扩增重复率为 65. 2% ,其中在黄黑籽材料之间重复
稳定出现的差异片段有 12条 ,发现 2个片段分别与
拟南芥的 NAD +ADP核糖转移酶及小肽转移蛋白 3
具有很高的同源性 [ 13 ]。Gui等 [ 14 ]检测自然甘蓝基因
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 11期
表达程度的改变。用 6个品种的 cDNA的样品 ,包括
3个异源四倍体和 3个同祖先的二倍体 ,进行 cDNA2
SRAP分析 ,结果共得到 1496条差异片段 ,经过筛选测
序发现 ,有 92条 (6. 1% )受到沉默 ,而 19条 (1. 9% )被
激活。目前 cDNA ∃ SRAP技术已经应用于不同物
种、品种之间及相同品种处理之间的差异表达研究 ,
说明 SRAP2cDNA方法亦适用于植物基因差异表达
分析。
3 DNA 2AFLP和 cDNA 2SRAP技术分析比较
3. 1　cDNA2AFLP和 cDNA2SRAP技术原理比较
cDNA2AFLP是用识别序列分别为 6 bp和 4bp
的两种限制性内切酶酶切双链 cDNA,通过连接上
Adap ter,使酶切后的片段与接头相连接 ,产生初级
扩增模板 ,再加入根据两接头序列和酶切位点序列
设计的引物的进行预扩增 ,产生大量可供选择性扩
增使用的次级扩增模板。研究表面外显子处于 GC
含量较高的区域 ,内含子和其它调控序列处于 AT
含量较高的区域 ,根据该基因组基因分布特点 , L i
和 Quiros ( 2003)开发出 SRAP标记方法 ,该标记方
法使用两条基于 GC含量高的外显子区域和 AT含
量高的内含子及调控区域的随机引物对基因组进行
扩增 ,从而产生基于序列变异和基于内含子长度变
化的显性和共显性标记 ,值得一提的是 , SRAP产生
的共显性标记的效率远大于其它标记技术 (例如
AFLP) ,而共显性标记有助于分子标记辅助育种。
另外一个显著特点是 Cdna2SRAP产生的差异片段
大多和性状有关 ,可以看成是潜在的功能基因。 cD2
NA2SRAP是一种无需任何序列信息即可进行差异
表达研究的新技术 ,该技术使用一条结合在外显子
区的固定引物和一条结合在内含子、调控区及间隔
区对模板 cDNA进行扩增 ,研究表明一般外显子处
于富含 GC的区域染色体中 ,这样用 CCGG序列就
有可能特异扩增出包含这些组分的序列。
3. 2　DNA2AFLP和 cDNA2SRAP操作方法比较
cDNA2AFLP步骤 :提取 RNA→合成双链 cDNA
→纯化 →酶切 →连接 →预扩增 →选择性扩增 →聚丙
烯酰胺变性胶检测 →变性胶上回收差异条带进行二
次 PCR扩增 →最后回收差异条带进行测序。
cDNA 2SRA P步 骤 : 提 取 RNA →合 成 单 链
cDNA→SRA P扩增 →聚丙烯酰胺变性胶检测 →
回收差异条带进行二次 PCR扩增 →最后回收差
异带进行测序。
cDNA 2A FLP从提取 RNA到回收测序整个过
程步骤繁多 ,费工费时、成本高、操作难、回收成功
率低、要求严格且不易出理想结果 ; cDNA2SRAP相
对于 cDNA 2A FLP步骤较少 ,操作相对简单 ,成本
较低、花费时间较少、要求相对简单也比较容易
出理想结果。
3. 3　DNA2AFLP和 cDNA2SRAP扩增结果比较
从扩增结果来看 ,运用 cDNA2AFLP和 cDNA2
SRAP技术分析甘蔗伸长初期赤霉素处理与对照之
间的基因差异表达 ,结果发现 cDNA2AFLP扩增的带
要比 cDNA2SRAP多 , cDNA2AFLP和 cDNA2SRAP扩
增的带大小范围基本一致均多数集中在 100～750
bp之间 ,回收成功率相差不大 ,差异带中假阳性相
差也不大 (数据未列出 )。从测序结果分析看 ,
cDNA2AFLP未知基因序列比较多 ,而 cDNA2SRAP
相对比较少 ; cDNA2SRAP的未知功能蛋白比较高 ,
而 cDNA2AFLP相对比较少 ;从回收差异带测序结果
来结果看 ,两种技术的差异带各有特点 ,也有相同部
分的差异带 (数据未列出 )。
3. 4　DNA2AFLP和 cDNA2SRAP在植物上的应用
比较
cDNA2AFLP技术研究得比较早 ,目前应用于植
物已经有大量报道 ;而 cDNA2SRAP技术研究相对
较晚 ,目前仅在水稻、甘蓝、甜瓜等少数植物上得到
研究应用。但随着研究领域的不断发展 ,可以根据
不同的研究方向和目的等方面选择适合自己需要的
方法或不同方法结合应用。
4　应用前景及展望
随着分子标记技术和的不断发展和完善 , cDNA2
AFLP和 cDNA2SRAP技术已逐渐成为基因表达研究
的重要工具 ,是构建转录图谱、定位目标性状位点、研
究基因差异表达等的主要手段 ,具有广阔的应用前
景。但是 cDNA2AFLP和 cDNA2SRAP技术均具有一
定的缺限 ,主要表现在获得的基因差异片段还不够全
面丰富。 cDNA2AFLP的试验程序比较繁琐 ,而 cD2
NA2SRAP相对比较简便。因此将 cDNA2AFLP与 cD2
NA2SRAP技术结合起来 ,可望得到更全面丰富的基
因差异片段。随着新的分子标记技术的不断出现 ,分
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2009年第 11期 　　吴建明等 : cDNA2AFLP和 cDNA2SRAP技术在植物基因差异表达上的应用及其分析比较
子标记技术间相互结合使用将会在植物不同生长发
育时期的基因差异表达、新基因发现、抗逆性分子机
理等研究领域发挥更大更好的作用。在大规模测序
计划下的今天 ,使得应用 cDNA2AFLP和 cDNA2SRAP
技术进行新转录本的大规模获得成为可能 ,结合 RT2
PCR及 RACE技术可以对得到的新候选基因转录本
进行时空表达研究和全长序列克隆 ,从而为后续的深
入研究奠定基础。
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