全 文 ： 生 物 工 程 学 报 Chin J Biotech 2008, November 25; 24(11): 1867-1873
journals.im.ac.cn Chinese Journal of Biotechnology ISSN 1000-3061
cjb@im.ac.cn © 2008 Institute of Microbiology, CAS & CSM, All rights reserved


Received: March 27, 2008; Accepted: July 3, 2008
Supported by: the National Science Foundation of Beijing (Nos. KZ20061002817, 5021001).
Corresponding author: Yikun He. Tel: +86-10-68902345; E-mail: yhe@mail.cnu.edu.cn
Rongcai Ma. E-mail: marongcai@baafs.net.cn
北京市自然科学基金(Nos. KZ20061002817, 5021001)资助。

研究报告
小立碗藓冷驯化相关基因 Pp-LIM only A的克隆与表达
孙铭明 1,2, 马荣才 3, 何奕昆 2
1 首都师范大学 初等教育学院, 北京 100080
2 首都师范大学 生命科学学院, 北京 100048
3 北京市农业生物技术研究中心, 北京 100089
摘 要: 植物经历冷驯化后抗冻能力会有所提高。利用 cDNA-AFLP 方法从经过 0oC 冷驯化处理的小立碗藓中筛选到差
异表达的 Pp-LIM only A 基因片段。cDNA 和基因序列比较分析表明此基因含有 7 个内含子和 8 个外显子, 编码由 345
个氨基酸残基组成的蛋白质, 其中只含有一个 LIM 结构域, 与动物蛋白质 PDZ/LIM 家族有很高的同源性, 推测是一种
新的植物 LIM 蛋白。实时定量 PCR 分析显示其在冷驯化 6 h 后表达量即开始明显增加, 并随着冷驯化时间的延长表达
量大幅度提高。Pp-LIM only A 蛋白可能通过 LIM 结构域对细胞骨架的作用而影响了细胞膜的稳定性, 本研究对其在抗
冻中的作用作了进一步讨论。
关键词 : 小立碗藓 , 冷驯化 , LIM only A 基因 , cDNA-AFLP, 实时定量 PCR
Isolation and Identification of a Pp-LIM only A Gene
Expressed During Cold Acclimation in Physcomitrella patens
Mingming Sun1,2, Rongcai Ma3, and Yikun He2
1 College of Elementary Education, Capital Normal University, Beijing 100080, China
2 College of Life Science, Capital Normal University, Beijing 100048, China
3 Beijing Agro-biotechnology Research Center, Beijing 100089, China
Abstract: Cold acclimation can improve freezing tolerance. Here cDNA amplified fragment length polymorphism (cDNA-AFLP)
was used to isolate differentially expressed cDNAs and a Pp-LIM only A cDNA was isolated and identified in the cold acclimation of
Physcomitrella patens. Real-time RT-PCR indicated it is obviously up-regulated at 6 h, 12 h, 24 h, 48 h and 72 h after cold
acclimation. After comparing the cDNA with the gene sequence, seven introns and eight exons were identified in the cDNA. The
cDNA putatively encodes a protein of 345 amino acid residues and only contains one LIM domain which has highly similarity with
the PDZ/LIM domains of the protein family in animals. We proposed that Pp-LIM only A be a new gene coding for the LIM-domain
containing protein and enhance stability of cell membrane via their effects on cytoskeleton during cold acclimation in P. patens.
Keywords: Physcomitrella patens (Hedw.), cold acclimation, LIM only A gene, cDNA-AFLP, real-time RT-PCR
DOI:10.13345/j.cjb.2008.11.009
1868 ISSN1000-3061 CN11-1998/Q Chin J Biotech November 25, 2008 Vol.24 No.11

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温度是植物生长发育所必需的环境条件, 影响
着所有生命过程。低温会使植物受到不同程度的伤
害以至死亡, 也是限制作物产量和植物分布的主要
因素之一。因此, 探索植物的抗冻机制和遗传背景,
不仅在基础研究中有重要意义, 在解决生产实际问
题中也具有广泛的应用价值。研究表明植物在较低
但不冻结的温度下生长一段时间会增强抗冻性, 这
种现象称为冷驯化(Cold acclimation)[1,2]。植物经冷
驯化锻炼后, 能诱导产生植物的最大抗冻力。例如,
未经历冷驯化的黑麦 , 在−5oC 时被冻死 , 而在
1oC~5oC条件下放置几天后, 可以在−30oC的温度下
存活[3,4]。人们还没有很好的了解形成冷驯化机制的
细节。现在已知的在冷驯化形成中发生的几个过程
是: 膜的稳定; 糖、其他渗透剂和抗冻蛋白的积累和
基因表达的多种变化[1,2]。目前已经在高等植物中克
隆到很多低温诱导基因, 根据现有研究结果, 可将
植物低温诱导蛋白按其性质、结构与功能不同而分
为以下几种类型: 增强细胞抗冰冻脱水能力、冰冻
时对酶起保护作用、具有代谢调节功能、对 RNA或
细胞膜具有稳定作用、参与细胞内信号转导以及低
温诱导的热激蛋白等几种类型[1]。
最近发现, 植物冷驯化和渗透胁迫机制都与细
胞骨架的重排有关, 尤其是细胞骨架的解聚、聚合
及其排列的动态变化表现得复杂多变[5−7]。LIM蛋白
是调节细胞骨架组织的重要蛋白质之一, 含有 LIM
结构域的蛋白质称为 LIM 蛋白。最早分离鉴定的
LIM结构域蛋白质包括线虫 lin11和 mec3基因及大
鼠 isl1 基因编码的 DNA 结合蛋白, 在 lin11、mec3
和 isl1 基因的编码产物中除含有同源框结构域外还
含有一个富含半胱氨酸的基元序列, 将这个富含半
胱氨酸的基元序列取这 3 个基因的首字母命名为
LIM 结构域[8−10]。LIM 结构域广泛存在于真核生物
中, 在不同种系不同组织中高度保守, 由 2 个串联
的富含半胱氨酸的锌指基元组成, LIM 结构域的共
同序列为[C-X2-C-X16-23-H-X2-C]-X2-[C-X2-C-X16-21
-C-X2-3-(C/H/D)], 其中 8个保守的氨基酸残基形成 2
个连续的锌指结构 , 可作为蛋白相互作用的适配
器。哺乳动物中 LIM 蛋白的研究较为深入, 目前已
经发现的 60 多种根据结构域的特征被分为 4 大类,
主要分布在细胞核中或细胞质内, 有些 LIM 蛋白可
以在细胞核和细胞质中穿梭移动。核 LIM蛋白主要
是通过与其他转录因子和辅因子的相互作用而发挥
组织特异的基因调节和细胞命运决定的功能, 胞质
中的 LIM 蛋白则通过与细胞骨架和细胞-细胞外基
质蛋白连接体的作用参与细胞骨架的组织和信号传
导[11]。迄今为止, 已经在多种植物中分离到 LIM 蛋
白, 如向日葵、烟草、拟南芥、水稻、黑杨、百合
等, 且均属于动物 LIMs 蛋白家族第 2 类中的 CRPs
亚家族 , 细胞核和细胞质中都有分布 [11−17]。CRPs
(Cysteine-rich proteins)是一类小 LIM蛋白, 约由 200
个氨基酸组成, 其中有 2 个 LIM 结构域形成锌指结
构, 中间被 40~50 个残基分隔开。植物 LIM 蛋白的
功能与动物中类似, 在细胞核中以转录因子方式调
节组织特异性的基因表达, 而在细胞质中则作为肌
动蛋白的结合蛋白存在, 调节细胞骨架的组织[11]。
本身就具有高度抗冻性的植物物种在冷驯化研
究中备受关注。藓类植物是地球上现存植物群中最
古老的陆生植物之一 , 从热带到南极均有分布 [18],
能够在干旱、冷冻等极端环境中生存。因此藓类必
然进化了一套与逆境相适应的机制, 但是目前对藓
类植物冷驯化适应性分子机制的研究还很少。小立
碗藓是第一个成功表达外源基因的苔藓植物, 也是
迄今为止发现的同源重组发生频率最高的植物 [19],
是开展基因功能研究的优异材料[20], 最近其全基因
组测序工作也已完成[21], 这些都为研究藓类冷驯化
适应性分子机理奠定了基础。本研究在采用 cDNA-
AFLP 方法研究小立碗藓冷驯化机制的过程中, 发
现一个差异表达的片段, 并通过 RT-PCR 方法分离
到 Pp-LIM only A基因, 对其编码的蛋白质结构的研
究推测可能是一种 LIM 结构域蛋白, 经实时定量
PCR 分析显示随着冷驯化时间延长其表达量发生极
大变化, 对 Pp-LIM only A基因在抗冻机制中的作用
进行了深入分析。此基因的鉴定既补充了植物的抗
冻机制, 也为农作物抗冻性的遗传改良提供了新的
基因选择。
1 材料与方法
1.1 小立碗藓的培养
小立碗藓(P. patens)材料由德国 University of
Freiburg 的 Ralf Raski 教授提供, 培养参照 Ashton
等的方法[22]。小立碗藓茎叶体生长在无菌的固体培
养基上, 培养基中含有 250 mg/L KH2PO4, 800 mg/L
孙铭明等: 小立碗藓冷驯化相关基因 Pp-LIM only A的克隆与表达 1869

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Ca(NO3)2·4H2O, 12.5 mg/L FeSO4·7H2O, 250 mg/L
MgSO4·7H2O, 其中补充有微量元素 0.055 mg/L
CuSO4·5H2O, 0.055 mg/L ZnSO4·7H2O, 0.614 mg/L
H3BO3, 0.389 mg/L MnCl2·4H2O, 0.055 mg/L CoCl2·6H2O,
0.028 mg/L KI, 0.025 mg/L Na2MoO4·2H2O, 配以
0.7 g/L琼脂粉, pH 7.0。培养温度约 25oC ± 1oC, 光
周期为 16 h/8 h光照/黑暗, 光密度为 55 µmol/(m2·s1)。
1.2 冷驯化处理
将生长 2 周的小立碗藓茎叶体转移到低温培养
箱中, 置于冰水混合物中(0oC), 胁迫处理 0 h、3 h、6 h、
12 h、24 h、48 h、72 h时分别取样。0 h作为非胁
迫处理对照。
1.3 RNA 的提取、mRNA 的纯化和 cDNA 的合成
小立碗藓茎叶体的 RNA提取采用酚抽提法[23]。
mRNA 分离纯化按照 Promega 公司试剂盒 PolyA
Tract® mRNA Isolation System 介绍的方法进行。
cDNA合成按照 TaKaRa公司试剂盒 cDNA Synthesis
Kit(M-MLV Version)介绍的方法进行。
1.4 cDNA-AFLP 分析
cDNA-AFLP 分析中的 cDNAs 分别取自未经
冷驯化和经历冷驯化的小立碗藓茎叶体(0 h、3 h、6 h、
12 h、24 h、48 h和 72 h), 限制性内切酶的酶切组合
采用 EcoRI/MseI[24]。预扩增 PCR反应为 94oC 30 s,
56oC 30 s, 72oC 1 min, 15个循环。预扩增引物序列
为: E0, 5′-GACTGCGTACCAATTC-3′和 M0, 5′-GAT
GAGTCCTGAGTAA-3′。选择性扩增 PCR反应采用
“touch down”策略, 94oC 30 s, 65oC 30 s(每个循环降
低 0.7oC), 72oC 1 min, 15个循环; 94oC 30 s; 56oC 30 s;
72oC 1 min, 20个循环。选择性扩增引物序列为: E1,
5′-GACTGCGTACCAATTCAA-3′; E2, 5′-GACTGC
GTACCAATTCAC-3′; E3, 5′-GACTGCGTACCAATT
CAG-3′; E4, 5′-GACTGCGTACCAATTCAT-3′; E5, 5′-
GACTGCGTACCAATTCTA-3′; E6, 5′-GACTGCGTA
CCAATTCTC-3′; E7, 5′-GACTGCGTACCAATTCTG
-3′; E8, 5′-GACTGCGTACCAATTCTT-3′; M1, 5′-GAT
GAGTCCTGAGTAACAA-3′; M2, 5′-GATGAGTCCT
GAGTAACAC-3′; M3, 5′-GATGAGTCCTGAGTAAC
AG-3′; M4, 5′-GATGAGTCCTGAGTAACAT-3′; M5,
5′-GATGAGTCCTGAGTAACTA-3′; M6, 5′-GATGA
GTCCTGAGTAACTC-3′; M7, 5′-GATGAGTCCTGA
GTAACTG-3′; M8, 5′-GATGAGTCCTGAGTAACTT
-3′。电泳后通过硝酸银染色显示差异表达片段。
从硝酸银染色胶上选择差异表达片段切下后溶
于 20 µL无菌水中, 取 5 µL溶液再扩增后, 采用琼
脂糖凝胶 DNA回收试剂盒(TIANGEN, DP209-02)进
行纯化。纯化后的差异片段与 pGEM-T easy (Promega)
载体连接, 转化 E. coli DH5α, 然后从阳性克隆中提
取质粒 DNA, 以载体两端的 T7 或 SP6 引物进行序
列测定。测序仪为 ABI 3100 (Applied Biosystems)。
1.5 Pp-LIM only A 基因 cDNA 分离和序列分析
上述分离鉴定的DNA片段序列与 P. patens EST
数据库 (http://moss.nibb.ac.jp/blast/blast.html)和 P.
patens 基因组文库 (http://genome.jgi-psf.org/Phypa1
_1/Phypa1_1.home.html)进行 Blast 比对后, 设计上
下游引物以经过冷驯化处理的小立碗藓茎叶体的
RNA 为模板通过 RT-PCR 反应得到 Pp-LIM only A
基因 cDNA。引物序列为: HF, 5′-GGCCGACCGGGT
AGTTCCTC-3′和 HR, 5′-TGATGACCAATGACACC
CCAGTTC-3′。PCR反应为 94oC 45 s, 65oC 45 s, 72oC
2 min, 30个循环, 72oC延伸 10 min。所扩增的 cDNA
按照 1.4中的方法进行克隆和序列分析。
1.6 荧光实时定量 RT-PCR 分析
利用 TaKaRa 公司的 SYBR Premix Ex Taq
(Perfect Real Time) 试剂盒进行荧光实时定量
RT-PCR反应。引物序列为: 5′-GAGTACCGTTCACA
CCCTTTCT-3′和 5′-GCCTCCCGCTCCACCAG-3′。
使用的 PCR仪为 Corbet Research公司的 Rotor Gene
3000 Real-Time Thermal Cycler。实验结果利用软件
Rotor-Gene 6.0[25]以及 Excel 7.0进行数据分析处理。
采用 Pp-actin3 作对照, 引物序列为: 5′-CGGAATG
GTGAAGGTATGAT-3′ 和 5′-CACGATGTGAAGAA
GACGAT-3′。
标准曲线的生成: 将预试验的 PCR产物按照 10倍
浓度梯度进行稀释, 选择 1/1000、1/10 000、1/100 000、
1/1 000 000浓度的稀释产物作为标准品模版, 进行
荧光定量 PCR反应。通过这 4个标准品生成的反应
数据, 软件 Rotor-Gene 6.0 根据反应的荧光实时监
控数据和标准品的浓度关系, 生成标准曲线。
相对表达量的计算: 目的基因的相对表达量根
据 Pfaffl[26], 用下列公式计算:
相对表达量=(1+Etarget) ∆Cttarget/(1+Eref) ∆Ctref
其中, Etarget 表示目的基因转录本的 PCR 效率;
Eref表示内源参照基因转录本的 PCR 效率。∆Cttarget
是目的基因转录本的Ct值减去目的基因对照转录本
的Ct, ∆Ctref是内源参照基因转录本的Ct值减去内源
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参照基因对照转录本的 Ct值。
1.7 核酸序列结构分析
采用 DNAstar 软件(http://www.dnastar.com/)的
EditSeq和MegAlign程序分析 Pp-LIM only A基因编
码的蛋白质序列以及外显子和内含子的结构比例 ,
采用 pfam 软件分析蛋白质结构域特征 (http://
pfam.janelia.org/)。
2 结果
2.1 差异表达基因 Pp-LIM only A 的克隆和序列
分析
利用 0oC下冷驯化 0 h、3 h、6 h、12 h、24 h、
48 h、72 h的小立碗藓茎叶体进行 cDNA-AFLP分析,
结果发现 1个大小约 260 bp左右的差异表达条带(图
1)。对此条带进行测序研究发现其与 LIM 结构域含
有蛋白质相似性很高。从图 1 中可以看出, 这一条
带代表的基因在冷驯化 6 h 后表达量即明显上升,
一直持续到 72 h后。
根据已公布的小立碗藓全基因组信息[21], 分别
设计上下游引物通过 RT-PCR扩增到 Pp-LIM only A
基因的 cDNA。将此 cDNA连接到 pGEM-T easy载
体上, 测序分析得到 1238 bp的全长 cDNA序列(图
3)。将此序列与其基因组序列比较, 结果表明此基因
含有 7 个内含子和 8个外显子(图 2); DNAstar 软件
分析其编码 345 个氨基酸的蛋白质序列; 通过 pfam
进行蛋白质结构特征分析显示其 N端序列含有 1个
LIM结构域(图 3)。
利用小立碗藓全基因组文库和 BLAST 进行同
源搜索发现在小立碗藓中 Pp-LIM only A是 1个含有
8 个同源基因的基因家族。本研究中分离的 Pp-LIM
only A基因在GenBank 的登录号是 1195116, 其他 7
个分别为 1112685、1134951、1152562、143146、
1147716、1122122 和 1153635。这些基因编码的蛋
白质序列与本研究中分离的 Pp-LIM only A 基因编
码的蛋白质序列相似性分别为 83%、82%、80%、
78%、73%、72%和 70%, 所有这些蛋白质序列中均
只含有 1个 LIM结构域(图 4)。
2.2 Pp-LIM only A 在冷驯化过程中的表达变化
进一步用实时定量 PCR 方法研究了 Pp-LIM
only A 基因在冷驯化过程中的表达变化。由图 5 可
见 Pp-LIM only A基因的表达明显受冷驯化影响。相
对于未驯化材料, 小立碗藓在冷驯化 12 h时 Pp-LIM
only A基因的相对表达量即达到 21.54倍, 此后一直
维持在很高的水平, 最高表达时间是在冷驯化 72 h,
最高相对表达量为 53.72倍。
实时定量 PCR 中常用平方回归系数(R2)和 PCR
扩增的效率(E)来分析实验结果的严谨性和可比性。
本实验中内源参照基因 Pp-actin3的 R2是 0.99776, E
为 105%; Pp-LIM only A基因的 R2是 0.99831, E为
111%, 说明实时定量 PCR的结果是稳定和可靠的。

图 1 cDNA-AFLP 分析图谱
Fig. 1 cDNA-AFLP profile
The primers used for mean amplification were E2 and M6, arrow
indicates the different expressed fragment ofPp-LIM only A

图 2 Pp-LIM only A 基因的内含子和外显子结构图示
Fig. 2 Intron and exon structures of Pp-LIM only A gene
E: exon; I: intron. Numbers at right bottom indicates the amount of exon and intron; Numbers in figure indicate
the nucleotide positions of exon
孙铭明等: 小立碗藓冷驯化相关基因 Pp-LIM only A的克隆与表达 1871

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图 3 Pp-LIM only A 基因的全长 cDNA 序列和推测的氨基酸序列
Fig. 3 cDNA and amino acid sequence of Pp-LIM only A gene
Arrow indicates the position of LIM domain, the sequences in frame are primers of real-time RT-PCR

3 讨论
本研究采用 cDNA-AFLP 方法结合 RT-PCR 分
析从经过冷驯化的小立碗藓中获得一个差异表达的
Pp-LIM only A cDNA, 实时定量 PCR分析证实其在
冷驯化过程中的表达情况显著受冷驯化时间影响 ,
而且随着冷驯化时间的增加表达量大幅度提高(图
5)。Pp-LIM only A中含有 1个 LIM结构域(图 3)。
有趣的是, 目前植物中已有的研究显示 LIM 蛋白均
含有 2个 LIM结构域, 而小立碗藓中的 Pp-LIM only
A 及其基因家族中其他编码成员的蛋白质都只含有
1 个 LIM 结 构 域 , 为 [C-X2-C-X16-23-H-X2-C]-
X2-[C-X2-C-X16-21-C-X5-H]], 此外, 与 LIM结构域的
共同序列相比, Pp-LIM only A的最后 3位其他氨基
酸变成了 5位。这种微小的差异也许是苔藓植物所特
有的, 因为我们发现小立碗藓中的 8 个 LIM only 转
录本具有同样的特征(图 4)。Pp-LIM only A的 LIM结
构域与已知的植物 LIM 结构域相似性较低, 而与动
物中发现的 PDZ-LIM 结构域类似[27]。推测 Pp-LIM
only A可能是一种新的植物 LIM结构域蛋白。
动物中 LIM 蛋白的研究比较早而全面, 研究发
现 LIM 蛋白通过与其他蛋白质的相互作用, 在调节
基因的转录、细胞命运决定、生长发育、细胞骨架
的组织等许多生物过程中发挥重要作用[28]。高等植
物中的 LIM蛋白也是蛋白质和蛋白质相互作用的界
面, 是许多发育相关途径的关键调节因子[13]。动物
胞质 LIM 蛋白广泛分布于细胞骨架相关的区域, 可
以直接调节肌动蛋白的聚合反应和解聚反应; 还可
以通过细胞和细胞外基质的黏附把细胞外基质和细
胞内的骨架成分连接起来, 在细胞内外双方向传递
细胞信号, 调节细胞的运动和细胞形态变化[29]。植
物中 LIM 蛋白的功能似乎也与细胞骨架的变化有
关。LILIM1是一种肌动蛋白结合蛋白质, 能够促进
F-肌动蛋白束的装配, 保护 F-肌动蛋白免受解聚复
合物的影响, 过量表达 LILIM1 蛋白会引发不正常
的星型 F-肌动蛋白的聚集和异常的内膜结构的变化。
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图 4 小立碗藓 Pp-LIM only A 与该家族中其他 7 个同源蛋白质的相似性比较
Fig. 4 Similarity analysis of the Pp-LIM only A protein sequence and seven other proteins of the same protein family in
P. patens
*indicates that all eight proteins have the same amino acid;: indicates that there is only one different amino acid residue in the eight proteins;
. indicates that there are two different amino acid residues


图 5 Pp-LIM only A 基因的表达与冷驯化时间的关系
Fig. 5 Relative expression profile of the Pp-LIM only A
gene during cold acclimation
研究认为 LILIM1蛋白介导了超稳定 F-肌动蛋白束的
形成, 进而干扰了由内膜的运动变化而引起的生长
停滞现象[12]。HaWLIM1的功能与周质微管和肌动蛋
白细胞骨架有关[14]。NtWLIM1 参与调节肌动蛋白细
胞骨架的稳定性[30]。研究发现, 植物 LIM 蛋白也参
与信号传导, 并且影响细胞内外的离子浓度[12]。
植物的细胞骨架在细胞的多项生理活动中发挥
着重要的作用。其中包括对低温胁迫的应答反应。
近年有文献报道, 细胞骨架受冷驯化影响发生动态
组装变化[5−7]。据此, 我们推测小立碗藓的 Pp-LIM
only A蛋白在冷驯化过程中通过 LIM结构域引起细
孙铭明等: 小立碗藓冷驯化相关基因 Pp-LIM only A的克隆与表达 1873

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胞骨架的组织发生改变 , 从而稳定了细胞膜结构 ,
使其功能得以保持, 如细胞膜的运输功能、细胞形
态特征的维持、细胞膜和细胞壁之间的正常通讯等
等。这些特征均有利于植物适应逆境胁迫。Pp-LIM
only A基因的功能有待于进一步研究。
植物对低温的耐受性是一种综合而复杂的应答
反应,研究小立碗藓冷驯化过程中基因表达的变化,
即可以从分子水平认识抗冻性形成的机制, 又为抗
逆性转基因植物育种提供了重要的基因。
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