全 文 ：西北农业学报　２０１３，２２（８）：６５－７１
Ａｃｔａ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｅ　Ｂｏｒｅａｌｉ－ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ　Ｓｉｎｉｃａ　 ｄｏｉ：１０．７６０６／ｊ．ｉｓｓｎ．１００４－１３８９．２０１３．０８．０１２
异子蓬异型种子萌发基因差显的ｃＤＮＡ－ＡＦＬＰ技术体系优化
收稿日期：２０１２－１１－１３　　修回日期：２０１３－０４－０７
基金项目：国家自然科学基金（３１０６００２７，３１２６００３７）；新疆生物资源基因工程重点实验室开放基金（ＸＪＤＸ０２０１－２０１１－０３）。
第一作者：邢佳佳，女，硕士研究生，研究方向为植物抗逆分子生物学。Ｅ－ｍａｉｌ：ｘｉｎｇｊｉａｊｉａｘｌ＠ｓｉｎａ．ｃｎ
通信作者：兰海燕，女，教授，博士，从事植物抗逆分子生物学研究。Ｅｍａｉｌ：ｌａｎｈａｉｙａｎ＠ｘｊｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
邢佳佳，陈莎莎，吕秀云，兰海燕
（新疆大学 生命科学与技术学院，新疆生物资源与基因工程重点实验室，乌鲁木齐　８３００４６）
摘　要　以异子蓬种子为材料，建立并优化其萌发过程中基因表达差显的ｃＤＮＡ－ＡＦＬＰ技术体系。分别以总
ＲＮＡ和ｍＲＮＡ反转录的双链ｃＤＮＡ为模板，对２５μＬ　ＰＣＲ扩增体系中的退火温度、引物量、ＤＮＡ聚合酶种
类及电泳条件进行优化。结果显示，以分离的ｍＲＮＡ为模板可以反转录得到品质较好的双链ｃＤＮＡ；ＰＣＲ扩
增选择较高退火温度（第１轮为５６℃，第２轮为６５～５６℃）、引物量为１μＬ（１０μｍｏｌ／Ｌ）、使用高效Ｐｒｅｍｉｘ
ＬＡ　Ｔａｑ　Ｈｏｔ　Ｓｔａｒｔ　ＤＮＡ聚合酶、在约８００Ｖ电压下进行６０ｇ／Ｌ变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，可得到条带清晰、
多态性好的ｃＤＮＡ－ＡＦＬＰ结果。
关键词　异子蓬；异型种子；萌发；ｃＤＮＡ－ＡＦＬＰ技术；体系优化
中图分类号　Ｑ７８１　　　文献标志码　Ａ　　　　　文章编号　１００４－１３８９（２０１３）０８－００６５－０７
Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ　ｏｆ　ｃＤＮＡ－ＡＦＬＰ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｓｙｓｔｅｍ　ｉｎ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ
Ｄｉｓｐｌａｙ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｓｕａｅｄａ　ａｒａｌｏｃａｓｐｉｃａ
ｄｕｒｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｐｒｏｃｅｓｓ　ｏｆ　Ｓｅｅｄ　Ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ
ＸＩＮＧ　Ｊｉａｊｉａ，ＣＨＥＮ　Ｓｈａｓｈａ，ＬＸｉｕｙｕｎ　ａｎｄ　ＬＡＮ　Ｈａｉｙａｎ
（Ｘｉｎｊｉａｎｇ　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ
Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｘｉｎｊｉａｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｕｒｕｍｑｉ　８３００４６，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ　Ｔｈｅ　ｃＤＮＡ－ＡＦＬＰ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｓｙｓｔｅｍ　ｉｎ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　ｄｉｓｐｌａｙ　ｏｆ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｓｕａｅｄａ　ａｒａｌｏ－
ｃａｓｐｉｃａ　ｄｕｒｉｎｇ　ｔｈｅ　ｐｒｏｃｅｓｓ　ｏｆ　ｓｅｅｄ　ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｗａｓ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ　ａｆｔｅｒ　ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ　ｓｅｖｅｒａｌ　ｋｅｙ　ｆａｃｔｏｒｓ．Ｉｎ
ｔｈｅ　ｓｔｕｄｙ，ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡ　ｗａｓ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ　ｗｉｔｈ　ｍＲＮＡ　ｏｒ　ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ，ｔｈｅｎ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａ－
ｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｐｒｉｍｅｒ，ａｎｎｅａｌｉｎｇ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ａｎｄ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ　ｇｅｌ　ｅｌｅｃｔｒｏ－
ｐｈｏｒｅｓｉｓ　ｗｅｒｅ　ｓｔｕｄｉｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｔｈａｔ　ｍＲＮＡ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　ｗａｓ　ｂｅｔｔｅｒ　ｆｏｒ　ｓｙｎｔｈｅｓｉ－
ｚｉｎｇ　ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡ．Ｔｈｅ　ｄｉｓｔｉｎｃｔ　ｂａｎｄｓ　ｃｏｕｌｄ　ｂｅ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ｗｈｅｎ　ｔｈｅ　ｐｒｉｍｅｒ　ｗａｓ　ａｄｄｅｄ　ｔｏ　１μＬ
（１０μｍｏｌ／Ｌ），ｔｈｅ　ａｎｎｅａｌｉｎｇ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｓｈｏｕｌｄ　ｂｅ　ｈｉｇｈｅｒ（ｆｉｒｓｔ　ｒｕｎ　ｏｆ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：５６℃，ｓｅｃｏｎｄ
ｒｕｎ　ｏｆ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：６５－５６℃），Ｐｒｅｍｉｘ　ＬＡ　Ｔａｑ　Ｈｏｔ　Ｓｔａｒｔ　ｗａｓ　ｃｈｏｓｅｎ　ａｓ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｉｎ　２５μＬ
ＰＣＲ　ｓｙｓｔｅｍ．Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ，６０ｇ／Ｌ　ｄｅｎａｔｕｒｅｄ　ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ　ｇｅｌ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ｗａｓ　ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ　ａｔ　ａ
ｖｏｌｔａｇｅ　ｏｆ　８００Ｖ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ　Ｓｕａｅｄａ　ａｒａｌｏｃａｓｐｉｃａ；Ｈｅｔｅｒｏｍｏｒｐｈｉｃ　ｓｅｅｄ；Ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ；ｃＤＮＡ－ＡＦＬＰ；Ｓｙｓｔｅｍ　ｏｐｔｉｍｉ－
ｚａｔｉｏｎ
　 　ｃＤＮＡ－ＡＦＬＰ（ｃＤＮＡ－Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　Ｆｒａｇｍｅｎｔ
Ｌｅｎｇｔｈ　Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）技术是 Ｂａｃｈｅｍ 等［１］于
１９９６年在 ＡＦＬＰ（Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　Ｆｒａｇｍｅｎｔ　Ｌｅｎｇｔｈ
Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）［２］技术的基础上结合ＲＴ－ＰＣＲ技
术发展而来的一种功能基因组研究方法。该技术
的原理和方法是以 ｍＲＮＡ 反转录合成的双链
ｃＤＮＡ为模板，利用分别识别４个碱基和６个碱
基序列的２种限制性内切酶进行消化，酶切后和
可以与酶切位点结合的一段接头连接，根据接头
设计引物进行预扩增和选择性扩增，选择性扩增
产物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳检测［３］。该技术有
重复性好、假阳性低、结果稳定可靠、可全面获取
转录组的信息等优点，而且不需要预先知道序列
信息［４］，目前，已广泛用于分离目的基因、生物基
因表达特性和表达基因的遗传连锁作图的研
究［５］。但是对于不同的研究材料，以及不同的试
验条件，ｃＤＮＡ－ＡＦＬＰ各种技术参数还需要改进
和优化才能获得最佳的试验结果。
异子蓬（Ｓｕａｅｄａ　ａｒａｌｏｃａｓｐｉｃａ）是藜科异子蓬
属１ａ生草本植物，分布于中亚地区，在中国仅分
布于准噶尔盆地南缘，生长于强盐碱化的荒漠戈
壁和丘间低地，具有很强的抗干旱、盐碱和耐贫瘠
能力［６－７］。异子蓬还具有单细胞Ｃ４ 光合途径［８］，
能产生形态及萌发特性不同的异型性种子［９］等特
点，是研究抗逆性的优良材料。目前，对异子蓬的
研究主要集中在异型性种子萌发特性方面，而对
其异型性种子萌发差异的分子机制的研究鲜见报
道。由于异子蓬的遗传背景不清楚，因此，利用
ｃＤＮＡ－ＡＦＬＰ技术对其进行基因差显的研究是很
好的选择。本研究拟以异子蓬异型种子为材料，
建立并优化ｃＤＮＡ－ＡＦＬＰ技术体系，为研究异子
蓬异型性种子萌发过程基因表达的差异奠定
基础。
１　材料与方法
１．１　种子采集及萌发条件
异子蓬种子于２０１０年９月采集于新疆五家
渠１０３团治沙站。于室内阴干后室温干燥、保存。
萌发种子总ＲＮＡ提取：将４０粒异子蓬种子置于
直径９ｃｍ垫有２层滤纸的培养皿中，加入５ｍＬ
蒸馏水，在恒温光照培养箱（２５℃，光照１６ｈ／黑
暗８ｈ，湿度６５％）中培养。
１．２　总ＲＮＡ提取
取３０粒萌发０ｈ的异子蓬种子，采用天根生
化科技（北京）有限公司的ＲＮＡｐｒｅｐ　ｐｕｒｅ植物总
ＲＮＡ提取试剂盒、Ｔｒｉｚｏｌ试剂（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司）
和百泰克（北京）通用植物总 ＲＮＡ 提取试剂盒
（离心柱型 ）３种方法，操作步骤按说明书进行。
用Ｎａｎｏｄｒｏｐ　ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（ＮＤ－１０００，美国）
对总ＲＮＡ定量，取１μｇ总ＲＮＡ，１０ｇ／Ｌ琼脂糖
凝胶电泳检测总ＲＮＡ的完整性。
１．３　双链ｃＤＮＡ的合成
双链ｃＤＮＡ 的合成分别以总 ＲＮＡ 和 ｍＲ－
ＮＡ为模板进行。ｍＲＮＡ 的分离采用ＰｏｌｙＡＴ－
ｔｒａｃｔ○Ｒ　ｍＲＮＡ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ （Ｐｒｏｍｅｇａ，美
国）试剂盒，按说明书操作。分别取２μｇ　ｍＲＮＡ
和８μｇ总 ＲＮＡ用 Ｍ－ＭＬＶ　ＲＴａｓｅ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎ－
ｔｈｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ，大连）合成双链ｃＤＮＡ，
１０ｇ／Ｌ琼脂糖凝胶检测双链ｃＤＮＡ的品质。
１．４　双链ｃＤＮＡ的酶切与接头连接
酶切反应体系：双链ｃＤＮＡ　５００ｎｇ，ＥｃｏＲⅠ
（ＮＥＢ，美国）１μＬ，ＭｓｅⅠ（ＮＥＢ，美国）１μＬ，
１００×ＢＳＡ　０．２μＬ，１０×ＮＥＢ缓冲液２μＬ，灭菌
双蒸水补足至２０μＬ，温和并充分混匀后置于
３７℃温箱中反应５ｈ。随后于６５℃水浴１０ｍｉｎ，
加入２倍体积无水乙醇和０．１倍体积醋酸钠
（３ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ　５．３），充分混匀后于－２０℃放置
５ｈ以上，４℃、１５　０００ｒ／ｍｉｎ离心３０ｍｉｎ，用φ＝
７５％的乙醇溶液充分洗涤２次，室温放置１０ｍｉｎ
以上充分晾干，溶于２０μＬ灭菌双蒸水中。取
ＥｃｏＲⅠ 接 头 （１０ μｍｏｌ／Ｌ）和 ＭｓｅⅠ 接 头
（１０μｍｏｌ／Ｌ）各１０μＬ混匀，６５℃孵育１０ｍｉｎ后
于室温冷却。连接体系：Ｔ４ＤＮＡ　Ｌｉｇａｓｅ（ＮＥＢ，
美国）１μＬ，已退火的接头４μＬ，１０×缓冲液
２μＬ，酶切产物１３μＬ，混匀后１６℃连接过夜，随
之６５℃水浴１０ｍｉｎ以终止反应。
１．５　预扩增和选择性扩增
为检测模板、引物量及Ｔａｑ酶对扩增效果的
影响，选取不同量的连接产物为模板，加入不同量
的引物，分别用 ＴａＫａＲａ　ＴａｑＴＭ 和 Ｐｒｅｍｉｘ　ＬＡ
Ｔａｑ○Ｒ　Ｈｏｔ　Ｓｔａｒｔ　Ｖｅｒｓｉｏｎ （ＴＡＫＡＲＡ，大连）
２种ＤＮＡ聚合酶在不同退火温度下优化预扩增
和选择性扩增反应体系。预扩增总体积２５μＬ：
ＴａＫａＲａ　Ｔａｑ（５Ｕ／μＬ）０．２５μＬ，１０×ＰＣＲ缓冲
液（含 Ｍｇ２＋）２．５μＬ，ｄＮＴＰ 混合液 （各 ２．５
ｍｍｏｌ／Ｌ）２μＬ，ＥｃｏＲⅠ和 ＭｓｅⅠ 预扩增引物
（１０μｍｏｌ／Ｌ）分别加入０．５μＬ、０．８μＬ、１．０μＬ，
加入模板（连接产物原液１μＬ、２μＬ，稀释２０倍
３μＬ）后用灭菌双蒸水补足。ＰＣＲ程序：９４℃ 预
变性５ｍｉｎ，９４℃ 变性３０ｓ，５６ ℃ 退火３０ｓ，
７２℃ 延伸１ｍｉｎ，３０个循环后，７２℃延伸５ｍｉｎ，
４℃保存。预扩增产物稀释不同浓度用于选择性
扩增。选择性扩增体积 ２５μＬ：ＴａＫａＲａ　Ｔａｑ
０．２５μＬ，１０×ＰＣＲ缓冲液２．５μＬ，ｄＮＴＰ混合液
·６６· 西　北　农　业　学　报 ２２卷
２μＬ，ＥｃｏＲⅠ和ＭｓｅⅠ选择性扩增引物分别加入
０．５μＬ、０．８μＬ、１．０μＬ，加入模板（预扩增产物根
据亮度不同稀释３００、４００倍，取５μＬ）后用灭菌
双蒸水补足。降落 ＰＣＲ 程序：９４ ℃ 预变性
５ｍｉｎ，９４℃ 变性３０ｓ，６５℃ （或６０℃）退火
３０ｓ，７２℃延伸１ｍｉｎ，退火温度每个循环降低
０．７℃，１３个循环之后，退火温度降至５６℃ （或
５１℃）再运行２５个循环，最后７２℃延伸７ｍｉｎ。
用Ｐｒｅｍｉｘ　ＬＡＴａｑ○Ｒ　Ｈｏｔ　Ｓｔａｒｔ　Ｖｅｒｓｉｏｎ进行扩增
（预扩增和选择性扩增）。扩增体系：Ｐｒｅｍｉｘ　ＬＡ
Ｔａｑ　Ｈｏｔ　Ｓｔａｒｔ（预混的ＤＮＡ聚合酶）１２．５μＬ，
模板５μＬ，上下游引物（１０μｍｏｌ／Ｌ）各１．０μＬ，加
入灭菌双蒸水补足至２５μＬ，ＰＣＲ反应程序与使
用普通ＴａＫａＲａ　ＴａｑＴＭ反应程序相同。
１．６　聚丙烯酰胺凝胶电泳
玻璃板处理：先用１ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＯＨ 浸泡长、
短玻璃板过夜，除去残留的凝胶；用蒸馏水将长、
短玻璃板洗干净后自然晾干，用φ＝９５％乙醇擦
拭长、短玻璃板；用亲和硅烷（冰乙酸２０μＬ、亲和
硅烷２０μＬ、φ＝９５％乙醇４ｍＬ）和剥离硅烷分别
均匀擦拭长、短玻璃板；５～１０ｍｉｎ后用φ＝９５％
乙醇擦拭长、短玻璃板。以上操作过程均使用擦
镜纸进行。６ｇ／Ｌ聚丙烯酰胺凝胶制备：ｗ＝３０％
丙烯酰胺（称取丙烯酰胺２９ｇ，Ｎ，Ｎ′－亚甲基双丙
烯酰胺１ｇ，用超纯水定容至１００ｍＬ，于棕色瓶中
４℃ 保 存）１０ ｍＬ，１０× ＴＢＥ（Ｔｒｉｓ　１０８ ｇ，
Ｎａ２ＥＤＴＡ·２Ｈ２Ｏ　７．４４ｇ，硼酸５５ｇ，用去离子
水定容至１Ｌ，室温保存）５ｍＬ，尿素２１ｇ，超纯水
定容至５０ｍＬ，用０．４５ｍｍ滤纸过滤，加入２００
μＬ　１００ｇ／Ｌ（ＭＨ４）Ｓ２Ｏ８ 和８４μＬ　ＴＥＭＥＤ（四甲
基乙二胺），充分混匀。灌胶：将组装好的胶板倾
斜３０°，用注射器沿一侧缓慢注入槽中，倒插梳
子，水平静置使之聚合完全。样品处理：将０．５倍
体积的变性缓冲液（１０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＯＨ，０．５ｇ／Ｌ
二甲苯蓝，０．５ｇ／Ｌ溴酚蓝，用甲酰胺配置２０
ｍｍｏｌ／Ｌ的ＥＤＴＡ）加入样品中，９４℃水浴３ｍｉｎ
后立即冰浴。电泳［１０］：在上槽中加入０．５×ＴＢＥ
缓冲液，下槽中加入１份醋酸钠（３ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ
７．０）和２份１×ＴＢＥ缓冲液，在８００Ｖ电压下预电
泳３０ｍｉｎ，去除没有聚合的尿素，胶孔清洗干净
后插入梳子（梳齿插入胶面１ｍｍ左右），每孔上
样７μＬ，电泳３～４ｈ后染色。
１．７　染 色
银染的方法参照Ｃｒｅｓｔｅ等［１１］。固定：将带胶
的长玻璃板放进盘子，加入１Ｌ固定液（φ＝１０％
乙醇，φ＝１％冰乙酸），轻缓摇动１０ｍｉｎ。用１Ｌ
蒸馏 水 洗 胶 １ ｍｉｎ。氧 化：加 入 １ Ｌ 硝 酸
（φ＝１．５％），轻缓震荡３ｍｉｎ。用１Ｌ蒸馏水洗胶
１ｍｉｎ。染色：加入１Ｌ硝酸银溶液（φ＝０．２％），
轻缓震荡浸润２０ｍｉｎ。加入１Ｌ 蒸馏水漂洗
３０ｓ，共漂洗２次（该步骤要迅速）。显色：加入
２５０ｍＬ冷的（１２℃）显色溶液（３０ｇ／Ｌ　Ｎａ２ＣＯ３，
每升加入φ＝３７％甲醛０．５４ｍＬ），轻缓震荡直至
溶液变黑。再重新加入７５０ｍＬ新的显色液，继
续震荡４～７ｍｉｎ，直至条带显现，然后倒掉显色
液。终止显色：加入１Ｌ冰乙酸（φ＝５％），震荡
５ｍｉｎ终止显色。用蒸馏水漂洗，风干后照相或
扫描。
２　结果与分析
２．１　异子蓬干种子总ＲＮＡ提取和β－ａｃｔｉｎ内参
基因的扩增
图１－Ａ显示，用Ｔｒｉｚｏｌ法不能提取出褐色干
种子的总ＲＮＡ，而黑色干种子总ＲＮＡ蛋白质污
染较严重；用天根和百泰克试剂盒均能从褐色和
黑色干种子中提取出品质较好的总ＲＮＡ，加样孔
没有蛋白质残留，２８ＳｒＲＮＡ的亮度是１８ＳｒＲＮＡ
亮度的２倍，５ＳｒＲＮＡ条带淡。以用不同方法提
取的总ＲＮＡ反转录得到的单链ｃＤＮＡ为模板对
β－ａｃｔｉｎ内参基因进行ＰＣＲ扩增，结果见图１－Ｂ，
以百泰克试剂盒最终获得较好的扩增。可能的原
因是另外２种方法提取的总ＲＮＡ杂质较多，可
能抑制后续的 ＲＴ－ＰＣＲ反应（这从质量检测中
ＯＤ２６０和ＯＤ２８０的值可初步判断）。因此，后续试
验提取干种子中的总ＲＮＡ时应选用百泰克植物
总ＲＮＡ提取试剂盒。
２．２　双链ｃＤＮＡ的合成
分别 以 ｍＲＮＡ 和 总 ＲＮＡ 为 模 板，用
ＴＡＫＡＲＡ公司的 Ｍ－ＭＬＶ　ＲＴａｓｅ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎ－
ｔｈｅｓｉｓ试剂盒反转录合成双链ｃＤＮＡ。图２显
示，以 ｍＲＮＡ 为 模 板 获 得 的 双 链 ｃＤＮＡ 在
１０ｇ／Ｌ琼脂糖凝胶上于０．２～５．０ｋｂ均匀弥散，
表明反转录效果较好；但以总ＲＮＡ为模板得到
的双链ｃＤＮＡ 琼脂糖凝胶检测结果显示，虽在
０．２～５．０ｋｂ也呈弥散分布，但其主要集中在
０．２５～０．５ｋｂ，疑似ＲＮＡ已降解，无疑会对后续
试验产生影响。
·７６·８期 邢佳佳等：异子蓬异型种子萌发基因差显的ｃＤＮＡ－ＡＦＬＰ技术体系优化
　　Ａ：１，２．Ｔｒｉｚｏｌ法　Ｔｒｉｚｏｌ　ｍｅｔｈｏｄ；３，４．天根ＲＮＡｐｒｅｐ　ｐｕｒｅ植物总ＲＮＡ提取试剂盒法　ＲＮＡｐｒｅｐ　ｐｕｒｅ　ｐｌａｎｔ　ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ
ｋｉｔ　ｏｆ　Ｔｉａｎｇｅｎ　ｍｅｔｈｏｄ；５，６．百泰克植物总ＲＮＡ提取试剂盒法　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　Ｐｌａｎｔ　Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｋｉｔ　ｏｆ　Ｂｉｏｔｅｋｅ　ｍｅｔｈｏｄ；１，３，５．
褐色种子　Ｂｒｏｗｎ　ｓｅｅｄ；２，４，６．黑色种子　Ｂｌａｃｋ　ｓｅｅｄ
Ｂ：Ｍ．ＤＬ　２　０００ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ；－．阴性对照　Ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ；其他序号与此图Ａ中对应　Ｏｔｈｅｒ　ｎｕｍｂｅｒｓ　ａｒｅ　ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ｗｉｔｈ“Ａ”
图１　总ＲＮＡ电泳图谱（Ａ）和β－ａｃｔｉｎ内参基因的扩增（Ｂ）
Ｆｉｇ．１　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｏｇｒａｍ　ｏｆ　ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ（Ａ）ａｎｄ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆβ－ａｃｔｉｎ（Ｂ）
２．３　预扩增和选择性扩增
研究发现，在预扩增中模板量对扩增结果影
响不大（图３），因此设计不同的引物量、不同的酶
和退火温度来摸索第１轮扩增的条件。结果见图
４－Ａ，第１轮扩增在１ｋｂ以下呈现弥散，属正常扩
增；引物量为１μＬ（１０μｍｏｌ／Ｌ）时扩增条带较亮
且均匀弥散；较高的退火温度可增加弥散的范围；
Ｐｒｅｍｉｘ　ＬＡＴａｑ　Ｈｏｔ　Ｓｔａｒｔ　ＤＮＡ聚合酶比普通的
ＴａＫａＲａ　Ｔａｑ效率更高。
根据预扩增产物亮度将其分别稀释３００（９～
１２）、４００（１３～１６）倍，取５μＬ为模板进行第２轮
选择性扩增（图４－Ｂ）。琼脂糖凝胶电泳检测结果
显示，条带在７５０ｂｐ以下弥散，有主带，说明扩增
正确，可以进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测；第２轮
扩增时用高效Ｐｒｅｍｉｘ　ＬＡ　Ｔａｑ　Ｈｏｔ　Ｓｔａｒｔ　ＤＮＡ
聚合酶，在８００Ｖ左右电压下进行６０ｇ／Ｌ变性聚
丙烯酰胺凝胶电泳，可得到较好的ｃＤＮＡ－ＡＦＬＰ
结果。
２．４　聚丙烯酰胺凝胶电泳系统和银染方法的优化
聚丙烯酰胺凝胶电泳时，根据操作说明，最早
选择了１　５００Ｖ的高压，结果发现，电泳装置在高
压下受热不均匀，染色结果呈现明显的“笑脸”状，
不同退火温度之间扩增条带没有明显区别，但是
第１轮退火温度较低的模板再在第２轮扩增时条
带较淡；Ｐｒｅｍｉｘ　ＬＡＴａｑ　Ｈｏｔ　Ｓｔａｒｔ的扩增效果优
于ＴａＫａＲａ　Ｔａｑ（图５－Ａ）。经改进选择在８００Ｖ
电压下由外源风扇帮助散热，染色结果条带清晰
且较直（图５－Ｂ）。通过对模板量、引物量、退火温
度、ＤＮＡ聚合酶、电泳条件的摸索和优化，最终获
得条带清晰、多态性丰富、效果稳定、可用于ｃＤ－
ＮＡ－ＡＦＬＰ分析的结果（图５－Ｂ）。
　　Ｍ１．ＤＬ５　０００ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ；Ｍ２．ＤＬ２　０００ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ；
Ｍ３．ＤＬ１５　０００ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ；１．ｍＲＮＡ反转录得到的双链ｃＤＮＡ
　Ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡ　ｗａｓ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ　ｗｉｔｈ　ｍＲＮＡ；２．总ＲＮＡ
反转录得到的双链ｃＤＮＡ　Ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡ　ｗａｓ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ
ｗｉｔｈ　ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ
图２　双链ｃＤＮＡ的电泳图谱
Ｆｉｇ．２　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｏｇｒａｍ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｄｏｕｂｌｅ　ｓｔｒａｎｄｓ－ｃＤＮＡ
　　１－３．连接产物分别取１、３、５μＬ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ　１，３，５
μＬ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ；４－６．连接产物稀释１０倍取１、３、５μＬ　１０×
ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ　１，３，５μＬ
图３　连接产物稀释不同浓度预扩增结果
Ｆｉｇ．３　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｏｇｒａｍ　ｏｆ　Ｐｒｅ－ＰＣＲ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｆｒｏｍ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ
·８６· 西　北　农　业　学　报 ２２卷
　　Ａ：奇数编号退火温度为５２℃，偶数编号退火温度为５６℃　Ａｎｎｅａｌｉｎｇ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｏｆ　ｏｄｄ　ｎｕｍｂｅｒ　ｉｓ　５２℃，ａｎｎｅａｌｉｎｇ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ
ｏｆ　ｅｖｅｎ　ｎｕｍｂｅｒ　ｉｓ　５６℃；１－４．引物量为０．５μＬ　Ｔｈｅ　ｖｏｌｕｍｅ　ｏｆ　ｐｒｉｍｅｒ　ｉｓ　０．５μＬ；５－８．引物量为０．８μＬ　Ｔｈｅ　ｖｏｌｕｍｅ　ｏｆ　ｐｒｉｍｅｒ　ｉｓ　０．８μＬ；
９－１６．引物量为１μＬ　Ｔｈｅ　ｖｏｌｕｍｅ　ｏｆ　ｐｒｉｍｅｒ　ｉｓ　１μＬ；１、２、５、６、９、１０、１３、１４的模板ｃＤＮＡ来自总ＲＮＡ　Ｔｈｅ　ｔｅｍｐｌａｔｅ　ｃＤＮＡ　ｏｆ　１，２，５，
６，９，１０，１３，１４ｗａｓ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ；１－１２．ＤＮＡ聚合酶为ＴａＫａＲａ　Ｔａｑ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｉｓ　ＴａＫａＲａ　Ｔａｑ；１３－１６．ＤＮＡ聚
合酶为Ｐｒｅｍｉｘ　ＬＡ　Ｔａｑ　Ｈｏｔ　Ｓｔａｒｔ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｉｓ　Ｐｒｅｍｉｘ　ＬＡ　Ｔａｑ　Ｈｏｔ　Ｓｔａｒｔ；模板量均为连接产物稀释２０倍取５μＬ　Ｔｈｅ　ａｌ
ｔｅｍｐｌａｔｅｓ　ｗｅｒｅ　５μＬ　ｏｆ　２０×ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ
Ｂ：１－８．ＤＮＡ聚合酶为ＴａＫａＲａ　Ｔａｑ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｉｓ　ＴａＫａＲａ　Ｔａｑ；９－１６．ＤＮＡ聚合酶为Ｐｒｅｍｉｘ　ＬＡＴａｑ　Ｈｏｔ　Ｓｔａｒｔ　ＤＮＡ　ｐｏｌ－
ｙｍｅｒａｓｅ　ｉｓ　Ｐｒｅｍｉｘ　ＬＡ　Ｔａｑ　Ｈｏｔ　Ｓｔａｒｔ；奇数项的退火温度为６０～５１℃，偶数项的退火温度为６５～５６℃　Ａｎｎｅａｌｉｎｇ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｏｆ　ｏｄｄ
ｎｕｍｂｅｒ　ｉｓ　６０～５１℃，ａｎｎｅａｌｉｎｇ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｏｆ　ｅｖｅｎ　ｎｕｍｂｅｒ　ｉｓ　６５～５６℃；上排序号９－１６表示所选用的模板相应的为预扩增ＰＣＲ的９～
１６产物　Ｕｐｐｅｒ　ｒｏｗ　ｎｕｍｂｅｒ　９－１６ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ　ｔｈｅ　ｔｅｍｐｌａｔｅｓ　ｏｆ　ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ　ＰＣＲ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｗｅｒｅ　ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ｏｆ　Ｐｒｅ－ＰＣＲ
ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
图４　预扩增（Ａ）和选择性扩增（Ｂ）电泳图
Ｆｉｇ．４　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｏｇｒａｍ　ｏｆ　Ｐｒｅ－ＰＣＲ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ａ）ａｎｄ　ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ－ＰＣＲ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｂ）
　　Ａ：电泳电压为１　５００Ｖ　Ｔｈｅ　ｖｏｌｔａｇｅ　ｏｆ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ｗａｓ　１　５００Ｖ；双链ｃＤＮＡ反转录的模板为总ＲＮＡ　Ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡ
ｗａｓ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ；引物量为０．５μＬ　Ｔｈｅ　ａｍｏｕｎｔ　ｏｆ　ｐｒｉｍｅｒ　ｉｓ　０．５μＬ；预扩增退火温度为５６℃　Ｔｈｅ　ａｎｎｅａｌｉｎｇ　ｔｅｍｐｅｒａ－
ｔｕｒｅ　ｏｆ　ｐｒｅ－ＰＣＲ　ｉｓ　５６℃；选择性扩增退火温度为６５～５６℃　Ｔｈｅ　ａｎｎｅａｌｉｎｇ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｏｆ　ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ　ＰＣＲ　ｉｓ　６５－５６℃；ＤＮＡ聚合酶为
ＴａＫａＲａ　Ｔａｑ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｉｓ　ＴａＫａＲａ　Ｔａｑ
Ｂ：电压为８００Ｖ　Ｔｈｅ　ｖｏｌｔａｇｅ　ｏｆ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ｗａｓ　８００Ｖ，序号和图４－Ｂ相对应　Ｎｕｍｂｅｒｓ　ｗｅｒｅ　ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ｗｉｔｈ　ｆｉｇｕｒｅ　４－Ｂ
图５　聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染结果
Ｆｉｇ．５　Ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ　ｇｅｌ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ａｎｄ　ｓｉｌｖｅｒ　ｓｔａｉｎ
·９６·８期 邢佳佳等：异子蓬异型种子萌发基因差显的ｃＤＮＡ－ＡＦＬＰ技术体系优化
３　讨 论
本研究通过对模板量、引物量、退火温度、
ＤＮＡ聚合酶、电泳体系和染色条件的摸索，最终
建立了重复性好、结果稳定的异子蓬ｃＤＮＡ－
ＡＦＬＰ技术体系。优化条件：以分离的ｍＲＮＡ为
模板反转录得到品质较好的双链ｃＤＮＡ；ＰＣＲ扩
增选 择 较 高 退 火 温 度、引 物 量 为 １μＬ（１０
μｍｏｌ／Ｌ）、使用高效 Ｐｒｅｍｉｘ　ＬＡ　Ｔａｑ　Ｈｏｔ　Ｓｔａｒｔ
ＤＮＡ聚合酶、在８００Ｖ左右电压下进行６０ｇ／Ｌ
变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，可得到较好的ｃＤＮＡ－
ＡＦＬＰ结果。
ｍＲＮＡ差异显示、ｃＤＮＡ－ＡＦＬＰ和 ＤＮＡ文
库构建等技术均需要较高品质的 ＲＮＡ，其中以
ｃＤＮＡ－ＡＦＬＰ技术对ＲＮＡ的品质和数量要求最
高，因此高品质的 ＲＮＡ 是该技术的重要基
础［１２－１３］。同样，是否分离ｍＲＮＡ及反转录的双链
ｃＤＮＡ品质也决定能否获得多态性良好的差显条
带。本研究结果显示，用分离的ｍＲＮＡ为模板反
转录能得到品质较高的双链ｃＤＮＡ及后续多态
性较好的扩增结果。
Ｂａｃｈｅｍ 等［３］用不同酶切组合 （ＥｃｏＲⅠ、
ＢａｍＨⅠ和ＰｓｔⅠ与ＴａｑⅠ或ＭｓｅⅠ组合）对同一
植物材料进行ｃＤＮＡ－ＡＦＬＰ研究最终得到的
ＴＤＦ（ｓｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ　ｄｅｒｉｖｅｄ　ｆｒａｇｍｅｎｔｓ）虽包含的信
息不同，但数量接近。说明，不同酶切组合对基因
表达研究的效果相似。本研究选择ＥｃｏＲⅠ和
ＭｓｅⅠ组合，由于它们可在相同条件下酶切，操作
方便。结果发现在酶切结束后先在６５℃水浴
１０ｍｉｎ，使酶失活，然后对酶切产物进行乙醇沉淀
回收，而不是直接连接，这样可以提高连接的效
率。此外，在连接接头之前先将上下游引物分别
退火，这也是促进高效连接的关键步骤［１４］。
本研究结果表明，影响第１轮ＰＣＲ结果的因
素主要有ＤＮＡ聚合酶的种类和引物量，应该选
择耐高温、活性强的 ＤＮＡ聚合酶。Ｐｒｅｍｉｘ　ＬＡ
Ｔａｑ　Ｈｏｔ　Ｓｔａｒｔ为一种具有热启动活性的酶，促使
引物的特异性复性和延伸，可以提高反应的有效
性和灵敏性［１５］。第２轮ＰＣＲ需要根据第１轮的
结果对模板进行稀释，其他条件与第１轮ＰＣＲ的
要求一样。较高的退火温度可以使引物的复性增
强，提高扩增带型的分辨率和特异性［１６］，并且结
合本研究对退火温度的摸索，选择高的退火温度
是必要的。
制胶时，首先应该严格按照试验要求处理胶
板和制胶，在上样前要预电泳，并将胶孔处理干
净，迅速上样后立即电泳。在高压（１　５００Ｖ）下进
行聚丙烯酰胺凝胶电泳时，由于受到试验条件的
限制，胶板受热不均以及边缘效应，容易出现“笑
脸”状。在赵培等［１７］对小麦基因组ＤＮＡ扩增产
物（ＲＡＰＤ）进行聚丙烯酰胺凝电泳时，也有过此
类问题。将电压下调至８００Ｖ左右，不仅可以解
决这一问题，而且也可以得到很好的分析结果。
硝酸 银 染 色 过 程 的 关 键 步 骤 在 于 显 色，在
Ｎａ２ＣＯ３ 溶液倒掉之后要迅速用蒸馏水冲洗。显
色液温度要控制在１２℃左右，温度太低将导致显
色时间长、条带淡，温度太高则背景颜色深，显色
时间一般在１０ｍｉｎ以内较好。
目前，ｃＤＮＡ－ＡＦＬＰ技术在植物研究上应用
很广泛。主要用于不同性状相关基因、抗逆相关
基因等的分离，并获得了一些差异基因［１８－２１］。异
子蓬的异型性种子萌发时存在显著的差异［９］，褐
色种子无休眠现象，萌发率接近１００％，黑色种子
存在非深度的生理休眠，萌发率不足４０％，这种
现象的内在机制有待深入研究。而目前对异子蓬
基因表达的研究很有限，利用ｃＤＮＡ－ＡＦＬＰ技术
对异子蓬展开分子生物学方面的深入研究将是一
种有效的途径。
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ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ｂｒｅｅｄｓ　ｆｏｒ　ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ｏｒ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ｓｐｅｃｉｅｓ　ｏｆ　ｐｏｗ－
ｄｅｒｙ　ｍｉｌｄｅｗ　ｉｎ　ｗｈｅａｔ　ｕｓｉｎｇ　ａｇｏ－ｇｅｌ　ａｎｄ　ＰＡＧ　ｅｌｅｃｔｒｏ－
ｐｈｏｒｅｔｉｃ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ［Ｊ］．Ｃｈｉｎａ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（中国生物
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ｆｅｒｅｎｔｉａｌｙ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｇｅｎｅｓ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　Ｂａｍｂｏｏ　ｍｏｓａｉｃ　ｖｉ－
ｒｕｓ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ　ｂｙ　ｃＤＮＡ－ａｍｐｌｉｆｉｅｄ
ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｌｅｎｇｔｈ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ［Ｊ］．ＢＭＣ　Ｐｌａｎｔ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，
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ｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌｙ　ｉｎｖｏｌｖｅｄ　ｉｎ　ｂａｒｌｅｙ　ｓｅｅｄ　ｇｅｒ－
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Ｐｈａｌａｅｎｏｐｓｉｓ　Ｈｓｉａｎｇ　Ｆｅｉ　ｃｖ．Ｈ．Ｆ．ａｎｄ　ｉｔｓ　ｓｏｍａｃｌｏｎａｌ　ｖａｒｉ－
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ｓｉｓ　ｒｅｖｅａｌｓ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｔｏ　ｓａｌｔ
ｓｔｒｅｓｓ　ｉｎ　ａ　ｈａｌｏｐｈｙｔｅ　Ｓｐａｒｔｉｎａ　ａｌｔｅｒｎｉｆｉｏｒａ　Ｌｏｉｓｅｌ［Ｊ］．
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·１７·８期 邢佳佳等：异子蓬异型种子萌发基因差显的ｃＤＮＡ－ＡＦＬＰ技术体系优化