全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·技术与方法· 2008年第4期
收稿日期:2007-01-07
作者简介:闫素丽(1982-),女,汉族,在读硕士研究生,研究方向:作物遗传育种;E-mail:yansuli2005@126.com
通讯作者:安玉麟(1954-),男,研究员,硕士生导师;E-mail:nkyanyulin@163.com
染色体核型是指某一物种所特有的一组染色
体或一套染色体的形态特征。核型分析是对生物细
胞核内全部染色体的形态特征进行分析,是物种分
类的基本依据。以核型为基础的染色体微分离、微
克隆技术是指在显微镜下对特定染色体进行显微
分离或显微切割,随后进行 PCR扩增、DNA鉴定和
克隆,进而可以快速的建立相应的 DNA文库、筛选
有用探针、构建特定区域分子连锁图谱等。目前该
技术已经在动植物遗传与进化研究中显示出了独
特作用。对近年来核型分析和染色体显微切割技术
的方法进行了综述,并简要介绍了其应用和前景。
1 核型分析
核型是根据细胞分裂中期浓缩的染色体形态
结构建立的,核型模式图通常是将显微拍摄的染色
体照片剪贴、整理、绘制而成。不同的物种具有不同
的核型,因此核型是区别物种的基本遗传学依据,
也对分子生物学的研究具有指导意义。
1.1 染色体标本的制作过程
1.1.1 取材 核型分析多以初生根的根尖为材料,
因为根尖易培养、不受季节影响,且细胞分裂旺盛、
集中、容易辨别。李懋学[1]认为凡能进行细胞分裂
的植物组织或单个细胞都可以作为取材的对象。植
物分生组织的生长具有一定周期性,这就限制了取
材时间,一般认为取材应选在细胞分裂中期最为合
适,研究表明,植物细胞分裂中期高峰一般出现在
上午 8:30~11:30,但也有植物分裂中期的时间段不
只一个,如阿拉伯茶[2]1d至少出现 2个分裂高峰,
因此,取材时要根据材料选择合适的时间。
1.1.2 预处理 核型分析的关键是预处理,合理的
预处理能得到分裂相高,形态好的中期染色体。实
染色体核型分析及染色体显微分离技术研究进展
闫素丽 1,2 安玉麟 2 孙瑞芬 2 李素萍 2
(1内蒙古农业大学,呼和浩特 010019;2内蒙古农牧业科学院,呼和浩特 010031)
摘 要: 染色体核型分析是遗传学研究的重要手段,也是物种分类和鉴定的基本依据。染色体显微切割技术是细
胞遗传学和分子遗传学相结合的一种技术,应用前景广阔。重点综述了染色体核型分析和单染色体显微切割技术的操作
规程。
关键词: 染色体 核型分析 显微切割 微克隆
ResearchProgressofKaryotypeAnalysisandChromosome
Micro-dissectionTechnology
YanSuli1,2 AnYulin2 SunRuifen2 LiSuping2
(1InnerMongoliaAgricultureUniversity,Huhhot010019;2InnerMongoliaAcademyofAgricultureandAnimalHusbandry
Sciences,Huhhot010031)
Abstract: Karyotypeanalysisisanimportantmethodforgeneticresearch,itisalsothebasisofplantclasification
andappraisal.Chromosomemicro-disectionandmicro-cloneisacombinedtechnologyofcytogeneticsandmolecular
genetics,whichhaveabrightprospect.Themajorproceduresofkaryotypeanalysisandmicro-disectionandmicro-clone
weresummarizedinthispaper.
Keywords: Chromosome KaryotypeanalysisMicro-disection Micro-cloning
2008年第4期
际操作中常用的方法有物理方法和化学方法。
物理方法是用低温对材料进行处理,处理温度
一般在 0℃~8℃,常用的方法是用冰水混合物 4℃
对材料进行处理,该方法的优点是简单、经济、安
全。
化学方法预处理常用的试剂有:秋水仙素、对
二氯苯、8-羟喹啉、α-溴荼和风油精等。根据不同的
材料选择合适的试剂,秋水仙素毒性较强,价格较
高,处理效果好,但处理时间不能过长;对二氯苯预
处理的效果与秋水仙素相当,也具有较强的毒性,
价格较低;8-羟喹啉较适宜处理较大染色体的植
物;α-溴荼对禾本科和水生植物的非离体材料处理
效果较好[3];风油精处理的特点是经济、安全,近年
来在水稻[4]、烟草[5]、平邑甜茶[6]等植物上采用过,效
果较好,但未见用于其它植物。
1.1.3 固定 固定是用渗透力强的固定液将材料
迅速杀死,使细胞保持原有状态[3,7]。常用的固定液
有卡诺氏固定液(无水乙醇:冰醋酸=3:1),也有少
数人用甲醇冰醋酸溶液(甲醇:冰醋酸=3:1)来固定
材料。
1.1.4 解离 解离的目的是除去细胞壁与胞间层
之间的果胶,软化细胞壁。材料固定后应尽快解离。
研究表明,固定后立即解离的材料压片效果要优于
固定后保存的材料[3]。固定好的材料若不能及时解
离应保存在 70%酒精中。
材料解离方法有酶解法和酸解法。酶解法是用
低浓度的果胶酶(1%~2%)和纤维素酶(1%~5%)的
混合液解离材料,解离时间一般在室温下 2~5h。酸
解法一般是将材料放入预热 60℃的 1mol/LHCl中
解离,解离时间视不同的材料而定,一般为几分钟
到十几分钟或更长[8]。
1.1.5 染色 为方便观察分析要对染色体染色,常
用的染色剂有醋酸洋红、铁矾-苏木精、Schif试剂、
品红、改良的卡宝品红等。染色时根据不同的材料
选择合适的染色剂,但染色时要保证细胞质不染色
或染色浅,以免影响观察效果。
1.1.6 制片 常用的制片方法有压片和涂片 2
种,常规压片法不固定,只要压片时盖玻片保持不
动使染色体分散开来即可,此方法容易操作;涂片
法要先将材料弄碎,使细胞均匀分散开,再制片观
察,这种方法操作较复杂,但能使细胞更好的分散
开。
1.1.7 检片、封片 在低倍镜下找到分散良好的中
期相细胞后,调到高倍镜下观察拍照。若不能及时
对片子进行拍照或想短时间保存较好的片子,可以
用石蜡、凡士林、甘油(稀释后加一滴甲醛)或无色
指甲油把盖玻片的四周密封起来,置于冰箱冷藏室
保存[8]。
1.2 核型分析方法
1.2.1 手工核型分析法 核型分析时通常按照李
懋学[9]的标准来确定染色的数目、形态;按 Stebbins[10]
的方法确定核型类别。其过程是选取数目完整,分
散良好的染色体标本进行显微照相,照片放大后将
染色体逐条剪下,以染色体长度和着丝点 2个参数
为依据对染色体进行人工配对,测量出长臂与短
臂,并算出它们的平均值、相对长度及臂比,绘制出
核型模式图。由于这种方法是手工进行的,费时、费
力、测量误差也比较大。因此,一定程度上影响了核
型分析的准确性。
1.2.2 染色体图像核型分析系统分析法 染色体
图像核型分析系统是一以电脑和手工核型分析步
骤为基础的染色体核型分析系统,能够准确、快速、
方便的将原始染色体显微图像转变为整齐的染色
体分类图像,并能将结果分析、输出及储存[11~13]。因
此,可以将研究人员从枯燥的手工测量中解放出
来,提高工作效率,但其缺点是耗资较大。
1.2.3 利用AdobePhotoshop软件进行核型分析 电
脑系统运用 AdobePhotoshop软件,不仅能够很容易
地完成染色体的配对排列,非常精确地测量染色体
各臂的长度及全长,建立核型模式图,而且可以去
除原照片中的斑点、划痕、调整亮度对比度、对交叉
重叠的染色体臂进行修整等,使分析结果比较完
美。因此当此软件推出时,国内外许多人就尝试运
用它在教学、科研及临床实践中进行核型分析[14]。
另外 MicrosoftOficeExcel可以以 AdobePhotoshop
软件测量的染色体长度数据为基础,绘制出精确
的核型模式图[15]。AdobePhotoshop软件与 Microsoft
OficeExcel软件的结合使用将会使核型分析结果
更加完美,这与染色体核型分析系统相比较费用大
大降低,而且操作方便。目前,已经广泛应用在核型
闫素丽等:染色体核型分析及染色体显微分离技术研究进展 71
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第4期
分析研究中。
2 染色体微切割、微克隆技术
染色体微切割、微克隆技术最早是 1981年
Scalenghe等[16]创立的,它为遗传学研究提供了有力
的手段,但当时滞后的扩增技术限制了该技术的发
展。随着 1989年 PCR技术与微分离、微克隆技术
的结合,该技术进入了一个新阶段并广泛应用于基
因工程研究。其技术流程为染色体标本的制备、目
标染色体的识别、微分离、分离片断的 PCR扩增和
鉴定等。
2.1 染色体标本的制备及目标染色体的识别
用于显微分离的染色体标本制备方法与常规
制片基本相同,只是固定液中酸的比率要适当降
低,以减少酸对 DNA的破坏,宋文芹[17]在制片中用
70%酒精取代了传统的固定液。为使细胞质背景清
楚,崔丽华等[18]采用去壁低渗法,提高了染色体分
离的效率。但无论用什么方法,都要使染色体尽量
散开,易于识别目标染色体。
目标染色体的识别,早期报道主要是一些染色
体容易识别的材料,如田靫等[19]对附加在 TAI-27
中的中间偃麦草染色体进行了分离;何聪芬等[20]成
功的分离了携带抗病基因的单价体。这种方法的优
点是所分离的染色体不受伤害,能够建立完整的
DNA文库,但其缺点是只能识别一些容易辨认的
染色体,对于复杂、难分辨的染色体很难操作。分带
技术的出现及应用使得任意一条染色体或者染色
体任意区段的显微切割成为可能。田靫[21]将 C-分带
技术运用在小麦 1D染色体的微切割上,并进行了
微克隆。
2.2 目标染色体的显微切割和分离
目前染色体显微分离与切割的方法主要有 4
种,即微细玻璃针法、激光显微切割法、流式细胞仪
法、微细玻璃针切割法和显微激光切割相结合的方
法。
2.2.1 微细玻璃针法 微细玻璃针法是借助倒置
显微镜用尖端直径不超过 0.5μm的细玻璃针对目
标染色体进行直接切割,将切割下来的染色体连同
细玻璃针的针尖一同折断于放有蛋白酶 K的
Eppendorf管中,高速离心数秒后,将得到的染色体
DNA用于 PCR扩增或者-20℃保存备用。这种方法
是染色体显微切割的基本方法,其特点是技术要求
较高、不容易掌握,但是其较低的费用使得这项技
术已经在玉米[22]、花椰菜[23]、石蒜[24]和木本植物银杏[25]、
欧洲山杨[26]、柚[27]等多种植物中广泛应用。
2.2.2 激光显微切割法 激光微束是 20世纪 60
年代激光技术问世后在生物学和医学领域中出现
的一项新技术。1986年这项技术成功运用于切割
动物染色体后,1988年梁宏等[28]首次尝试用激光切
割植物染色体,使激光显微照射用于植物染色体工
程成为可能。之后,王兰岚[29,30]等人在国内首次成
功采用氩离子激光微束切割了蚕豆等多种植物的
染色体片段,但是由于氩离子激光能量太大,损伤
了染色体 DNA,没能将切割的染色体分离出来。
1992年日本学者 Fukui等开发了激光显微切割植
物染色体的方法,其过程是将染色体标本制作在贴
有特殊薄膜的培养皿底部,在倒置显微镜下找到好
的分裂相后,先用足以穿透薄膜的较大功率的激光
切出一个以目标染色体为中心的八角膜或长方形
膜(此时膜已与底膜分开),再用较小功率的激光束
照射,以蒸发掉此范围内目标染色体以外的核染色
体,最后只留下目标染色体。运用这一技术马有志
等[31]用氩离子切割了普通小麦与小麦-中间偃麦草
染色体。何聪芬等[20]利用激光显微切割技术分离了
小麦遗传背景下携带黄矮病抗性基因的染色体。这
一技术较玻璃针法的优点为可以自动操作、容易掌
握,但是微束激光切割仪价格昂贵,很难广泛应用。
2.2.3 微细玻璃针和激光显微切割相结合的方
法 虽然玻璃针法和微束激光法是微切割染色体
的两种可靠方法,但是玻璃针法操作复杂而激光法
费用高昂,给科研工作带来了一定困难。1998年王
槐等[32]在王兰岚[29,30]等人的基础上综合了微细玻璃
针法和激光显微切割法,探索出了一条简便有效的
利用 Nd-YAG激光微束切割植物染色体的方法。
这种方法不仅费用低而且切割细致精确,所得到的
DNA污染率也大幅度降低,为深入进行染色体特
定区域的微切割及微克隆工作奠定了基础。2001
年曹能等人[33]利用这种方法成功分离了黑麦染色
体,这必将对深入开展细胞遗传学及分子生物学的
研究产生深远影响。
2.2.4 流式细胞分类器法 流式细胞分类器法的
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2008年第4期
原理是:染色体能与特异的荧光染料 (Hoechst和
Chromomycin)结合,并且由于各条染色体组分的不
同以及染色体上 DNA碱基序列的非随机分布,使
他们吸收 Hoechst和 Chromomycin的量及比例也就
不同,激光照射后,染色体呈现出不同的荧光带,将
目标染色体发出的荧光波长输入计算机,用计算机
控制将发出同一波长的染色体收集到一起,从而得
到要分离的目标染色体。这种分离方法适用于染色
体形态差异较大的材料,能在短时间内分离到大量
的同一染色体,但是其设备昂贵,在科学研究中难
以普及。
2.3 PCR扩增
早期的克隆方法主要是酶切直接克隆,这种方
法操作精细、所需底物较多且工作量大、效率低,不
利于后续研究的需要,因此若将分离到的染色体
DNA经过 PCR扩增后再克隆到载体上,效率将会
大大提高。1989年 Ludecke等将 PCR技术与染色
体显微操作技术结合后,先后出现了接头引物 PCR
(LA-PCR)、简并引物 PCR(DOP-PCR)、单一引物
PCR(SUP-PCR)等,但研究中普遍采用的是接头引
物 PCR(LA-PCR)和简并引物 PCR(DOP-PCR)2种
方法。
2.3.1 连接接头 PCR LA-PCR是用人工合成的
两条互补寡聚核苷酸链(Linker和 adapter)做连接
接头,连接接头互补后产生粘性末端,选取与
Linker和 adapter产生相同末端的内切酶消化染色
体 DNA后与连接接头相连接,再用其中的接头
(Linker)作引物就可以扩增任意未知的 DNA片断。
这种方法减少了 DNA污染的可能,并且不存在选
择性的扩增,极大提高了文库的完整性,是染色体
显微切割和扩增技术史上的一次飞跃。由于某些限
制性内切酶(Sau3AI,MboI,HpaI等)对胞嘧啶甲
基化敏感,而高等生物的核 DNA中未甲基化的胞
嘧啶常常位于富含单/低拷贝的区域[34],因此为防
止扩增产物高频率重复序列的出现,在 LA-PCR中
常使用Sau3AI、MboI、HpaI这3种限制性内切酶。
2.3.2 简并引物PCR DOP-PCR由wesley1989年[35]
首次提出,他认为在基因组 DNA中,存在一种三联
核苷酸序列(5pGAA3p),此序列每 64个碱基就会
出现一次,若以此序列的互补顺序为起点,后随 4
个随机核苷酸,按克隆的需要设计一个带有特定酶
切位点的核苷酸片段引物,此引物在复性温度低时
会与模板产生低严谨性配对。这样,便可以对片断
DNA进行扩增。该技术优先扩增目标染色体上的
单低拷贝序列,有利于筛选目标染色体的特异性探
针,而且无需对所切割的染色体 DNA进行限制性
酶切,具有快速、高效、工作量小的优点,但是由于
它存在选择性扩增问题,因而不利于构建完整的
DNA文库。
2.4 扩增产物的鉴定
鉴定扩增产物的方法有 Southern杂交法、原位
杂交法、PCR法及 STS微卫星等序列扩增法[36]等,
一般常用的是 Southern杂交法和原位杂交法。
2.4.1 southern杂交法 Southern杂交分析是目前
鉴定扩增片段的常用方法,它可以初步确定扩增片
段的来源,也可确定一个克隆的插入片段是单拷
贝、低拷贝或是重复序列。Southern杂交时,可以用
同位素或生物素标记的基因组 DNA做探针与扩增
产物杂交,也可以用标记的扩增产物做探针与基因
组 DNA杂交。但即使有杂交信号,所扩增的片段也
可能是与目的染色体同源的序列,因此需要进行下
一步的鉴定。
2.4.2 原位杂交法 Southern杂交鉴定法具有很
大局限性,它不能确定扩增产物是来自于哪一条染
色体,而原位杂交的手段可以一定程度上确定扩增
片断与目标染色体的同源性,但是该技术操作复
杂,并且对基因组复杂的植物来说难度更大。因此,
目前报道很少。
3 染色体显微切割技术的应用和展望
随着显微切割技术在构建染色体 DNA文库、
研究染色体自身结构、基因绘图等方面的成功运
用,它必将在更深层的基因组研究中发挥独特的作
用。但是,目前此项技术还存在许多不足,如良好染
色体标本的制备、目标染色体的准确辨认等,相信
随着分子生物学技术的发展,这些问题都会得以解
决,显微操作技术也必将有更广阔的前景。
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