全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第 6期
收稿日期：2008-05-12
作者简介：张文婷（1983-），女，河南洛阳人，硕士研究生，主要从事抗血栓新药的开发和研究；E-mail：windy-ting@sohu.com
通讯作者：金坚（1960-），男，教授，博士生导师，从事细胞与分子药理学研究；Tel：（0510）85918219，E-mail：jinjian31@126.com
纤溶酶原激活剂抑制物-1 （plasminogen activator inhibitor type-1，PAI-1） 是组织型纤溶酶原激活剂（t-
PA）和尿激酶型纤溶酶原激活剂（u-PA）的快速抑制剂 ，在纤溶系统中起着关键性调节作用 [1]。 血浆中的
PAI-1 主要来源于血管内皮细胞 （endothelial cell，EC）。 目前在国内血栓药物的研究中， 药物对纤溶系统
PAI-1 的影响主要集中在检测其含量和活性两方面，而药物对 PAI-1 基因表达调控影响的研究较少。
荧光定量 RT-PCR检测血管内皮细胞 PAI-1 mRNA
方法的建立
张文婷 张莲芬 周利苹 金坚
（江南大学医药学院分子药理研究室，无锡 214122）
摘 要： 为了建立用荧光定量PCR检测人微血管内皮细胞纤溶酶原激活剂抑制物-1（PAI-1）mRNA表达的方法。
提取人微血管内皮细总RNA，经RT-PCR获得靶基因（PAI-1）及管家基因（β-actin）的PCR产物。纯化后，作为标准品
梯度稀释，采用SYBR Green I定量PCR检测，建立标准曲线。方法学考核参数为特异性、线性范围、灵敏性和重复性。分
析全反式维甲酸对内皮细胞表达PAI-1 mRNA的干预效果。这种定量方法特异性好，检测的灵敏度达103拷贝，线性范
围为104~1010拷贝，循环阈值与PCR体系中起始模板量的对数值之间有着良好的线性关系（r2>0.990），批内变异≤
4.93%，批间变异≤9.12%。全反式维甲酸能上调内皮细胞PAI-1 mRNA的表达，且呈剂量依赖性。因此，荧光定量RT-
PCR检测血管内皮细胞PAI-1基因表达的方法有助于溶栓药物药理学的研究和新药筛选。
关键词： 荧光定量PCR 纤溶酶原激活剂抑制物-1 人微血管内皮细胞 全反式维甲酸
Establishment of the Method for Detecting PAI-1 mRNA
Expression in Endothelia Cells by Using Fluorescence
Quantitative RT-PCR
Zhang Wenting Zhang Lianfen Zhou Liping Jin Jian
（Laboratory of Molecular Pharmacology，School of Medicine and Pharmaceutics，Jiangnan University，Wuxi 214122）
Abstract： The method for detecting PAI-1 mRNA expression in human microvascular endothelial cells（HMEC-1）
with fluorescence quantitative RT-PCR was developed.The PCR products of PAI-1 target gene andβ-acti
housekeeping gene were obtained by RT-PCR as total RNA was extracted from HMEC-1 cells. The purified products
were employed as standards for development of PAI-1 mRNA r al-time RT-PCR with SYBR Green I. The stability，
specificity and sensitivity of the method were evaluated as well. It analyzed the effect of all-t ans ratinoic acid（ATRA）
acting on PAI-1 mRNA expression in HMEC-1 cells. The method of PAI-1 mRNA real-time PCR was established，by
which the sensitivity was detected as high as 103copi s with the line r range from 104to 1010copies.The standard curves
showed high correlations（r2>0.990）. The intra-as ay and inter-assay variation of the method was below 4.93%and 9.12%，
respectively. ATRA could up-regulate PAI-1 mRNA expression in a dose-depe dent manner（1.25~20.00μmol·L-1）on
HMEC-1 cells. The method is to be helpful for the pharmacology of thrombolytics and drug screening.
Key words： Fluorescence quantitative PCR Plasminogen activator inhibitor type-1 Human microvascula e dothelial
cells All-trans ratinoic acid
2008年第 6期
荧光定量 PCR 技术是近年来用于探讨基因表达变化的有效手段。 与传统的 mRNA 定量方法术相比，
荧光定量 PCR 具有操作简单、快速高效的特点，而且具有更高的灵敏性和特异性，能够对 mRNA 准确进行
定量 [2]。 旨在建立一种快速、灵敏、准确检测 PAI-1 mRNA 表达的方法，为进一步探讨药物的作用机制和血
栓防治类药物的开发奠定基础。
1 材料
1.1 细胞来源和培养方法
人微血管内皮细胞（HMEC-1） [3]由法国国家卫生医药研究院 U553 研究所（INSERM U553）陆核教授惠
赠，保存于液氮罐中。 HMEC-1 细胞培养 ：采用含 10%小牛血清的 MCDB-131 培养基 （含 10pg·L-1 EGF，1
ng·L-1 氢化可的松），37℃，5%CO2 培养箱中常规培养。
1.2 主要试剂
真核细胞总 RNA 提取试剂盒、通用 RT-PCR 试剂盒Ⅱ型、RealMasterMix（SYBR Green）、普通 PCR 反应
试剂和 DNA 快速回收纯化试剂盒（北京博大泰克生物基因技术有限公司）；引物由上海生工生物工程技术
服务有限公司合成；MCDB-131 培养基、EGF、氢化可的松和细胞培养级 DMSO（美国 Sigma 公司）；小牛血清
（华美生物工程公司）；其他试剂均为国产分析纯。
1.3 主要仪器
PT-100 型 PCR 仪及 Chromo4 型荧光定量 PCR 仪（美国 MJ 公司）；1-15K 型高速冷冻离心机（美国 Sig-
ma 公司）；GZNQVA 型核酸蛋白定量仪（美国 Pharmacia 公司）；R545 型快速凝胶成像系统（法国 Viber Lour-
mat 公司）；3110 型细胞培养箱（美国 Thermo-Forma 公司）。
1.4 引物设计
参考文献[4]设计引物（表 1）。
2 方法
2.1 总 RNA 提取和 cDNA 第 1 链的合成
取 106~108 个细胞按总 RNA 提取操作说
明进行，并用核酸蛋白定量仪检测其浓度。 取
1μg 总 RNA 提取液进行逆转录 ，体系含 Oligo
（dT）16 1μl，Rnasin 0.4μl （50U·μl -1），dNTPs
1μl（10mmol·L -1），5×Buffer 4μl，AMV 1μl（5U·μl -1），ddH20（treated by DEPC）补至 20μl 体系，混匀后短暂离
心后至 42℃水浴 2h，-20℃保存备用。
2.2 PAI-1 和 β-actin 标准品的制备
50μl 反应体系， 各物质的浓度为 1μl 反转录产物，10 × PCR buffer （Mg2+ 10mmol·L -1）5μl，dNTPs 1μl
（10mmol·L -1），引物各 0.5μmol·L -1，Taq 酶（5U·μl -1）0.4μl。 反应条件为 94℃ 5min 预变性，94℃ 50s、56℃
30s、72℃ 1min 、32 个循环，72℃延伸 10min。
PCR 产物经 1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定，并做切胶回收。 具体步骤按 DNA 快速纯化回收试剂盒的操作
说明进行。 纯化产物用核酸蛋白定量仪定量，并通过如下公式计算纯化产物原液的浓度。
DNA 模板浓度（copies·μl -1）= OD260 ×0.05×10
-6
g·μl
-1
×40（稀释倍数）
660g·mol
-1
×碱基对数
×6.02×1023

  5 3   bp
PAI-1  GCTGGTGAATGCCCTCTACT 188
 GCAGTTCCAGGATGTCGTAGT
-actin  CTTAGTTGCGTTACACCCTTTCTTG 159
 CTGCTGTCACCTTCACCGTTCC

表 1 靶基因 PAI-1 和管家基因 β-actin 的引物序列
说明：1 OD260 = 0.05μg·μl -1 双链 DNA；1 对碱基平均分子量 = 660g·mol -1；
碱基对数：PA I-1 188，β-actin 159；6.02 ×1023：阿伏加德罗常数
张文婷等：荧光定量 RT-PCR检测血管内皮细胞 PAI-1 mRNA方法的建立 153
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2008年第 6期
2.3 Realtime PCR 体系的优化
分别以退火温度 55℃~65℃、引物浓度 0.1~0.5μmol·L -1 对 PCR 体系进行优化 ，观察目标基因与内参
的标准曲线斜率和相关系数，计算扩增效率，使 2 者接近并趋近 1。
确定最终 SYBR Green I 定量 PCR 条件：（1） 反应体系：RealMasterMix （SYBR Green）10μl、 引物各 0.5
μmol·L -1、cDNA 模板 1μl、ddH20 （treated by DEPC）补至 20μl； （2）扩增条件 ：预变性 94℃ 3min、94℃ 30s、
56℃ 30s 、72℃ 30S 、40 个循环，72℃延伸 7min。
2.4 PAI-1 和 β-actin 标准曲线的建立
取 PAI-1 和 β-actin 的标准品，10 倍梯度稀释，范围从 1010~101 拷贝，每个样品点做 3 管重复，进行上
述荧光定量 PCR 扩增反应。 扩增反应结束后进行熔解曲线分析。 同时设立无模板的空白对照（no template
control，NTC）。数据收集和标准曲线的生成由仪器自带软件 Opticon Monitor 2TM完成。阈值线采用手动设定，
并被自动应用于每个样品孔，从而确保样品分析的一致性。
2.5 灵敏度、特异性、重复性试验
通过标准曲线确定 PAI-1 和 β-actin 检测的灵敏度。 扩增完毕后，进行熔解曲线分析，从 65℃~95℃，每
0.5℃保持 1s，读板 1 次。 通过对生成的熔解曲线，分析产物的特异性。
取 PAI-1 和 β-actin 的标准品，作为待测品，在连续 3d 内进行 3 次荧光定量 PCR 检测，每次每个样品
重复 3 个复管。 计算批内和批间变异。
2.6 全反式维甲酸（ATRA）对内皮细胞表达 PAI-1 mRNA 的干预
HMEC-1 细胞培养至融合，用 0.25%（m/v）胰酶溶液消化后铺于 6 孔细胞板；常规培养 1~2d 后转为含
2%小牛血清培养基培养 24h，使细胞同步化。 分别以含 1.25、5.00 和 20.00 μmol·L -1 的 ATRA 的低血清培
养基孵育细胞 24h。对照仅加入 2%小牛血清培养基。各样品均做 3 复孔。随后按前述方法进行 PAI-1mRNA
表达水平的检测。
2.7 统计学方法
数据以均数±标准差 [x ± s]表示，样品 Ct 值的批内与批间检测的变异程度由变异系数公式 [CV =（s/x）
×100%]评价。 t-PA mRNA 的相对表达量以公式 2 （-△Ct）表示，其中△Ct=Ct PAI-1-Ct β-actin[5]。 组间数据比较采用 t
检验进行统计学处理，通过 Excel 软件包完成。
3 结果
3.1 PAI-1 和 β-actin 标准品的制备
PCR 产物纯化后经 1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定（图 1）。靶基因 PAI-1 与管家基因 β-actin 的 PCR 纯化产
物分别呈位于 188bp 和 159bp 的特异条带， 且无其他杂带 。 纯化产物通过公式计算得原液浓度 ：CPAI-1 ＝
1.97×1012（copies·μl -1），Cβ-actin ＝ 1.23 ×1012（copies·μl -1）。

图 1 PCR 产物及胶回收纯化产物 1.5%琼脂糖凝胶电泳图
1：200 bp DNA Ladder；2：β-actin PCR 产物；3：PAI-1 PCR 产物
纯化前 纯化后
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3.2 PAI-1 和 β-actin 标准曲线和线性范围
PAI-1 标准曲线回归方程为 y = -0.33x+11.60；β-actin 标准曲线回归方程为 y = -0.32x+12.77。 由图 2
可知，两者的标准曲线的线性范围较广，至少可达 6 个数量级。通过仪器自带的软件进行统计学分析，表明
在检测的线性范围内，Ct 值和起始模板拷贝数的相关性均较好（r2 分别为 0.991 和 0.995）。
图 2 PAI-1 和 β-actin 定量 PCR 标准曲线
3.3 标准曲线的灵敏性及溶解曲线分析
将 PAI-1 基因和 β-actin 基因标准品做梯度稀释（1010 ~ 104 拷贝），进行荧光定量 PCR，得到系列曲线，
至 104 拷贝时仍有特征性扩增曲线，呈明显的“S”型，说明用此引物通过荧光定量 PCR 测定血管内皮细胞
PAI-1 基因及 β-actin 基因灵敏性好。 熔解曲线分析发现 PAI-1 和 β-actin 基因的 PCR 产物均呈较为锐利的
单一峰（图 3），温度分别为 85℃和 83℃左右，说明此引物特异性高。
图 3 PAI-1 和 β-actin 产物的熔解曲线
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3.4 重复性实验
以高拷贝 （108）和低拷贝 （104）标准品作为待测品 ，在连续 3d 内分别对靶基因 PAI-1 与管家基因 β-
actin 进行 3 次荧光定量 PCR 检测，每次每个样品重复 3 个复管。结果表明，批内变异≤4.93%，批间变异≤
9.12%。 说明该方法具有较好的可重复性及再现性。
3.5 ATRA 对内皮细胞 PAI-1 mRNA 表达的影响
由图 4 可知， 随着浓度的增加，ATRA 对 HMEC-1 细胞呈现出剂量依赖性上调 PAI-1 mRNA 表达的作
用 。 与单纯培养基组 （0μmol·L -1 ATRA） 相比
1.25、5.00 和 20.00μmol·L -1 ATRA 组上调 PAI-1
mRNA 表达的效果具有明显差异 （P < 0.05，n =
3）。 在浓度为 20.00μmol·L -1 时，ATRA 可将 PAI-
1 mRNA 表达上调约 2.6 倍。
4 讨论
SYBR Green Ι 实时荧光定量 PCR 是目前较
为准确定量检测核酸的一种方法 [6]。 SYBR Green
Ι 是一种能与双链 DNA 结合发光的荧光染料，与
双链 DNA 结合后荧光大大增强 。 因此 ，SYBR
Green Ι 的荧光信号强度与双链 DNA 的数量相关，可以根据荧光信号检测出 PCR 体系存在的双链 DNA 数
量。 由于 SYBR Green Ι 没有特异性，不能识别特定的双链，只要是双链就会结合发光，对 PCR 反应中的非
特异性扩增或引物二聚体也会产生荧光，通常本底较高，会有假阳性发生。 目前产物的非特异性扩增以及
引物二聚体的问题可以通过溶解曲线的分析得以解决。 因此，根据样品的 Ct 值参照标准曲线，经软件分析
处理后可以精确的计算出样品的拷贝数。 由于 SYBR Green Ι 能与所有的双链 DNA 相结合，所以对不同模
板不需要特别定制不同的特异性探针，通用性较好，并且价格相对较低。因此，国内外在科研中使用比较普
遍 [7，8]。
荧光定量 PCR 检测方法分为绝对定量和相对定量，绝对定量适用于标准品和样品性质相同，如确定
染色体或基因拷贝数和病毒载量。 相对定量适用于标准品和样品性质不同，如以 cDNA 为标准测定 mRNA
表达。
采用 SYBR Green Ι 法成功建立了检测血管内皮细胞 PAI-1 基因和 β-actin 基因的荧光定量 PCR 标准
曲线，扩增曲线呈明显的“S”型，而且在平台期几乎重合，说明获得的扩增曲线良好。 溶解曲线分析显示出
PAI-1 基因 PCR 产物在 85℃左右有一单一的特异峰，β-actin 基因产物在 83℃左右有一特异峰，峰的形状比
较锐利，说明没有引物二聚体及非特异扩增产物，引物的特异性很好。评价标准曲线的优劣有 2 个指标，即
相关系数和斜率。 相关系数反映标准曲线的直线性，理想值应大于 0.98，越接近 1，直线性越好，定量越准
确。 本试验的标准曲线的相关系数接近 1，表明试验的结果可信度高，误差小；斜率可以计算出扩增效率
（PCR efficiency =（10 （1/-s））-1，S 为标准曲线方程的斜率 ），理想的扩增效率 （E）在 0.8~1.2 范围内 ，为 1~
1.01，符合要求。 标准曲线的线性范围从 1010 ~ 104 拷贝，说明建立的方法能够在宽广的范围内对目的基因
进行检测。
血栓形成是许多疾病发病机制中涉及的重要病理过程，在血栓性疾病的发展过程中，内源纤溶活性衰
减是重要病因之一。 PAI-1 是体内纤溶系统的重要影响因子，其变化可作为疾病诊断的指标，同时也可以
反映药物对纤溶系统功能的影响。 尽管目前药物对 PAI-1 的影响多采用活性和含量的检测方法，随着分子
生物学的基因检测技术日益完善， 药物对基因表达干预作用的研究逐渐成为阐明药物作用机制的有效手
段，使药物研究更具有客观性与针对性。因为用药组与非用药组基因表达的变化是显而易见和具有可比性
图 4 ATRA 浓度对 HMEC-1 PAI-1 mRNA 表达的影响
*P < 0.05, **P < 0.01, n = 3
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的。 基因表达的变化从某种意义上反映了疾病的最早期变化，且结果分析中易排除其它因素干扰，具有很
强的针对性。
荧光定量 RT-PCR 检测内皮细胞 PAI-1mRNA 的方法具有扩增效率高，特异性强，灵敏度高，线性范围
广，可重复性好的特点。 如果将定量 PCR 技术应用于中药及其活性部位、活性成分药用研究中，对揭示药
物作用的分子机制具有重要意义，可为传统中药的开发和寻找新药提供理论依据和实验基础。
参考文献
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