全 文 ：·技术与方法·
生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 10期
利用 RNA i技术改良淀粉品质的研究进展
陈国梁　张向前 　穆三浪　陈宗礼
(陕西省延安大学生命科学学院 陕西省区域生物资源保育与利用工程技术研究中心 ,延安 716000)
　　摘 　要 : 　RNA干涉 (RNA i)是由 dsRNA引起的序列特异性基因沉默现象 ,在动、植物和真菌中广泛存在并被证实。具有
的特异性、稳定性、高效、快速以及不改变基因组的遗传组成等特性 ,为 RNA i这一新技术在植物的遗传改良等方面提供了一
个强有力的手段。重点从 RNA i的发现与淀粉品质相关的淀粉合成酶及其利用 RNA i在提高直链淀粉含量、降低直链淀粉含
量等品质改良研究方面进行了回顾并对其存在的问题作了初步探讨。
关键词 : 　RNA干扰 　改良 　淀粉品质 　淀粉合成酶
Research Advance of RNA Interference Technology in
Starch Quality Improvement
Chen Guoliang　Zhang Xiangqian　Mu Sanlang　Chen Zongli
( College of L ife Science Yan’an University Shaanxi Engineering & Technological Research Center for
Conversation & U tilization of R egional B iological Resources, Yan’an 716000)
　　Abs trac t: 　RNA interference (RNA i) is a phenomenon of special post2transcrip tional gene silencing mediated by induced dsRNA
with endogenous or exogenous homogenous sequences, and a lot of researches have been app lied to demonstrate it as a reserved mecha2
nism for gene regulation in animals, p lants and fungi. A s its has characteristics such as specific, stability, efficient change genome of ge2
netic composition, the new technology2RNA i is a effective method in p lant genetic imp rovement. This paper introduced the discovery of
RNA i, amylosynthetase and quality imp rovement in amylocellulose content by RNA i, and the p roblem about RNA i technology also was
p relim inarily discussed in this paper.
Key wo rds: 　 RNA interference　 Imp rovement　Starch quality　Amylosynthetase
收稿日期 : 2009207213
基金项目 :延安大学专项科研基金项目 ,延安大学大学生科技创新训练项目 (D20082107)
作者简介 :陈国梁 (19742) ,男 ,汉族 ,讲师 ,研究方向 :植物生物技术
通讯作者 :陈宗礼 , E2mail: glc9359@163. com　　淀粉是绿色植物果实、种子、块茎、块根等多种植物的主要组成成份及重要贮存多糖 ,在人类生活中淀粉有着举足轻重的作用 ,仅禾谷类籽粒中的淀粉就提供了人类大约 80%的能量所需 ,还有数以百计的食品和饮料与淀粉直接相关。在非食用的领域 ,淀粉作为工业原材料 ,广泛用于造纸业、包装业、纺织业、化工等行业中 [ 1 ] ,是重要的可再生工业原料。随着淀粉加工业的发展 ,淀粉深加工产品的数量不断增加 ,淀粉的应用范围不断扩大 ,对淀粉品质的要求也越来越高。影响淀粉用途的关键因素是淀粉结构 ,特定的应用目的对淀粉结构有特定的要求。淀粉由直链淀粉和支链淀粉组成。直链淀粉呈线 状、分子量小、在水中加热时易形成凝胶 ;而支链淀粉则高度分支、分子量大 (一般是直链淀粉的 1 000倍 )、水溶液的粘度较高。因此 ,直链淀粉和支链淀粉的比例决定了淀粉粒的结构 ,进而影响着淀粉的质量、功能和应用领域 ,改变淀粉结构有着很多潜在的应用价值。高支链、低直链或低支链 ,高直链的淀粉都有着广泛的工农业用途。基因工程改变淀粉质量集中于对颗粒结合型淀粉合成酶 ( GBSS)、淀粉合成酶( SS)和淀粉分支酶 ( SBE) 3种酶的操作上。一般通过导入某个酶基因的正义或反义结构 ,影响细胞内酶的含量或活性 ,从而达到对淀粉结构的控制 [ 2 ] 。
2009年第 10期 陈国梁等 :利用 RNA i技术改良淀粉品质的研究进展
淀粉根据其结构差异分为直链淀粉和支链淀粉两
种。前者一般占淀粉组成的 30% ,在不同物种直
链淀粉含量为 11% ～37% ,同一物种的不同品种
(如玉米 )的直链淀粉含量也可达 20% ～36% [ 3 ] 。
而支链淀粉是淀粉的主要组成部分 ,占 70%左右。
直链淀粉分子质量小 ,在水中加热时易形成凝胶 ,
而支链淀粉则高度分支 ,分子质量大 ,水溶液的粘
度较高。因此 ,直链淀粉和支链淀粉的含量比例
影响着淀粉粒的结构和特点 [ 4 ] ,进而影响着淀粉
的质量、功能和应用领域。
1　参与淀粉合成的主要酶
参与植物淀粉生物合成的主要酶分为 4类 [5, 6 ]。
第一类是腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶 (AGPP) ,
它是一个限速酶 ,处于淀粉合成的关键位置 ,通过遗
传操作调控该酶的活性 , 从而达到提高淀粉积
累 [ 7 ]。第二类是淀粉合成酶 ,它是葡萄糖转移酶 ,
以寡聚糖为前体 , ADP2葡萄糖为底物 ,通过 α21, 4
糖苷键不断增加寡聚糖的葡萄糖单位 ,最终合成以
α21, 4糖苷键连接的葡聚糖 ,葡聚糖又将成为淀粉
分支酶的底物用于合成支链淀粉。淀粉合成酶依据
它在淀粉中的存在状态 ,可分为颗粒结合型淀粉合
成酶 (GBSS或 SSⅠ)和可溶性淀粉合成酶 ( SSS) [ 3, 8 ]。
植物体中 SSS有 SSⅡ和 SSⅢ两种 ,对豌豆突变材料
的研究中发现 , SSⅡ基因受抑制后并未影响胚中的
淀粉含量 ,但淀粉粒出现畸形 ,出现极短或非常长的
淀粉链 ;在马铃薯块茎中 SSⅡ仅占可溶性淀粉合成
酶活性的 15% , SSⅡ基因活性的降低对块茎的影响
几乎检测不到 [ 9 ]。在马铃薯块茎中淀粉合成酶活
性的 85%与 SSⅢ有关 ,反义抑制 SSⅢ基因导致块
茎中 80%的可溶性淀粉合成酶活性丧失 ,淀粉粒出
现深度裂隙 ,但不影响支链淀粉的结构 [ 10 ] ,但在同
时反义抑制 SSⅡ和 SSⅢ的马铃薯植株中 ,淀粉粒则
没有发现裂隙 [ 11 ]。
第三类参与淀粉生物合成的酶是淀粉分支酶
( SBE) ,具有双重功能 ,一方面它能切开以α21, 4糖
苷键连接的葡聚糖 (包括直链淀粉和支链淀粉的直
链区 ) ,另一方面它又能把切下的短链通过α21, 6糖
苷键连接于主链上 , SBE有 SBE2A和 SBE2B两种同
工酶。通过改变 SS和 SBE的表达量可有效地改变
淀粉的含量和结构 ,利用反义技术同时抑制 SBE2A
和 SBE2B的表达可得到高直链淀粉含量的马铃薯
植株 [ 12 ]。
第四类参与淀粉生物合成的酶是淀粉去分支酶
(DBE) ,淀粉去分支酶能特异性地水解淀粉中的α2
1, 6糖苷键 ,在氨基酸序列上与α2淀粉酶相似 ,属于
淀粉水解酶家族。依据 DBE作用的底物的不同 ,可
将其分为两大类 :一类是极限糊精酶或称 R酶 ;另
一类是异淀粉酶。极限糊精酶以极限糊精等为底
物 ,特异去除它们的α21, 6糖苷键 ,异淀粉酶则以支
链淀粉或糖原为底物 ;去除它们的α21, 6糖苷键 ,它
不能作用于极限糊精。
2　RNA干扰技术
2. 1　RNA干扰现象的定义及作用机制
RNA i即 RNA干涉 (或 RNA干扰 )是由内源性
或外源性双链 RNA引起的序列特异性基因沉默 ,主
要是通过 siRNA介导的靶 mRNA降解 ,调节和关
闭基因的表达 ,进而调控细胞的各种高级生命活
动。RNA i现象广泛存在于生物界中 ,它在真菌中
被称为静息 ,在拟南芥、烟草等植物中被称为转录
后基因沉默 ( PTGS)或共抑制 ,在无脊椎动物如果
蝇、水螅、线虫以及脊椎动物斑马鱼、小鼠等动物
界中被称为 RNA i。 PTGS可能是生物界 ,包括植物
和动物等普遍存在的一种古老、保守而又极其重
要的遗传行为。研究表明 ,参与该过程的许多基
因具有高度的保守性 ,这可能是生物调控基因表
达及抵御病毒侵染或转座子诱导 DNA突变的一种
共有的古老生理机制。RNA i所具有的特异性、稳
定性、高效、快速以及不改变基因组的遗传组成等
特性为 RNA i这一新技术在植物功能基因组学研
究及植物的遗传改良等方面提供了一个强有力的
手段 [ 13 ] 。
2. 2　植物中的 RNA i现象
1990年 , Napoli等 [ 14 ]将查耳酮合酶基因转入牵
牛花中 ,来加深矮牵牛花的紫色 ,可是结果与预期相
反 ,许多花瓣颜色并未加深 ,反而呈杂色甚至白色。
虽然认为可能是试验方法设计错误 ,不过再进一步
研究这些转基因植株后 ,发现转入基因以及植株本
身内生的查耳酮合酶皆无法表现 ,人们将此现象称
为共抑制。后继的研究发现某些转基因植株的白色
花性状可遗传到下一代 ,有些则可回复成紫色花 ,因
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 10期
此 Jorgensen[ 15 ]推论此共同抑制现象可能涉及到遗
传物质的参与 ,但又由于改变的性状可回复 ,不会永
久改变基因体 ,故推论参与物可能是 RNA。稍后 ,
Baulcombe[ 16 ]试图将马铃薯 X病毒 ( PVX)的基因
转入烟草中 ,希望该基因所表达出的蛋白质可以
刺激烟草的免疫反应 ,增加烟草对 PVX的抵抗力。
不过结果与一般的植物免疫理论正好相反 ,引入
的 PVX基因没有表达的植株 ,对 PVX的抵抗力反
而最强 ,这表示先前转入烟草中的基因 ,与之后感
染转基因植株的 PVX 基因皆被抑制了 ,也就是共
同抑制的现象 ,显示植物界中确有基因共同抑制
的现象。
2. 3　利用 RNA干扰技术改良作物淀粉品质
结构不良的天然淀粉通常要通过各种理化方法
修饰后才能投入应用 ,一方面将大大增加生产成本 ,
另一方面会对环境造成一定污染 [ 17 ]。因此 ,人们寄
希望于生物工程手段 ,对淀粉生物合成进行调节 ,在
作物体内直接生产出结构适宜的、能满足相应需求
的“天然淀粉 ”,所以对于淀粉合成的研究一直没有
中断过。上世纪 80年代前 ,多数研究集中于对淀粉
合成中各种酶的生物化学的鉴定 ,包括酶的分离和
纯化等。自 80年代后 ,研究人员对参与淀粉合成的
酶进行了广泛的分子生物学研究。进入 90年代 ,随
着淀粉合成过程中相关酶的基因克隆以及各种植物
遗传转化体系的相继建立 ,基因工程改变淀粉质量
也相对集中在对 GBSS, SSS和 SBE 3种酶的操作
上。使利用 RNA干扰技术调控淀粉合成过程 ,改良
淀粉品质成为可能。目前 ,在利用 RNA干扰技术增
加或减少淀粉含量的研究方面都有成功的报道。
2. 3. 1　利用 RNA干扰技术提高直链淀粉含量 　淀
粉是重要的工业原料 ,但是生产不同产品所需淀粉
种类有所差别 ,如何针对工业生产所需来提高作物
某一类淀粉的含量以降低原料纯化的成本 ,是作物
遗传育种要解决的一个重要问题。利用 RNA i技术
改变代谢的物质流方向提高工业加工原料在作物中
的含量 ,无疑是一种有效的方法。在提高直链淀粉
含量方面柴晓杰等 [ 18 ]率先克隆了玉米 SB E基因 ,
构建高效的 siRNA表达体系 ,在获得的转基因植株
中能正常转录并导致内源 SB E mRNA含量下降 ,分
支酶活性明显地低于对照 ,相差最多的低 85% ,总
淀粉含量与对照之间基本没有差异 ,但直链淀粉的
含量提高了约 50%。Regina等 [ 19 ]利用 RNA i技术
抑制了小麦 SB E IIa和 SB E IIb基因表达 ,结果使其
直链淀粉含量提高到 70% 以上。并用其进行小鼠
饲喂试验 ,结果表明与普通标准淀粉相比该淀粉有
利于人类健康。项艳 [ 20 ]利用玉米 SB Eb基因构建了
高效的 RNA干涉表达载体 ,江海洋 [ 21 ]分别构建了
含胚乳特异启动子 HMV 和潮霉素筛选基因及含
bar筛选基因以 SB E IIb基因为靶标的 RNA i表达载
体 ,获得了 2株 PCR阳性玉米植株 ,期望特异性地
阻断和抑制 SB E IIb基因的表达 ,从而提高玉米直
链淀粉含量。陈忠正等 [ 22 ]利用 RNA i技术 ,通过
RT2PCR方法克隆出水稻淀粉分支酶 SB E3基因片
段 ,将该基因片段分别正向、反向组装成功构建
SB E3基因 RNA i转化载体。在农杆菌介导下 ,对粳
稻中未成熟胚诱导的愈伤组织进行转化 ,获得转基
因植株 ,可望培育出高直链淀粉含量的水稻。虽然
半定量 RT2PCR鉴定出转化苗 T1代种子中 SB E3基
因表达被明显抑制 ,但只引起转基因水稻胚乳中直
链淀粉含量少量的提高 ,说明采用 RNA i仅沉默
SBE3基因对水稻胚乳直链淀粉含量没有显著影响。
刘媛 [ 23 ]构建了以 CaMV 35S组成型启动子驱动的 ,
以 SBE基因 SB Ea和 SB Eb为靶标进行同时干扰的
RNA i植物表达载体 ,以期待培育出马铃薯高直链淀
粉的新品系。康国章等 [ 24 ]采用 RT2PCR方法从小
麦的发育籽粒中克隆出 SS III基因部分 cDNA 片
段 ,构建了由 35S启动子调控的 SS III基因的反义
表达载体和 SS III基因的 RNA i干扰载体 ,把这两
种载体导入到小麦中 ,可降低或抑制 SS III基因的
表达 ,通过分析转基因小麦籽粒内支链淀粉组分
的变化来研究 SS III基因在调控小麦支链淀粉合成
中的作用。
2. 3. 2　利用 RNA干扰技术降低直链淀粉含量 　直
链淀粉含量过高的面粉制成的馒头体积小、韧性差、
制成的面条易断、粘 ,食用品质差 ,而直链淀粉含量
适中或偏低时 ,制成的馒头和面条具有较好的韧性
和食用品质 [ 25 ]。小麦中直链淀粉合成的关键酶是
颗粒结合型淀粉合成酶 ( GBSS I即 WAXY蛋白 )。
李加瑞等 [ 26 ]用 W axy编码区 683 bp的正向和反向
片段以及 150 bp内含子 ,构建了以玉米 ubi1启动子
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2009年第 10期 陈国梁等 :利用 RNA i技术改良淀粉品质的研究进展
驱动的 RNA i植物表达载体。用农杆菌介导的方法
对扬麦幼胚进行转化 ,获得了直链淀粉含量明显下降
的小麦植株 ,且供试小麦品种广泛应用于生产实践 ,
使得沉默植株有潜在的应用价值。Shimada等 [27 ]利用
RNA i沉默策略 ,将红薯 W axy基因沉默 ,培育出低直
链淀粉含量的转基因个体。黄冰艳等 [ 28 ]构建了含极
限糊精酶基因片段反向重复结构的 RNA i载体 ,通过
根癌农杆菌介导水稻转化 ,获得水稻转基因再生株
系。以极限糊精酶抗体对转基因株系胚乳发育期籽
粒蛋白质进行 W estern杂交 ,并经 SDS2PAGE极限糊
精酶活性检测。结果显示 ,该反向重复结构在胚乳发
育期表达 ,减少了极限糊精酶的积累 ,转化株系的极
限糊精酶活性只有野生型的 10% ,表明该载体可有
效地抑制水稻胚乳中极限糊精酶的活性。
本课题组构建了由马铃薯块茎组织特异性启动
子驱动的能同时干扰 3种淀粉合成酶的 RNA i载体 ,
用于马铃薯遗传转化研究 ,期待选育出无直链淀粉 ,
且支链淀粉链较短、糊化温度低的马铃薯新品系。
3　问题与展望
RNA i技术是一项抑制基因表达的技术 ,除了具
有特异性、稳定性、高效、快速等特性外 ,还有不改变
基因组的遗传组成特性 ,即作用的靶标只能是作物
原有的基因而不能引入新的基因 ,所以在所得转基
因植物中既不存在有功能的基因或蛋白 ,也不存在
转基因 mRNA的积累 ,符合人们对生物安全性的高
要求 ,在农作物及淀粉品质改良研究方面显示出应
用的优越性。
但是 ,要实现常规化、可预见性和高效性以及商
业应用 ,还需要进行大量研究和解决众多问题。如
在植物中存在系统性 RNA沉默现象 ,即 RNA沉默
不会局限于单个细胞内 ,可以在细胞与细胞之间、甚
至由诱导部位向更远的组织传播。所以当 RNA i现
象在一个特定的组织中表达时 , RNA i现象也可能出
现在其它并不希望出现的组织中 ,即靶基因沉默不
能控制在特定的时空 ,使得在植物发育的不同时期
或不同器官中有选择地进行靶基因沉默还很困
难 [ 29, 30 ]。由于 siRNA和靶 mRNA有一定的错配和
间隙 ,因此 siRNA在一基因组可能中作用于上百个
潜在的目标序列 [ 31 ]。Jackson等 [ 32 ]发现 ,当非目标
基因有 7个连续核苷酸残基和 siRNA相同时 ,就可
能被抑制 ,因此 RNA i技术应用过程中需要根据靶
基因来设计 siRNA。位点选择不当还常常会导致脱
靶效应 ,需要知道详细的靶基因序列信息 ,以及切实
可行的选择靶标基因片段的规则或理论依据 ,这就
对植物的基因组学及 RNA i机制的研究提出了较高
要求。同时对植物淀粉酶代谢网络和时空调控深入
的了解 ,对它们的同工酶的功能差异进行广泛和细
致的鉴定 ,并据此设计巧妙的实验方案等才有可能
很好地利用 RNA i技术改良淀粉品质。
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(下转第 101页 )
19
2009年第 10期 陈文华等 :大豆花叶病毒 CP基因原核表达与抗血清制备
3　讨论
病毒特异性抗血清制备最直接的方法是分离纯
化病毒 ,加佐剂后直接免疫动物。但侵染一种植物
的病毒往往有几种 ,且形态相似 ,导致分离的病毒往
往是几种病毒的混合物 ,制备的抗血清特异性较差。
通过纯化原核表达的外壳蛋白制备抗血清简便 ,而
且特异性强 ,但 SDS2PAGE制备电泳纯化外壳蛋白 ,
CP的空间结构被破坏 ,制备的抗体与抗原的结合是
序列特异性的结合 ,有时用此方法制备的抗体与病
毒粒子不能结合 ,导致不能用于间接 EL ISA检测。
本研究制备的抗血清检测病叶结果验证了能够与天
然病毒结合。
大豆花叶病毒是一种世界性大豆病害 ,尤其在
亚洲病害较重 ,严重影响大豆的产量和品质 ,选育大
豆无毒种子或者低感染率种子对提高大豆产量有现
实意义。从很多样本中才能筛选出个别无毒苗 ,如
果用 RT2PCR 的方法检测人力和物力的消耗都很
大 ,有了 SMV检测试剂盒可以方便、经济地对大量
样本进行筛选。
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