全 文 ：收稿日期：2009-01-16
基金项目：国家自然科学基金（30801356、30871237、30872758），重庆市科委自然科学基金（2007BB5302），重庆医科大学重点课题
（XBZD200707）
作者简介：崔涛（1984-），男 硕士，研究方向：分子肿瘤学；E-mail：cuitao19842006@163.com
通讯作者：宋方洲，男，教授，博士生导师，Tel：023-68485958，E-mail：fzsongcq@163.com；卜友泉，男，副教授，Tel：023-68485096，
E-mail：buyqcn@yahoo.com.cn
在全球范围内，恶性肿瘤已成为威胁人类生命
健康的主要杀手 [1，2]。 恶性肿瘤的发生是一个多因
素作用、多基因参与、经过多个阶段才最终形成的
极其复杂的生物学现象，其中癌基因和抑癌基因的
表达失调进而诱发的细胞生长失控在肿瘤的发生
发展中起着至关重要的作用 [3，4]。 因此，寻找并鉴定
新的恶性肿瘤相关基因对于阐明肿瘤发生发展的
分子机制、 开发新的肿瘤分子诊断和治疗方法、降
低恶性肿瘤的发病率和死亡率等都具有重要的理
论和现实意义。
在本实验室前期开展的恶性肿瘤相关新基因
挖掘与筛选研究中， 发现定位于人类染色体 17q22
区的一个新基因——PRR11（Proline-rich protein 11）
基因， 推测该基因可能是一个新的肿瘤相关基因，
新基因 PRR11的克隆、原核表达及鉴定
崔涛 1，2 兰欢 1，2 杜刚 1，2 刘革力 2 易发平 1，2 卜友泉 1，2 宋方洲 1，2
（1重庆医科大学生物化学与分子生物学教研室，重庆 400016；2重庆医科大学分子医学与肿瘤研究中心，重庆 400016）
摘 要： 克隆新基因 PRR11的开放阅读框区，构建其原核表达载体，并进行表达检测及鉴定。以 Hela细胞 cDNA
为模板，RT-PCR 扩增 PRR11基因，克隆入原核表达载体 PET-28a中，酶切、测序鉴定确认获得 PRR11基因的重组原核
表达载体 PET-28a-PRR11。然后把 PET-28a-PRR11重组载体转化到 BL21中，经 IPTG诱导蛋白表达，提取细胞蛋白并
采用 SDS-PAGE和蛋白质免疫印迹法检测目的蛋白的表达情况。结果表明成功扩增了 PRR11基因，双酶切、测序鉴定证
实目的基因成功克隆到原核表达载体 PET-28a中，目的蛋白成功表达。成功构建的 PRR11基因的原核表达载体，及
PRR11的重组蛋白表达产物，为进一步研究 PRR11的基因功能奠定了基础。
关键词： PRR11基因 PET-28a 原核表达
Cloning，Prokaryotic Expression and Identification of Novel
Human Gene PRR11
Cui Tao1，2 Lan Huan1，2 Du Gang1，2 Liu Geli2 Yi Faping1，2 Bu Youquan1，2 Song Fangzhou1，2
（1Department of Biochemistry and Molecular Biology，Chongqing University of Medical Sciences，Chongqing 400016；
2Molecular Medicine and Cancer Research Center，Chongqing University of Medical Sciences，Chongqing 400016）
Abstract： It was to clone PRR11 gene，construct recombinant prokaryotic expression vector，and identify its
exogenous expression in E.coli. PRR11 gene was amplified by RT-PCR from Hela cell cDNA，and cloned into
prokaryotic expression vector PET-28a to construct PET28a-PRR11．The recombinant plasmid was subsequently
transducted into BL21 and the exogenous protein expression was induced by IPTG. The exogenous PRR11 expression
was examined by SDS-PAGE and Western immunoblotting．Results showed that PRR11 gene was successfully amplified
by PCR and cloned into PET-28a vector by restriction endonuclease and sequencing analysis. SDS-PAGE and Western
blotting demonstrated that the PRR11 was exogenously expressed in E.coli BL21 with a relatively high level. Thus，the
successfull expression of PRRII gene in E.coli could provides the basis for further research on PRR11 function.
Key words： PRR11 gene PET-28a Prokaryotic expression
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2009年第 3期·研究报告·
2009年第 3期
并对其开展了多方位的研究。目前在国内外尚没有
该基因生物学功能的任何报道。
本研究克隆了 PRR11 基因的开放阅读框区 ，
并构建其原核表达重组载体，并采用 SDS-PAGE 和
蛋白质免疫印迹法对其在大肠杆菌中的表达进行
了表达检测与鉴定， 为进一步纯化 PRR11 重组蛋
白、制备抗体，全面和系统研究 PRR11 基因的功能
尤其是在肿瘤发生发展中的作用奠定了良好的基
础。
1 材料与方法
1.1 试剂、菌株和质粒
限制性内切酶 Nco I、Not I、 反转录试剂盒 、
DNA 连接试剂盒购自 TOYOBO 公司 ；DNA 聚合酶
购自 Takara 公司；Trizol 购自 Invitrogen；IPTG，卡那
霉素购自上海生工； 凝胶成像仪为 Bio-Rad 公司；
PCR 引物由上海生工生物技术公司合成 ，DNA 测
序也由该公司完成。 DNA Marker、小量质粒纯化抽
提试剂盒和胶回收试剂盒购自天根生化科技(北京)
有限公司；LB 培养基由本室制备；PRR11 抗体购自
北京奥维亚生物技术公司 ； 中分子量蛋白标准 、
PVDF 膜及辣根过氧化物酶标记羊抗兔 IgG 购自北
京鼎国生物技术公司；化学发光试剂购自 pierce 公
司。
大肠杆菌 DH5α、BL21，原核表达质粒 PET-28a
为本室保存。
1.2 方法
1.2.1 RT-PCR 扩增 PRR11 基因 将 Hela 细胞种
植到 6 孔板中 ， 用含 10%胎牛血清的高糖 DMEM
培养基在 37℃、5% CO2 孵箱中培养， 待 Hela 细胞
在孔中融合度达到 90%~100%后处理细胞，去掉培
养基，用 PBS 洗 2 遍，然后去掉 PBS，每孔加 0.5 ml
Trizol，按 Trizol 试剂说明书提取 Hela 细胞总 RNA。
用紫外分光光度计测定总 RNA 浓度。
采用 TOYOBO 公司的反转录试剂盒将 Hela 细
胞总 RNA 反转录为 cDNA， 反应体系 ：RNA 1 μl，
olig (dT)20 5 μl，RNase Free H2O 6 μl，总体系 12 μl，
65℃加热 5 min 后放冰上冷却 10 min，然后加入 5×
RT Buffer 4 μl，10mmol/L dNTPs 2 μl，RNase Inhi-
bitor 1 μl，ReverTra Ace 1 μl，总体系 20 μl。 反应条
件：30℃ 10 min，42℃ 60 min，85℃ 5 min，4℃ 保存，
将产物 cDNA 稀释 20 倍作为模板。
根据 GenBank 中人 PRR11 基因的参考序列 ，
用 Primer Premier 5.0 软件设计并合成两条引物，上
游引物 (F)：5′-CAT GCC ATG GCC AAG TTC AAA-
CAA CGA AGA CGA- 3′，下游引物 （R）：5′-ATA A-
GA ATG CGG CCG CGT TTT GTT CAT CAA AGC T-
GC TTG-3′（划线部分分别为 Nco I 和 Not I 的酶切位
点，黑色字体为起始密码子）。预测扩增片断大小约
为 1 100 bp。PCR 反应体系：10×Buffer（Mg2+plus）5 μl、
dNTP Mixture（2.5 mmol/L）1 μl、上游引物（10 mmol/L）
1 μl、下游引物 (10 mmol/L)1 μl、DNA 聚合酶 1 μl、
ddH2O 36 μl、模板 cDNA 5 μl。 PCR 反应条件：95℃
热变性 2 min 后进行 30 个循环 。 扩增循环参数 ：
95℃ 变性 15 s，60℃ 退火 15 s，72 ℃延伸 80 s，所
有循环结束后于 72℃延伸 3 min。 1.0%琼脂糖凝胶
电泳检测 PCR 扩增产物。
1.2.2 PCR 产物的纯化回收 从琼脂糖凝胶上切
取 PRR11 基因 PCR 产物的条带， 按照胶回收试剂
盒说明书操作。 取 3 μl 纯化产物进行 1.0%琼脂糖
凝胶电泳鉴定。
1.2.3 PRR11 原核重组表达载体的构建 将含 P-
ET-28a 质粒的大肠杆菌 E.coli DH5α 接种于 5 ml
含卡那抗性 LB 液体培养基，37℃，200 r/min 摇床内
振荡过夜扩增， 使用小量质粒抽提试剂盒抽提质
粒，并使用限制性内切酶 Nco I、Not I 进行双酶切 。
同时， 将纯化后的 PRR11 基因 PCR 产物也进行双
酶切，过夜。 将双酶切后的 PET-28a 质粒和 PRR11
基因 PCR 产物回收，分别取 2 μl 进行 1%琼脂糖凝
胶电泳鉴定，并将回收的质粒和 PCR 产物放于-20℃
保存。
连接使用 TOYOBO 连接试剂盒，总体系 10 μl，
其中预混合连接试剂 Ligation high 5 μl、 质粒 0.5
μl、PCR 产物 4.5 μl，16℃连接过夜。 次日将连接产
物加入到 100 μl 的 DH5α 感受态细胞 ， 冰浴 30
min，42℃水浴激活 60~90 s， 然后快速将管移到冰
浴中， 使细胞冷却 2~3 min， 向离心管中加 500 μl
无抗性 LB 培养基 ， 混匀后 37℃摇床震荡培养 45
min（150 r/min），将离心管内容物混匀。 吸取已转化
的感受态细胞到含卡那霉素抗性的 LB 固体培养
板，涂匀，放半小时后倒置，37℃培养 16 h。
崔涛等：新基因 PRR11的克隆、原核表达及鉴定 99
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2009年第 3期
挑取含卡那霉素抗性的 LB 固体培养板上的克
隆， 接种于 5 ml 含卡那抗性 LB 液体培养基中，过
夜培养后提取质粒。 双酶切初步鉴定为阳性克隆
后，送上海生工生物技术公司测序。 然后提取重组
质粒转化 BL21 菌中进行表达。
1.2.4 PRR11 重组蛋白的诱导表达和鉴定 将含
重组质粒的 E.coli BL21 接种于含卡那抗性的 LB
培养基中，37℃过夜培养。 次日，将培养物按 1∶100
的比例接种至 20 ml LB 培养基中， 培养至对数生
长中期，OD 值为 0.6~0.8， 加入 IPTG (终浓度为 1
mmol/L)，于 37 ℃进行诱导。 诱导后每小时取菌液
1 ml，共取 6 次。 离心收集菌体沉淀 ，加入 1×SDS-
PAGE 凝胶加样缓冲液 200 μl，混匀，沸水浴 10 min
后 ， 用 12% SDS-PAGE 电泳检测目的蛋白 PRR11
的表达情况。
经 IPTG 诱导的表达产物 SDS-PAGE 分离后电
转移至 PVDF 膜上，用含 5%脱脂奶粉的 TBST 溶液
4 ℃封闭过夜，PRR11 抗体（1∶1 500 稀释，由北京奥
维亚公司制备） 室温孵育 2 h，TBST 洗 3 次， 每次
10 min，HRP 标记的羊抗兔 IgG(1 ∶2 000 稀释 ) 室温
孵育 2 h，TBST 再洗 3 次，每次 10 min，然后用 ECL
显色观察结果。
2 结果
2.1 RT-PCR 扩增 PRR11 基因
收集正常传代的 Hela 细胞，制备总 RNA，进一
步反转录为 cDNA 模板，采用特异性的上下游引物
扩增 PRR11 基因的开放阅读框区。 如图 1 所示，琼
脂糖凝胶电泳图谱显示 ，PCR 产物片段大小约为
1 100 bp，与预期片段大小相符。
2.2 PET-28a-PRR11 重组表达载体的构建与鉴定
PCR 产物经凝胶纯化回收后，和 PET-28a 质粒
同时进行 Nco I 和 Not I 双酶切，酶切产物纯化回收
后进行连接、转化，从而将 PRR11 开放阅读框区定
向克隆入 PET-28a 载体，重组载体命名为 PET-28a-
PRR11（图 2）。将重组质粒 PET-28a-PRR11 用 Nco I
和 Not I 进行双酶切后，1%琼脂糖电泳图谱显示一
1 100 bp 左右的 DNA 条带， 与插入片段大小相符
（图 3）。 进一步的测序结果表明，插入片段的核苷
酸序列与 GenBank 公布的 PRR11 参考序列完全相
同，表明重组质粒构建成功。
2.3 PRR11 重组蛋白的诱导表达
将 PET-28a-PRR11 重组质粒转化 E.coli BL21，
并筛选鉴定阳性菌株。将含 PET-28a-PRR11 重组质
粒的大肠杆菌 BL21 阳性菌株涂板， 挑取 4 个单克
隆 ， 制备菌液裂解液 ，SDS-PAGE 观察不同单克隆
中 PRR11 重组蛋白的诱导表达情况。 SDS-PAGE 结
果表明，2 号和 4 号克隆中 PRR11 重组蛋白的表达
量较高， 分子量大小约为 40 kD， 和预期分子量大
小一致（图 4）。
将表达较好的菌液进行条件优化， 加入 IPTG
后分别诱导 3、4、5 和 6 h，观察 PRR11 重组蛋白的
表达量随诱导时间不同的变化。结果发现在诱导 4
bp
1 2
2 000
1 000
750
500
250
100
1.DL2000 DNA 分子量标准；2.PRR11 基因 PCR 条带
图 1 PRR11 基因的 PCR 结果
图 2 PET-28a-PRR11 重组质粒图谱
M 1 2bp
5 000
3 000
2 000
1 000
M.1 kb DNA Ladder；1，2.PET-28a-PRR11 重组质粒 Nco I 和
Not I 双酶切
图 3 重组质粒的双酶切鉴定
T7 promoter
100
2009年第 3期
h 后 PRR11 重组蛋白表达量最大。 同时将诱导 6 h
后的菌液超声处理，分为上清与沉淀两部分，结果
表明，PRR11 重组蛋白以包涵体形式存在（图 5）。
2.4 PRR11 重组蛋白的鉴定
为了进一步对 PRR11 重组蛋白产物进行鉴定
确认， 根据 PRR11 的编码氨基酸序列设计合成了
相应的抗原表位多肽，并制备了相应的兔源多克隆
抗体。 使用该抗体进行蛋白质免疫印迹分析，结果
发现， 与不含重组质粒的 BL21 菌液和含重组质粒
但未经 IPTG 诱导的 BL21 菌液相比，含重组质粒并
经 IPTG 诱导后的 BL21 菌液在 40 kD 左右能检测
到明显的蛋白条带， 和上述 SDS-PAGE 结果一致，
表明该蛋白产物确实为 PRR11 重组蛋白（图 6）。
3 讨论
通过同源 EST 拼接和全长 cDNA 克隆等方法
发现，PRR11 基因具有多个 mRNA 转录本 （待发表
数据），长度约为 1 300 bp，其中的多个 mRNA 转录
本均包含一长度为 1 083 bp 的开放阅读框， 预测编
码产物由 360个氨基酸构成，预测分子量为 40 kD[5，6]。
在本研究中， 重点构建了 PRR11 基因原核表
达重组载体，并对其在大肠杆菌中的表达进行了表
达检测与鉴定。在对 PRR11 基因进行 RT-PCR 扩增
时发现，正常组织中 PRR11 基因的表达水平很低，
而在肿瘤细胞如 Hela 细胞系中该基因的表达水平
则较高， 故能够以 Hela 细胞 cDNA 为模板有效扩
增到 PRR11 基因。同时，通过对扩增到的 Hela 细胞
中 PRR11 基因的开放阅读框序列进行分析， 也并
没有发现有碱基突变情况存在，因此猜测该基因在
肿瘤发生发展中的作用很可能是通过表达失调而
介导的。
此外，不同的重组单克隆菌种重组蛋白的表达
差异较大。 经过对诱导时间的优化，诱导 4 h 左右
重组蛋白表达量最大。 而 IPTG 浓度对蛋白表达量
无明显影响。
在构建原核表达载体的同时，也构建了多种真
核表达载体， 通过检测发现 PRR11 在真核表达系
统中的表达水平也不是很高 （数据略）。 由此猜测
PRR11 蛋白可能属于半衰期较短的蛋白 、 或者
PRR11 的外源表达易遭受细胞内蛋白质酶的分解。
对于其相应的分子机制，目前还在研究之中。
总之， 本研究成功构建的 PRR11 基因的原核
重组表达载体，并对其在大肠杆菌中的表达进行了
鉴定与检测，这为进一步纯化 PRR11 重组蛋白 、制
备抗体， 全面和系统研究 PRR11 基因的功能尤其
是在肿瘤发生发展中的作用奠定了良好的基础。
参考文献
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M 1 2 3 4 5kD
72
55
43
34
目的蛋白
M.蛋白分子量标准；1.对照 E.coliBL21；2.1 号单克隆中目的蛋
白的表达 ；3.2 号单克隆中目的蛋白的表达 ：4.3 号单克隆中
目的蛋白的表达；5.4 号单克隆中目的蛋白的表达
图 4 单克隆中目的蛋白的诱导表达情况
M 1 2 3 4 5 6 7kD
72
55
43 目的蛋白
M.蛋白分子量标准 ；1.对照 E.coliBL21；2.IPTG 诱导 3h；3.
IPTG 诱导 4 h；4.IPTG 诱导 5 h；5.IPTG 诱导 6 h；6.诱导 6
h 后上清 ；7.诱导 6 h 后沉淀
图 5 随诱导时间变化目的蛋白的表达情况
1 2 3
1.不含质粒的 E.coliBL21 菌液蛋白 ；2.含重组质粒未经 IPTG 诱导的
E.coliBL21 菌液蛋白 ；3.含重组质粒经 IPTG 诱导的 E.coliBL21 菌液蛋白
图 6 PRR11 重组蛋白的鉴定
（下转第 105页）
崔涛等：新基因 PRR11的克隆、原核表达及鉴定 101
2009年第 3期
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
（上接第 101页）
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pET32a（+）为载体质粒。 重组蛋白可以通过暴露的
标签结合固化的 Ni+树脂， 用适当缓冲液洗除去未
结合蛋白包括大肠杆菌的 GAPDH， 再用可溶的竞
争性螯合剂洗脱回收 His-GAPDH，从而得到较纯的
人源性的 GAPDH。SDS-PAGE 电泳后考马斯亮蓝染
色结果显示存在少量杂蛋白，主要由于大肠杆菌中
存在相似 His-6 的蛋白，也能够部分结合 Ni+树脂。
但经冻融后的蛋白用抗 His 标签的抗体进行 Western
blotting 检测却没有杂带的出现， 说明本试验表达
的目的蛋白具有较好的稳定性。 而且 His-6 的蛋白
标签总分子质量仅约 1 kD，对表达的 GAPDH 蛋白
空间构象结构影响较小，从而确保了表达目的蛋白
的可靠性 。 用抗 GAPDH 的抗体进行 Western blot-
ting 显示 ，提取的目的蛋白不仅表达量高 ，而且具
有很好的抗原性， 可用于 GAPDH 作用机制的进一
步研究。
试验成功地构建了 pET32a（+）-GAPDH 原核表
达重组质粒，在体外得以表达和纯化，并且 Western
blotting 方法验证了靶蛋白 GAPDH 有较高的表达
量以及较好的抗原性， 为今后 GAPDH 的功能研究
提供了原料。
参考文献
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