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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 8 期
两个大豆 MYB转录因子在原核细胞中的高效表达
李晓薇1 苏连泰1 赵旭2 翟莹1 张海军1 张庆林1 李景文1 王庆钰1
(1吉林大学植物科学学院，长春 130062;2吉林省产品质量监督检验院，长春 130022)
摘 要: 大豆(Glycine max)GmMYB12a与 GmMYB12B2 基因属于典型的植物 R2R3-MYB转录因子。为进一步研究两个
MYB12 转录因子与相应顺式作用元件的相互作用，构建了两基因的原核表达载体，并在大肠杆菌 Rosetta(DE3)中实现高效表
达。利用 PCR技术，将两端带有特异酶切位点的 GmMYB12a 与 GmMYB12B2 全长基因亚克隆于原核表达载体 pET-28a(+) ，
酶切、测序鉴定确认获得两基因的重组原核表达载体 pET-28a-GmMYB12a 与 pET-28a-GmMYB12B2。然后把重组载体转化到
大肠杆菌 Rosetta(DE3)中，经 IPTG诱导蛋白表达，提取细胞蛋白并采用 SDS-PAGE 检测目的蛋白的表达情况。结果表明，成
功构建了两基因的原核表达载体，在 IPTG浓度为 1. 2 mmol /L，诱导 6 h后，目的蛋白能在 Rosetta(DE3)中高效表达。
关键词: 大豆 MYB转录因子 载体构建 pET-28a(+) Rosetta(DE3) 原核表达
High Expression of Two Soybean MYB Transcription
Factor in Escherichia coli
Li Xiaowei1 Su Liantai1 Zhao Xu2 Zhai Ying1 Zhang Haijun1 Zhang Qinglin1 Li Jingwen1 Wang Qingyu1
(1College of Plant Science，Jilin University，Changchun 130062;2Jilin Province Institute of
Product Quality Supervision and Inspection，Changchun 130022)
Abstract: Soybean(Glycine max)GmMYB12a and GmMYB12B2 are the typical plant R2R3-MYB transcription factors． For the
further study of these two MYB12 transcription factors and their interactions between corresponding cis-regulatory elements，prokaryotic
expression vectors of these two genes were constructed and achieved highly efficient expression in Escherichia coli Rosetta(DE3) ，re-
spectively． Full length of the two genes，GmMYB12a and GmMYB12B2，with specific restriction sites of both ends were subcloned in
the prokaryotic expression vector pET-28a(+)using PCR，restriction analysis and DNA sequencing confirmed that the two recombinant
prokaryotic expression vectors pET-28a-GmMYB12a and pET-28a-GmMYB12B2 were gained． Then the recombinant vectors were trans-
formed into E． coli Rosetta(DE3) ，extracting cell proteins after induction by IPTG and tested expression of destined proteins using SDS-
PAGE． The results showed that prokaryotic expression vectors of these two genes were successfully constructed，and after 6 h induction
at the IPTG concentration of 1. 2 mmol /L，target proteins could be highly expressed in E． coli Rosetta(DE3)．
Key words: Soybean MYB transcription factor Construction of expression vector pET-28a(+) Rosetta(DE3) Prokaryotic expression
收稿日期:2011-01-30
基金项目:转基因生物新品种培育重大专项子课题(2008ZX08004-003) ，国家自然科学基金面上项目(30971808) ，吉林省科技发展计划重点项
目(20080204) ，长春市科技局国际科技合作项目(08GH10) ，“211”三期建设项目
作者简介:李晓薇，女，博士研究生，研究方向:植物种质资源的研究与利用;E-mail:plnto2009@ yahoo． cn
通讯作者:王庆钰，女，教授，博士生导师，E-mail:wqy414cn@ yahoo． com． cn;李景文，男，讲师，E-mail:ljwk9@ 163． com． cn
转录因子通常是一种模块化的蛋白，一般由几个
独立的功能域组成，包括 DNA结合功能域、转录激活
功能域、蛋白 －蛋白相互作用功能域、信号分子结合
功能域、核定位信号区等。根据 DNA结合功能域的结
构，转录因子可分为以下几类:bHLH(碱性螺旋―环―
螺旋)、bZIP(碱性亮氨酸拉链)、MADS-box 蛋白、zinc-
finger蛋白、MYB蛋白、Ap2/EREBP蛋白等［1］。
MYB蛋白是植物中数量最多，功能最多样化的
一类转录因子，参与植物次生代谢调控、激素和环境
因子的应答，并对细胞分化、细胞周期以及植物叶片
等器官的形态建成具有重要的调节作用［2 － 8］。MYB
转录因子基因都具有高度保守的 DNA 结合域 －
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 8 期
MYB结构域。每个 MYB 结构域约含有 50 － 53 个
氨基酸，其中有 3 个保守的色氨酸残基，其间隔 18
－ 19 个氨基酸，是疏水核心的重要成分，对于维持
螺旋―转角―螺旋(Helix-Turn-Helix，HTH)的构型
起着重要的作用［9］。根据所含 MYB 结构域的数
目，植物中的 MYB类转录因子可分为 3 个亚类:单
一 MYB结构域蛋白、两个重复 MYB 结构域蛋白和
3 个重复 MYB结构域蛋白［10］。
大豆 MYB12 转录因子 GmMYB12a 与 Gm-
MYB12B2 属于典型的植物 R2R3-MYB 转录因子，
推测它们与植物类黄酮的代谢及抗逆性有关，对两
个 MYB12 功能的多方位研究正在开展。目前在国
内外尚没有这两个转录因子生物学功能的任何
报道。
本研究构建了两基因的原核表达载体，并对它
们在大肠杆菌 Rosetta(DE3)中的表达条件进行优
化，采用 SDS-PAGE检测融合蛋白的表达情况，为进
一步纯化 GmMYB12a与 GmMYB12B2 重组蛋白、分
析其与顺式元件的相互作用，全面和系统研究两基
因的功能奠定良好的基础。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 菌株及质粒 大肠杆菌菌株(E. coli)DH5α、
Rosetta(DE3)、分别携带 GmMYB12a 与 GmMYB12B2
的克隆载体 pMD18-T-GmMYB12a 与 pMD18-T-Gm-
MYB12B2由吉林大学植物科学学院植物种质资源与
利用研究室(下称植物种质资源研究室)提供，质粒
pET-28a(+)购自 TaKaRa公司。
1. 1. 2 工具酶及试剂 限制性内切酶 Nde I、EcoR
I、Taq DNA 聚合酶、T4 DNA 连接酶、DL2000
TMDNA
Marker、蛋白质低分子量标准均购自 TaKaRa 公司;
DNA纯化回收试剂盒、质粒 DNA 提取试剂盒购自
爱思进生物技术有限公司;其它生化试剂均为国产
分析纯。
1. 2 方法
1. 2. 1 引物设计与合成 根据 GenBank公布的 Gm-
MYB12a(AB510903)核苷酸序列及植物种质资源研究
室克隆的 GmMYB12B2 基因序列，分别设计引物。引物
序列如下:GmMYB12a-F:5-GCGCATATGATGGAGAGAAG-
TA-3(Nde I)，GmMYB12a-R:5-CGAGAATTCTCAGAA-
CAAGTCATG-3(EcoR I) ;GmMYB12B2-F:5-CGA-
CATATGATGGAGAGGAGTTT-3(Nde I)，GmMYB12B2-
R:5-CAGGAATTCTCACGACAAGTCA-3(EcoR I)。引
物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。
1. 2. 2 原核表达载体 pET-28a-GmMYB12a/GmMYB12B2
的构建 应用 PCR方法以质粒 pMD18-T-GmMYB12a
和 pMD18-T-GmMYB12B2 为模板，分别扩增 Gm-
MYB12a和 GmMYB12B2 基因。PCR 扩增程序:94℃
预变性 5 min;94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，30 个
循环;72℃延伸 10 min。琼脂糖凝胶电泳鉴定。
将扩增产物经 DNA纯化回收试剂盒纯化后，用
Nde I和 EcoR I双酶切，回收纯化后，与同样用 Nde I
和 EcoR I双酶切的 pET-28a(+)载体连接，构建成原
核表达载体 pET-28a-GmMYB12a 与 pET-28a-Gm-
MYB12B2。重组载体转化大肠杆菌(E． coli)DH5α，
提取质粒，经 Nde I和 EcoR I双酶切鉴定正确后，送
北京六合华大基因科技股份有限公司测序验证。
1. 2. 3 融合蛋白表达条件的优化 将测序正确的表
达质粒 pET-28a-GmMYB12a、pET-28a-GmMYB12B2
及空载体 pET-28a(+)分别转化大肠杆菌感受态
Rosetta(DE3)中，挑取阳性菌落接种于5 mL LB 培
养基中(含 50 μg /mL 卡那霉素和15 μg /mL氯霉
素) ，37℃振荡培养过夜，然后按 1% 分别接种于
10 mL LB 培养基中(含 50 μg /mL 卡那霉素和
15 μg /mL 氯霉素) ，37℃振荡培养至 A600≈0. 6，分
两组在不同时间和不同 IPTG 浓度条件下进行诱
导，同时以未诱导的重组菌及空载体 pET-28a(+)的
诱导菌作阴性对照。
1. 2. 4 GmMYB12a与 GmMYB12B2基因在原核中的
表达 将测序正确的表达质粒 pET-28a-GmMYB12a、
pET-28a-GmMYB12B2及空载体 pET-28a(+)分别转
化大肠杆菌感受态 Rosetta(DE3)中，挑取阳性菌落
接种于 5 mL LB 培养基中(含 50 μg /mL 卡那霉素
和 15 μg /mL 氯霉素) ，37℃ 振荡培养过夜，然后按
1%分别接种于 10 mL LB 培养基中(含 50 μg /mL
卡那霉素和 15 μg /mL 氯霉素) ，37℃振荡培养至
A600≈0. 6，添加 IPTG，使其终浓度为 1. 2 mmol /L，
诱导 6 h 后，收集细菌，取 1 mL 诱导表达前后的细
菌，进行 15% SDS-PAGE分析。
001
2011 年第 8 期 李晓薇等:两个大豆 MYB转录因子在原核细胞中的高效表达
2 结果与分析
2. 1 原核表达载体 pET-28a-GmMYB12a/GmMYB12B2
的构建与鉴定
PCR产物经凝胶纯化回收后，和 pET-28a(+)质
粒同时进行 Nde I 和 EcoR I 双酶切，酶切产物纯化
回收后进行连接、转化，从而将 GmMYB12a 和 Gm-
MYB12B2 基因全长定向克隆入 pET-28a(+)载体，
重组载体命名为 pET-28a-GmMYB12a 及 pET-28a-
GmMYB12B2(图 1)。将重组质粒用 Nde I和 EcoR I
进行双酶切后，1%琼脂糖电泳图谱显示 714 bp 及
783 bp左右的 DNA条带，与插入片段大小相符(图
2)。进一步的测序结果表明，插入片段的核苷酸序
列未发生碱基突变，表明重组质粒构建成功。
图 1 pET-28a-GmMYB12a /GmMYB12B2
重组质粒图谱
M． DNA Marker(DL2000) ;1，2． pET-28a-GmMYB12a重组质
粒双酶切;3，4． pET-28a-GmMYB12B2 重组质粒双酶切
图 2 重组质粒 Nde I和 EcoR I双酶切鉴定
2. 2 融合蛋白表达条件的优化
分别以 0. 6、0. 8、1. 0 和 1. 2 mmol /L 浓度的
IPTG诱导重组菌，37℃振荡培养，于培养的 1、2、4
和 6 h取 1 mL 样品，以未诱导的重组菌及空载体
pET-28a(+)的诱导菌作阴性对照，进行 15% SDS-
PAGE分析，发现重组菌经 IPTG诱导后有融合蛋白
的高效表达，目的蛋白约为 29 kD(GmMYB12a 蛋
白)和 31 kD(GmMYB12B2 蛋白) ，结果见图 3 和
图 4。
M．蛋白质低分子量标准;1，7． pET-28a(+)诱导菌对照;2，
12． pET-28a-GmMYB12a 未诱导菌对照;3 － 6. 0. 6、0. 8、
1. 0、1. 2 mmol /L浓度的 IPTG诱导重组菌;8 －11. IPTG浓
度为 1 mmol /L时，诱导 6、4、2和 1 h的重组菌
图 3 不同 IPTG浓度及不同诱导时间下 GmMYB12a
蛋白的 SDS-PAGE电泳结果
M．蛋白质低分子量标准;1，11． pET-28a(+)诱导菌对照;2，
12． pET-28a-GmMYB12B2未诱导菌对照;3 －6. 0. 6、0. 8、1. 0、
1. 2 mmol /L浓度的 IPTG诱导重组菌;7 －10. IPTG浓度为 1
mmol /L时，诱导6、4、2和 1 h的重组菌
图 4 不同 IPTG浓度及不同诱导时间下 GmMYB12B2
蛋白的 SDS-PAGE电泳结果
2. 3 GmMYB12a 与 GmMYB12B2 基因在原核中的
表达
优化结果表明，添加 IPTG终浓度为 1. 2 mmol /L，
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 8 期
诱导 6 h时，融合蛋白能在大肠杆菌 Rosetta(DE3)
中高效表达，见图 5 和图 6。
M．蛋白质低分子量标准;1． pET-28a(+)诱导菌对照;2．
pET-28a-GmMYB12a 未诱导菌对照;3． IPTG 浓度为
1. 2 mmol /L，诱导 6 h的重组菌
图 5 重组蛋白 GmMYB12a的 SDS-PAGE分析
M．蛋白质低分子量标准;1． pET-28a(+)诱导菌对照;2．
pET-28a-GmMYB12B2 未诱导菌对照;3． IPTG 浓度为
1. 2 mmol /L，诱导 6 h的重组菌
图 6 重组蛋白 GmMYB12B2 的 SDS-PAGE分析
3 讨论
影响外源基因在大肠杆菌中表达的因素有很
多，但是密码子的选用和 mRNA 的一、二级结构是
影响表达的重要因素。由于遗传密码子的简并性，
一个氨基酸会由多种密码子来编码。然而，大肠杆
菌对编码同一氨基酸的各种密码子使用频率并不相
同，甚至相差很大［1］。真核细胞偏爱的密码子和原
核系统有所不同，因此，在用原核系统表达真核基因
的时候，真核基因中的一些密码子对于原核细胞来
说可能是稀有密码子，从而导致表达效率和表达水
平很低［12］。GmMYB12a 及 GmMYB12B2 基因经
Rare codon Caltor分析，其中分别含有 29 个和 30 个
稀有密码子，占总密码子的 12. 18%及 11. 49%，这
很不利于两基因在大肠杆菌的表达。改造基因步骤
繁琐，因此我们选用 Rosetta(DE3)菌株，这种携带
pRARE2 质粒的 BL21 衍生菌，补充大肠杆菌缺乏的
7 种稀有密码子(AUA、AGG、AGA、CUA、CCC、GGA
及 CGG)对应的 tRNA，提高外源基因、尤其是真核
基因在原核系统中的表达水平，最终使 GmMYB12a
及 GmMYB12B2 基因在原核中高效表达得以实现。
寻找转录因子的 DNA 结合位点可以采用 PCR-
Assisted Binding-Site Selection技术［13，14］，也可通过染
色质免疫共沉淀的方法在体内鉴定转录因子直接调
控的下游基因［15］，这些方法都需要特异性很高的蛋
白或蛋白抗体。本研究中的重组蛋白能够在大肠杆
菌中高效表达，为进一步分离纯化 GmMYB12a与 Gm-
MYB12B2融合蛋白、分析其与顺式元件的相互作用、寻
找其调控的下游基因等功能的研究奠定良好基础。
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(责任编辑 马鑫
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