全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 5期
蛋白芯片载体表面修饰对探针固定影响的研究
王涛1 郭子瑜2 张瑞 3 聂利利 2 贾芸芳 2 邢克礼 1
( 1天津医科大学生物医学工程学院,天津 300070; 2南开大学信息技术科学学院,天津 300071;
3天津医科大学代谢病医院,天津 300070)
摘 要: 采用 3氨基丙基三甲氧基硅烷 ( ( 3am inopropy l) trim e thoxysilane, APTES)、戊二醛 ( g lu tara ldehyde, GA )、多聚L
赖氨酸 ( po lyLlysine, PLL)修饰芯片载体表面, 对 3种不同修饰方法制备的蛋白质芯片进行对比研究。将 Cy3标记羊抗鼠
IgG固定在修饰后片基上, 选择蛋白探针的固定率作为检测指标; 将小鼠 IgG作为探针固定在芯片上,靶蛋白为 Cy3标记羊抗
鼠 IgG, 通过生物芯片扫描仪检测反应后荧光强度, 选择蛋白探针的反应性作为检测指标,探讨制备蛋白质芯片较佳的表面修
饰方法。结果显示, 戊二醛修饰玻片对蛋白固定较好, 有较高的反应活性,检测限较宽, 但背景噪声较高。
关键词: 蛋白质微阵列 表面修饰 固定率 反应性
Effect of SurfaceM odification for ProteinM icroarray on
Immobilizing Protein Probe
W ang T ao
1
Guo Z iyu
2
Zhang Rui
3
N ie L ili
2
J ia Yunfang
2
X ing Keli
1
(
1
School of B iomedical Engineering, T ianjinM edical University, T ianjin 300070;
2
College of Information T echnical Science,N ankai University, T ianjin 300071;
3
T ianjin M edical UniversityM etabolic D iseasesH osp ital, T ianjin 300070)
Abstrac:t G lass slides w erem odified w ith( 3am inopropy l) trim ethoxys ilane, g luta ra ldehyde, po lyLlysine to prepare prote in m i
croarrays. The optim a l surfacem od ification m ethods w ere evalua te and chosen fo r the preparation o f prote in m icroarray. The imm ob ilizing
prote ins w ere labe led by Cy3, and attachm ent ratew as evalua ted. Then, themouse IgG w ere prin ted on themod ified g lass slides, the ta r
ge t prote ins w ere labe led by Cy3, and responsive activ ity of prote in on m icroarrays w ere eva luated. The efficiency and the effec ts of im
m ob ilized pro teins on the g lass were com pared. The result show ed that the a ldehydemod ification y ie lds high backg round, but have a larg
detection lim it, and the reac tive activ ity o f the imm ob ilized pro te ins demonstrated superior.
Key words: P rote in m icroarrays Surfacem odifica tion A ttachm ent rate Responsive ac tiv ity
收稿日期: 20100113
基金项目:国家自然科学基金 ( 60602002 ),天津市自然科学基金 ( 08 JCZD JC21700 )
作者简介:王涛,男,硕士研究生,研究方向:生物芯片的载体表面修饰; Em ai:l w angtao126_t@j 126. com
通讯作者:贾芸芳, Em ai:l jiayun fang@ yahoo. com. cn;邢克礼, Em ai:l t jxingkel@i 126. com
蛋白质芯片是在基因芯片技术的基础上发展起
来的以蛋白质为研究对象的一项新技术, 蛋白质和
抗体微阵列已经作为一种有力的研究工具 [ 1] , 蛋白
质与 DNA相比, 其化学成分、结构和功能更为复杂
多变, 固定在芯片载体表面的蛋白质容易失活 [ 2 ]。
因此, 寻找合适的载体和表面修饰方法以便在芯片
表面最大程度地固定蛋白质并保持生物活性成为研
究蛋白质芯片的关键步骤之一 [ 2 ]。
由于玻璃片具有表面光滑、荧光背景低、性能稳
定等诸多优点, 已经成为基因芯片最常用的载
体 [ 3]。目前, 玻片也广泛应用于蛋白质芯片的制
作。要使蛋白探针固定在玻片载体表面,必须先对
玻片表面进行物理、化学修饰,引入活性基团使玻片
表面可以和蛋白质的某些基团结合, 从而使蛋白质
固定在其表面 [ 4]。玻片表面的修饰方法有很
多 [ 2, 5, 6] , 但较常用的有氨基修饰、戊二醛修饰和多
聚L赖氨酸修饰法。 3种修饰方法制备蛋白质芯片
的效果文献评价不一 [ 2, 6, 7, 10] , 该研究在参考文献的
2010年第 5期 王涛等:蛋白芯片载体表面修饰对探针固定影响的研究
基础上,采用芯片上蛋白质的固定效率和反应活性
指标,分别对 3种修饰方法制备的蛋白质芯片的优
缺点进行客观评价, 探索出在一种较佳的芯片表面
修饰方法,为后期蛋白芯片的制备提供有价值的参
考依据。
1 材料与方法
11 试剂与仪器
主要试剂: 3氨基丙基三甲氧基硅烷 ( APTES)
( Sigma公司,美国 ) ; 牛血清白蛋白 ( BSA )、多聚 L
赖氨酸 (北京中杉金桥 ); 纯化鼠 IgG; Cy3标记羊抗
鼠 IgG( Abcam公司,美国 ); 戊二醛、无水乙醇、丙酮
等其他试剂为市售分析纯。主要仪器: ScanA rray
Gx生物芯片扫描仪 ( PerkinE lmer公司, 美国 ); M illi
Q超纯水系统 (M illipo re公司, 美国 ) ;小型轨道摇床
( Thermo Scientific公司, 美国 ); 高速冷冻离心机
( Eppendo rf公司, 德国 ); 恒温箱 ( LABTECH 公司,
韩国 ); 超声清洗机 ( BRANSON公司,美国 )。
12 氨基修饰
玻片放入由 1 /3过氧化氢和 2 /3浓硫酸组成的
溶液中,清洗 1 h。将玻片置于去离子水中, 超声刷
洗 5 m in。清洗好的玻片浸入 APTES活化试剂 (丙
酮稀释 )中 20 m in后取出, 玻片用丙酮、去离子水冲
洗, 120 C下烘干,至于干燥处保存。
13 戊二醛修饰
将氨基化完成的玻片放入含 5% 戊二醛 ( PBS
缓冲稀释 )溶液中 ( pH74)中,在室温下浸泡 2 h,取
出用 PBS、去离子水冲洗, 烘干后,至于干燥处保存。
14 多聚L赖氨酸修饰
配置清洗液,将玻片浸泡在清洗液中,加盖清洗
2 h。将玻片置于去离子水中, 超声刷洗 5 m in。将
玻片浸入 10% PLL溶液中, 振荡 1 h。取出后, 用去
离子水冲洗,烘干后, 至于干燥处保存。
15 用于蛋白质固定效率对比的蛋白质芯片的
制备
将 Cy3标记的羊抗鼠 IgG用含 40%甘油的 PBS
溶液稀释成浓度为 10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、01 g /
mL。取 3种方法修饰后玻片, 按上述浓度点样, 每
一浓度点样一行,重复 3点, 第四列为阴性对照,形
成 11 ! 4的阵列。将玻片放在湿盒中, 4∀ 过夜。用
ScanA rray Gx生物芯片扫描仪获取图像 (图 1a)。
取出玻片, 用 1% BSA进行封闭。封闭结束后, 用
PBST、PBS多次清洗, 42∀ 烘箱烘干,再用 ScanA rray
Gx生物芯片扫描仪获取荧光图像 (图 1b)。
A.多聚 L赖氨酸修饰玻片; B.氨基硅烷试剂修饰玻片;
C.戊二醛修饰玻片
图 1 固定在三种方法修饰玻璃片基上
不同浓度蛋白质洗脱前后荧光图像
16 用于蛋白质反应活性对比的蛋白质芯片的
制备
鼠 IgG纯化时,使用辛酸硫酸铵法纯化免疫后
小鼠腹水,获得高纯度鼠 IgG。使用 BCA蛋白定量
试剂盒对获得的鼠 IgG浓度进行测量。经过与标准
曲线比较,浓度为 19 mg /mL。用含有 40%甘油的
PBS将上述纯化的鼠 IgG稀释为终浓度为 10 g /
mL。取 3种方法修饰后玻片, 点样稀释好的鼠 IgG
在玻片上,形成 11 ! 3的阵列。点样完成后, 将玻片
放在湿盒中, 4∀ 过夜。用 1% BSA对玻片进行封
闭, 37∀ , 1 h。封闭结束后, 用 PBST、PBS多次清
洗, 42∀ 烘箱烘干。
将 Cy3标记的羊抗鼠 IgG用含 40% 甘油的
PBS溶液稀释成浓度为 10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、
01 g /mL。将稀释后 Cy3标记羊抗鼠 IgG与芯
117
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 5期
片上探针 (鼠 IgG )反应, 为 11 ! 3阵列。 37∀ ,
1 h。取出后,用 PBST、PBS多次清洗, 42∀ 烘箱烘
干。再用 ScanA rray Gx生物芯片扫描仪获取荧光
图像 (图 2)。
A.多聚L赖氨酸修饰玻片; B.氨基硅烷试剂修饰玻片;
C.戊二醛修饰玻片
图 2 固定在三种方法修饰玻璃片基上
蛋白质反应后荧光图像
2 结果与分析
21 蛋白质在不同修饰玻片上固定效率的比较
在氨基、戊二醛和多聚L赖氨酸修饰的玻片表
面上, 直接点上 Cy3标记的羊抗鼠 IgG,经生物芯片
扫描仪扫描, 获得荧光信号强度; 用洗液清洗后扫
描,获得洗脱后的荧光信号强度。
固定效率 (% ) = 洗脱后荧光强度洗脱前荧光强度 ! 100%
从图 3中可看出戊二醛修饰的芯片载体对蛋
白质的固定率明显高于多聚赖氨酸和氨基修饰后
的玻片对蛋白质的固定率。说明在该试验条件
下, 戊二醛修饰的芯片载体对蛋白质的固定能力
较强。
22 不同修饰玻片上蛋白质的反应性比较
在玻片上固定的蛋白质探针反应活性越强,则
参与反应的带荧光标记的靶蛋白越多, 所获取的荧
光信号强度越高 [ 7]。从图 2、图 4可看出, 在 Cy3标
记羊抗鼠 IgG的浓度大于 5 g /mL时, 3种修饰方
法对固定的蛋白质反应活性区别不大。在 Cy3标记
羊抗鼠 IgG的浓度小于 5 g /mL时,戊二醛修饰后
的玻片固定的蛋白质反应性高于多聚L赖氨酸和
氨基修饰后的玻片。但是, 通过图 1, 图 2可看出,
戊二醛修饰后玻片的背景噪声较其它两种修饰方法
要大。
A.多聚 L赖氨酸修饰玻片; B.氨基硅烷试剂修饰玻片;
C.戊二醛修饰玻片
图 3 三种方法修饰玻璃片基不同浓度蛋白质
洗脱前后荧光强度曲线
图 4 固定在三种方法修饰玻璃片基上
蛋白质反应后荧光强度曲线
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2010年第 5期 王涛等:蛋白芯片载体表面修饰对探针固定影响的研究
23 不同方法修饰玻片荧光强度变异系数比较
玻片上固定的探针鼠 IgG与靶蛋白 Cy3标记的
羊抗鼠 IgG反应, 扫描获得荧光信号,经 SPSS 150
处理后,获得均数和标准差,计算出变异系数 [ 7] (表
1)。变异系数理想范围为 5% - 15% [ 7] , 结果显示
三者平均值均在理想范围内。
变异系数 = 标准差均数 ! 100%
表 1 三种方法修饰载体表面后变异系数比较
靶蛋白浓度 )
( g/mL)
荧光强度变异系数 (% )
多聚 L赖氨酸 氨基硅烷试剂 戊二醛
10 2588 3264 5860
9 7662 4615 6117
8 3174 10248 2479
7 10595 11004 16006
6 6239 7615 20261
5 8151 14807 5839
4 8112 15192 2383
3 9515 6922 7688
平均值 7004 9208 8329
24 结论
上述研究用 3种方法修饰玻璃片基, 对修饰后
载体上蛋白质固定率、反应性及荧光信号变异性进
行了综合评价,戊二醛修饰的蛋白芯片载体在蛋白
固定率和反应性上优于多聚L赖氨酸和氨基硅烷
试剂修饰的芯片载体,为合适的芯片载体修饰方法。
3 讨论
近年来, 蛋白芯片技术在肿瘤研究及蛋白质组
学研究方面受到重视 [ 5, 8, 9]。在蛋白质芯片的制备
过程中,如何通过介质表面化学修饰以利于固定探
针和靶标的结合,成为蛋白质芯片制备过程中不断
探索和完善的一个重要方面。
在进行氨基修饰玻片时,玻璃表面羟基的孤电
子对作为亲核试剂,进攻 3氨基丙基 三甲氧基硅烷
中电正性的硅原子,并放出甲醇,在羟基和硅原子之
间形成共价键,形成了具有反应活性的氨基基团表
面 [ 11]。氨基化芯片表面的正电荷可以固定带负电
荷的生物分子。固定主要是通过氨基的正电荷和蛋
白质等生物分子的负电荷之间的静电相互作用进行
的 [ 12] (图 5A )。
A.氨基硅烷试剂修饰玻片; B. 戊二醛修饰玻片; C.多
聚 L赖氨酸修饰玻片
图 5 三种方法修饰玻片结构示意图
进行醛基修饰时,其表面的制备与氨基化表面的
制备相似,均使用硅烷化试剂在芯片表面的硅原子和
有机反应基团之间形成共价键,通过双功能基团试剂
戊二醛在其末端形成一个反应活性醛基。作为探针
的蛋白质上的氨基氮原子的孤对电子作为亲核试剂
进攻电正性的醛基碳原子 (图 5B )。脱水反应在蛋
白质和微阵列芯片表面之间形成亚胺共价键 (希夫
碱 ) [ 12]。因为在醛基化表面的固定是一个共价键形
成过程,在这个表面上的固定又称为共价耦合。
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 5期
有文献显示,多聚赖氨酸修饰芯片的蛋白固定率
高于戊二醛修饰的芯片 [ 7, 13]。多聚赖氨酸同时具有羧
基和氨基两个活性基团,蛋白质可以和多聚L赖氨酸
上的两个活性基团发生反应,因而蛋白质的固定率
高 [ 14]。在上述研究中, 并未发现其固定率高于另外两
种方法,分析原因为多聚L赖氨酸与玻片为单点位结
合,使多聚L赖氨酸结合蛋白质后形成的复合物在多
次清洗过程中被洗脱,导致固定率较低 (图 5C)。
非共价键的吸附具有高吸附容量,较好地保持
蛋白质的空间结构,较低的非特异性吸附等优点,但
是非共价吸附无法控制蛋白质吸附的数量及方向
性,因而芯片的反应效率、准确性及重现性等方面受
到影响 [ 15]。共价键的结合是在载体表面衍生活泼
的化学基团,用共价反应将抗体固定在芯片载体表
面,具有固定牢固,重现性好等特点 [ 16 ]。
参 考 文 献
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