全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 8期
土壤中脂肪酶产生菌的筛选、鉴定及脂肪酶基因的克隆
玄国营　陈芳　李予霞　高剑峰
(石河子大学生命科学学院 ,石河子 832003)
　　摘 　要 : 　以橄榄油为惟一碳源进行富集培养、以罗丹明 B为指示剂的平板进行初筛 ,摇瓶复筛得到产脂肪酶菌株 ;利用
滴定法、平板扩散法以及转酯反应试验 ,最终筛选出具有较高转酯活性脂肪酶的菌株 B2。通过对 B2进行形态学观察 ,生理生
化测定以及 16S rDNA特征片段比较分析 ,初步确定 B2为克雷伯氏菌属 ( Klebsiella sp. )。通过特定引物 PCR扩增得到 B2菌
株两个脂肪酶基因 K1和 K2。利用丙酮法和 (NH) 2 SO4 沉降法得到 B2菌株体内的胞内酶 ,以叔丁醇为溶剂 ,催化棉籽油与甲
醇反应 ,经过薄层层析和高效液相检测产物为生物柴油。
关键词 : 　生物柴油 　克雷伯氏菌 　脂肪酶 　脂肪酶基因
The Screen ing, Identif ication and L ipase Gene
Clon ing of Soil L ipase Produc ing Stra in
Xuan Guoying　Chen Fang　L i Yuxia　Gao J ianfeng　
( College of L ife Science of Shihezi University, Shihezi 832003)
　　Abs trac t: 　U sing olive oil as sole carbon source in enrichment culture, and Rhodam ine B as indicator to screening, one lipase2
p roducing strain B2 with higher lipase activity were screened. B2 strain was identified as Klebsiella sp. according to morphological ob2
servation, determ ination of physiological and biochem ical. The part 16S rDNA was amp lified by PCR and sequenced. By designing
specific p rimers, two lipase genes K1 and K2 in B2 strain was amp lified by PCR and sequenced. The lipase can catalyze cotton oil and
methanol into biodiesel, when tert2butyl alcohol as solvent and acetone and (NH) 2 SO4 sedimentation method involved in.
Key wo rds: 　B iodiesel　Klebsiella sp. 　L ipase　L ipase gene
收稿日期 : 2009204230
基金项目 :兵团博士资金项目
作者简介 :玄国营 (19812) ,男 ,山东潍坊人 ,硕士生 ,从事生物能源及分子免疫和育种方面研究 ; E2mail: tutuwaityou@163. com
通讯作者 :高剑峰 ,男 ,教授 ,博士 , E2mail: 13519931689@163. com　　脂肪酶 ( lipase, EC3. 1. 1. 3) ,又称三酰基甘油酰基水解酶 ,广泛存 (在于动植物和微生物体内。脂肪酶不仅可水解三酰甘油生成二脂酰甘油和脂肪酸 (其中的二脂酰甘油可进一步被水解为一脂酰甘油、甘油和游离脂肪酸 ) ,并且能催化水解反应的逆反应酯化反应 [ 1 ]。目前脂肪酶生产主要有提取法和微生物发酵法 [ 2 ]。由于微生物脂肪酶种类多 ,作用温度及 pH范围比动植物脂肪酶广、底物专一性高 ,并且便于工业生产和获得较高纯度的酶制剂 ,因此微生物脂肪酶已成为工业生产脂肪酶的主要来源。近年来 ,非水相酶学和界面酶学的研究进一步拓展了脂肪酶的应用领域、利用脂肪酶在有机相催化的各种反应可以合成许多高价值产物 ,在食品、皮 革、医药和洗涤剂等许多工业领域中均有广泛的应用 ,充分显示了其巨大的应用潜力 [ 3, 4 ]。目前国内外对野生微生物脂肪酶的研究与开发较为活跃。报道了新疆克拉玛依及石河子地区高脂肪酶活性细菌菌株的筛选 [ 5～7 ]分离、鉴定以及相应脂肪酶基因的克隆等方面的研究结果。1　材料与方法111　材料11111　土样 　土样采集于新疆克拉玛依油田 ,新疆石河子汇昌粮油公司等地 ,共 25份土样。11112　培养基组成 　富集培养基 : (NH4 ) 2 SO4 0. 1g, NaCl 0. 05 g,MgSO4 ·7H2 O 0. 01 g, K2 HPO4 0. 1g。用 6 mol/L Na2 CO3 调 pH为 7. 0,再加入 1%橄
生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 8期
榄油 ,蒸馏水 100 m l。121℃蒸汽灭菌 20 m in。
平板初筛培养基 : (NH4 ) 2 SO4 0. 2 g, NaCl 0. 05
g,MgSO4 ·7H2O 0. 05 g, K2 HPO4 0. 1 g,琼脂 1. 2～
1. 8 g,用 6 mol/L Na2 CO3 调 pH为 7. 0,灭菌后再加
入橄榄油聚乙烯醇乳化液。
罗丹明 B显色培养基 :将橄榄油与 2 %的聚乙
烯醇溶液按 1∶3 ( v / v)混合 , 4℃静置 1 h后于组织搅
拌机中高速匀浆 3 m in即得 ,加入量为每 100 m l培
养基中加入 12 m l橄榄油乳化液。在配制好的初筛
培养基中加入 10 m l ( 0. 1 mg/m l)罗丹明 B作为指
示剂。
复筛培养基 : NaCl 1. 0 g,蛋白胨 1. 0 g,酵母膏
0. 5 g, H2 O 100 m l, pH7. 0
11113　扩增引物 　利用 Primer5. 0引物设计工具 ,
针对筛选到的菌株 ,在 GenBank中 BLAST相应脂肪
酶基因的保守区域进行引物设计 ,共设计两对引物 ,
分别是 K1和 K2。K1: F5′2GTGTCATGTGTCTCTGG
AGC23′, R5′2TTAAAAATTGGCGCTGACCC23′; K2:
F5′2ATGAAGCATCTATTTCGA23′, R5′2TCACGGTTT2
GTCCGCCTG23′。由北京华大基因研究中心合成。
11114　主要试剂 　橄榄油、聚乙烯醇 (聚合度 1750
±50)、Rhodam ine B等购自上海国药集团。PCR反
应所需的试剂购自 Fermentas公司 , pGM 2T克隆试
剂盒购自北京天根生物科技有限公司。
11115　主要仪器 　2216K高速冷冻离心机购自德
国 Sigma公司 , B io2Rad凝胶成像系统购自美国 B io2
Rad公司 , Agilent 1200高效液相色谱仪购自美国
Agilent公司 , PCR 扩增仪购自美国 B io2Rad公司 ,
B io2Rad电泳槽购自美国 B io2Rad公司。
112　方法
11211　富集方法 　将采集的土样各称 5 g溶于 10
m无菌水中 ,充分摇匀 ,静置片刻 ,让较大土壤粒沉
淀后 ,取上层液体 1 m l于装有 20 m l富集培养基的
100 m l三角瓶中 , 30℃, 180 r/m in,振荡培养 2 d后 ,
将富集培养基摇匀 ,取 1 m l转接到新的富集培养基
中 ,二次富集 ,同样条件下振荡培养 2 d后 ,进行 3
次富集。在培养的过程中 ,每 24 h要观察培养基的
pH下降情况 ,理论上 pH下降越大越优。用 6 mol/
L Na2 CO3 调至初始 pH继续培养。
11212　初筛方法 　取富集菌液 1 m l加入到 9 m l无
菌水中稀释成 10 - 1 ,依次稀释到 10 - 7 ,取 10 - 2 ,
10 - 6 , 10 - 7三个梯度各 200μl,分别涂布在罗丹明 B
显色培养基中。30℃培养箱中培养 2～3 d。
11213　复筛方法 　初筛培养后 ,在紫外灯波长为
365 nm 下观察 ,将变色圈较大的菌落划线分离纯
化 ,挑至肉汁胨斜面培养基上保藏。将纯化好的菌
株转接到装有 30 m l复筛培养基的 250 m l三角瓶
中 , 150 r/m in, 30℃培养 48 h。
11214　脂肪酶提取 　主要包括胞内酶粗提 [ 8 ]和胞
外酶提取 ,胞内酶用于酶活测定。
11215　脂肪酶活力测定 　 ( 1)平板扩散法检测酶
活 :在已制成的固体琼脂平板上用打孔器开孔 ,直径
为 3. 5 mm。打孔后将 30μl待测酶液加入孔中 ,置
于 30℃恒温培养箱中一定时间 ,定时观察孔周围的
变色情况。 (2)酸碱滴定检测酶活 :将橄榄油乳化
液作为反应的底物 ,将乳化液与 pH7. 2的 Tris2Cl缓
冲液以体积比为 4∶5混合 ,作为反应液。在反应液
加入 1 m l酶液启动反应 , 40 ℃反应 10 m in,加入 15
m l无水乙醇终止反应 ,再加 20 m l无菌水稀释体系。
对照组中应在加酶液之前先加无水乙醇。
在上述反应条件下 ,以每分钟催化水解脂肪产
生 1μmol的脂肪酸所需要的酶量定义为 1个脂肪
酶活力单位 (U) ,单位为 U /m l。
11216　菌株生长曲线的绘制 　用接种环挑取平板
上少许细菌 B2,接种到装有 250 m l LB液体培养基
的 500 m l三角瓶中 ,此时 LB液体培养基清澈无比。
于 30℃, 150 r/m in下摇床培养。取刚接种时的样
品作为空白对照。前 8 h每 2 h取样一次 , 8 h后每
隔 1 h取样一次 , 20 h后每隔 2 h取样一次 ,每次取
样 5 m l,取好的样品放在 4℃冰箱中保存 ,待取样时
间至 52 h后 ,将所有样品用可见分光光度计波长
600 nm测定 OD值。以培养时间为横坐标 , OD值
作纵坐标绘制生长曲线。
11217　菌种鉴定 　根据文献 [ 9 ]和 [ 10 ]的方法进
行特性鉴定 ,并以《伯杰氏细菌鉴定手册 (第 8
版 ) 》[ 11 ]作为分类参考。并对活性较高的菌株 B2
进行 16S rDNA特征片段进行 PCR及测序。
11218　脂肪酶基因的克隆 　脂肪酶基因的扩增及
纯化 : K1、K2两对引物扩增体系 20μl包括 : 10 ×
Taq DNA聚合酶 buffer 2μl,基因组 DNA 2μl, 5′2
041
2009年第 8期 玄国营等 :土壤中脂肪酶产生菌的筛选、鉴定及脂肪酶基因的克隆
Primer(10 pmol/L) 1μl, 3′2Primer(10 pmol/L ) 1μl,
dNTP m ix ( 1. 25 mM ) 0. 8μl, MgCl2 ( 25 mM ) 1. 2
μl, Taq DNA 聚合酶 ( 1 U /μl) 0. 5μl, ddH2 O 11. 5
μl。引物 K1、K2 PCR扩增反应条件 : 94℃预变性温
度 5 m in; 94℃变性温度 30 s; 54℃退火温度 50 s;
72℃延伸温度 60 s;反应 30个循环 ,延伸 7 m in后终
止反应。扩增完毕用 1%琼脂糖凝胶电泳检测 PCR
产物 ,使用琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化。
脂肪酶基因与 T载体的连接 :目的基因 5μl,
PGM 2T载体 ( 50 ng/μl) 1 μl, 10 ×T4 DNA L igation
Buffer1μl, T4 DNA连接酶 (1 U /μl) 1μl, ddH2 O2μl,
Total 10μl, 16℃连接过夜。
用无菌牙签挑取白斑菌落 ,接种于新 LB 液
体培养基中 37℃, 150 r /m in振荡培养过夜。取 2
μl培养好的菌液为模板进行菌落 PCR。菌落
PCR扩增反应条件同上 ,扩增完毕统一用 1 %琼
脂糖凝胶电泳检测 PCR产物。挑取 PCR鉴定为
阳性的转化子送往北京华大基因生物科技有限
公司测序。
11219　生物柴油的制备及检测 　利用提取到粗脂
肪酶催化棉籽油与甲醇发生转酯反应生成脂肪酸甲
酯。反应体系 : (1)溶剂 :叔丁醇 12 m l,棉籽油 9 g,
甲醇 2. 5 m l,粗酶 0. 432 g。 (2)反应条件 : 30℃, 200
r/m in,反应时间 24 h。 (3)试验方法 :采用分步加入
甲醇法 , 8 h /次。分 3次加完。 ( 4)产物分析 :薄层
层析法、高效液相检测。 ( 5)吸附剂 :硅胶 G, 105℃
活化 30 m in。 ( 6)展层剂 ∶石油醚 ∶乙醚 ∶醋酸 = 85
∶15∶1。 (7)显色剂 :碘。 (8)点样量 :取 1μl产物 ,
加入 9μl乙醚稀释 ,上样 5～10μl。
2　结果
211　筛选结果
采集的土样在 pH值为 7. 0和以橄榄油为唯一
碳源的富集培养基富集后 ,经过适当稀释涂布分离
平板 ,挑选有荧光圈 (图 1)的菌落涂布初筛平板 ,然
后挑选有较大透明荧光变色圈 (图 2)的进一步复
筛。初筛共挑选得到单菌落 60余株 ,复筛发现 60
余株菌株均具有一定的产酶能力 ,产酶能力较高者
共有 8株 ,其中 B2、B5菌株活力较高 ,胞外酶活性
分别为 9. 02 U和 8. 32 U (表 1)。
图 1　紫外灯波长为 365 nm下产生的荧光物质
图 2　平板扩散法产生的变色圈
表 1　酸碱滴定测定胞外脂肪酶的活力结果
菌株编号 酶活 (U /m l)
B1 5. 12
B2 9. 02
B3 6. 71
B4 7. 12
B5 8. 32
B6 3. 21
B7 3. 09
B8 2. 90
图 3　B2菌株的生长曲线
212　B2菌株的生长曲线
对酶活最高的 B2菌株进行研究 ,绘制菌株 B2
141
生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 8期
生长曲线 (图 3)。从图中可以看出 , B2菌株的生
长曲线呈抛物线状 ,可以较清晰的看出菌株生长
的 4个时期 :分别为延缓期、对数期、稳定期和衰
亡期。
213　菌种鉴定
根据《常用细菌系统鉴定手册 》和《伯杰细菌
鉴定手册 》对 B2进行各项生理生化特性分析 ,分
析结果见表 2,对该菌 16S保守 DNA 序列进行
PCR扩增并测序 ,将测序结果在 GenBank比对 ,综
上 ,最终确定 B2菌株属于克雷伯氏菌属 ( Klebsiella
sp. ) ,将测序结果在 GenBank 上注册 , 注册号
是 FJ615552。
表 2　部分生理生化试验结果
性质 B2 性质 B2
产芽孢 - 抗溶菌酶 (0. 001% ) +
革兰氏染色 + pH5. 7培养基 +
运动性 - 在 NaCl(10% ) +
过氧化氢酶 + 甘露醇 +
40℃生长 + 还原 NO3 - NO2 - +
形成二羟丙酮 + 酪素水解 +
　注 : +表示阳性
此菌在固体琼脂 LB培养基上生长良好 ,形状
为长直杆状 ,直径为 0. 3～1. 0 mm,长度为 0. 6～
6. 0 mm,可单独存在或以成对、短链状排列 ,不具有
运动性。菌落最初形成表面光滑、凸起、微透明、粘
稠状 ,培养 24 h后菌体表面出现褶皱、干燥且不透
明 (图 4)。
图 4　菌株 B2的菌落形态及菌体形态
214　脂肪酶基因的 PCR扩增结果
以 K1、K2为引物 ,以菌株 B2体内基因组为摸
板 , PCR扩增后用 1%琼脂糖凝胶电泳检测 PCR产
物 ,分别得到 600 bp左右 (图 5)和 1 600 bp (图 6)
左右的产物 ,使用琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化回收
此片段。
1. 阴性对照 ; 2、3. B2 PCR产物 ; M. DNA MarkerⅢ
图 5　K1为引物 PCR扩增结果
1. 阴性对照 ; 2、3、4. B2 PCR产物 ; M. DNA Marker Ⅲ
图 6　K2为引物 PCR扩增结果
215　阳性转化子的菌落 PCR鉴定结果
分别以 K1、K2为引物 ,菌落 PCR鉴定外源基
因是否连接到 PGM 2T克隆载体 ,结果 (图 7,图 8) ,
表明之前扩增得到的 600 bp左右和 1 600 bp左右
产物已经连接到 PGM 2T克隆载体 ,并且转入大肠杆
菌 DH5a。
1、2. 菌落 PCR产物 3. 阴性对照 ; M. DNA Marker Ⅲ
图 7　K1 T载体转化子菌落 PCR鉴定结果
241
2009年第 8期 玄国营等 :土壤中脂肪酶产生菌的筛选、鉴定及脂肪酶基因的克隆
1. 阴性对照 ; 2、3. 菌落 PCR产物 ; M. DNA Marker Ⅲ
图 8　T载体转化子菌落 PCR鉴定结果
216　质粒测序结果
将 K1、K2测序结果在 NCB I的 GenBank中进行
BLAST, K1与 GenBank序列中克雷伯氏菌的 MGH
78578区段上的一个 CDS同源性达 99% ,将测序结
果在 GenBank上注册 ,注册号是 FJ615553; K2与
GenBank序列中克雷伯氏菌的 MGH 78578区段上
的另外一个 CDS同源性达 98% ,将测序结果在
GenBank上注册 ,注册号是 FJ615554,而克雷伯氏菌
的 MGH 78578区段是一个推定的脂肪酶基因区段。
217　催化棉籽油生产生物柴油及检测
按照复筛培养方法发酵培养 B2菌株 ,用于提
取 B2菌株内粗酶 ,即胞内酶。反应体系进行转酯
反应。用薄层层析法检测菌株转酯活性 ,结果如图
9。箭头所指为脂肪酸甲酯。
1. 阴性对照 ; 2. B2菌脂肪酶 ; 3. 阳性对照 (NOV435)
图 9　薄层层析法检测菌株转酯活性
用高效液相检测菌株体内胞内酶转酯活性结
果 ,从图 10可以看出 , B2中提取到的脂肪酶具有转
酯活性 ,其催化棉籽油和甲醇所产的脂肪酸甲酯中
含量最多为亚油酸甲酯。该微生物脂肪酶可望在工
业中得到广泛应用 [ 12～15 ]。
图 10　高效液相检测菌株体内胞内酶转酯活性结果
3　讨论
从土壤中筛选出有脂肪酶活性的菌株 60余株 ,
其中 8株活性较高。通过对活性较高的菌株 B2进
行形态学观察 ,生理生化测定以及 16S rDNA特征
片段比较分析 ,初步确定 B2为克雷伯氏菌属 ( Kleb2
siella sp. )。通过设计特定引物 ,从 B2菌株基因组
中扩增出全长为 582 bp和 1 623 bp的两个脂肪酶
基因。这两个基因都属于克雷伯氏菌的 MGH
78578区段上的 CDS。发酵培养 B2菌株提取粗酶 ,
胞内酶 ,进行转酯反应 ,通过薄层层析和高效液相检
测 ,发现从 B2中提取到的胞内酶具有转酯活性。
目前研究表明克雷伯氏菌的 MGH 78578区段是一
个推测的脂肪酶基因区段 ,相信对该区段深入研究
在生物酶法制备生物柴油方面以及其他工业应用方
面必将会有更大地发现。并且为今后在分子水平上
对酶进行改造、提高酶转酯活性等做准备工作。
参 考 文 献
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(下转第 150页 )
341
生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 8期
30余条脂肪酶基因 ,构建了部分高效工程菌。初步
研究表明 ,白地霉 ( G. cand idum Y162)脂肪酶和洋
葱假单胞菌 G63脂肪酶具备优良的有机溶剂耐受
性和热稳定性 ,是生产生物柴油的优良催化剂 ,在工
业上极具应用开发潜力 [ 15, 19 ] ;黑曲霉 F044和白地
酶 Y162具极强的底物特异性 ,能选择性水解或酯
化获得高营养价值的多不饱和脂肪酸 ( FUFA s) ,在
功能食品开发中显示出诱人的前景 [ 15, 18 ]。
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