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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011年第 1期
GST pul-l down验证流感病毒 PB1-F2蛋白与
热休克蛋白 40的相互作用
侯佩莉 1, 2 关振宏 2 张茂林2 李影1 段铭 2
( 1吉林农业大学动物科学技术学院,长春 130118; 2吉林大学人兽共患病研究所 人兽共患病研究教育部重点实验室,长春 130062)
摘 要: 为体外验证流感病毒 PB1-F2与热休克蛋白 H sp40相互作用, 通过两个方向的 GST pul-l down试验验证 PB1-F2
与 H sp40的相互作用。构建 GST-多肽融合蛋白原核表达载体 pGEX-6P-1-PB1-F2和 pGEX-6P-1-H sp40,并在大肠杆菌 (E. co-
li) BL21中诱导表达; 构建真核表达载体 pLEGFP-H sp40及 pCAGGS-PB1-F2, 并分别转染 293T细胞使其表达 H sp40及 PB1-F2
融合蛋白, 然后进行 GST pul-l dow n试验验证二者的相互作用。成功地构建了两种蛋白的各种表达载体, 经表达、纯化获得了
可溶性的 GST-多肽融合蛋白, GST pul-l down试验正反两方向都证实了 PB1-F2与 H sp40的相互作用, 初步证实了流感病毒
PB1-F2在体外能与 H sp40发生相互作用。
关键词: GST pu l-l down 流感病毒 PB1-F2蛋白 热休克蛋白 40 蛋白质相互作用
Identification of Interaction between Influenza V irus PB1-F2 Protein
andHeat Shock Protein 40 by GST Pul-l down Assay
H ou Pe ili
1, 2 Guan Zhenhong2 ZhangM ao lin2 L iY ing1 Duan M ing2
(
1
College of A nimal Science and T echnology, J ilin Agricultral University, Changchun 130118;
2
Key Laboratory of
ZoonosisM inistry of Education, Institute of Zoonosis, J ilin University, Changchun 130062)
Abstrac:t To identify the interaction between in fluenza v irus PB1-F2 pro te in and heat shock prote in H sp40 byGST pu l-l down as-
say in vitro, the in terac tion o f PB1-F2 and H sp40 was confirm ed by doub le-d irection GST pu l-l down assays. The prokaryo tic express ion
vec to rs of GST po lypeptide fusion pro te in pGEX-6P-1-PB1-F2 and pGEX-6P-1-H sp40 w ere constructed and transform ed to E. coli
BL21, and then induced to express the fusion prote ins. The eukaryotic vecto r pLEGFP-H sp40 and pCAGGS-PB1-F2 we re constructed
and transfected in to 293T cel,l the products of wh ich w ere then utilized in theGST pul-l dow n assays. A ll k inds of expression vectors of
the two pro teins w ere successfu lly constructed, the so lub le GST fusion prote ins were obta ined via expression and purification, and the
b ind ing of the tw o prote ins w as con firm ed by both doub le-d irection GST pul-l down assays. The interaction betw een in fluenza v irus PB1-
F2 andH sp40 w as identified by doub le-d irection GST pul-l dow n in vitro, wh ich cou ld establish a foundation for exp lor ing the pa thogen ic
m echan ism o f influenzaA v irus.
Key words: GST pul-l dow n Influenza v irus PB1-F2 pro te in H sp40 P ro te in-prote in inte raction
收稿日期: 2010-06-11
基金项目:国家自然科学基金项目 ( 30800824) ,吉林大学农学部人才引进启动基金项目 ( 4305050102B9 )
作者简介:侯佩莉,女,硕士研究生,研究方向:分子病毒学; E-m ai:l ape ilihou@ 163. com
通讯作者:关振宏,女,讲师,研究方向:流感病毒与宿主相互作用; E-m ai:l gzheileen@ 163. com
2001年, Chen等 [ 1]偶然发现了 A型流感病毒
( influenzaA v irus, IAV )的第 11种蛋白质 PB1-F2,
它是由流感病毒聚合酶亚单位 PB1基因的另一个
小的开放性阅读框编码的 87个氨基酸左右的蛋白
质,存在于大多的 IAV中。最近的研究发现, PB1-
F2是 IAV的一种重要毒力因子。很多科学家认为,
流感病毒所致的高死亡率很可能与多种流感病毒毒
株中都存在 PB1-F2蛋白有关 [ 2]。据证实, 不同 IAV
分离株的 PB1-F2长度各异, 而且 PB1-F2是一种寡
聚蛋白, 能形成二聚体和三聚体; 在感染细胞中,
2011年第 1期 侯佩莉等: GST pul-l down验证流感病毒 PB1-F2蛋白与热休克蛋白 40的相互作用
PB1-F2的生命周期非常短, 只有 5 h左右 [ 3] ; PB1-
F2主要定位在病毒感染细胞的线粒体表面, 但是其
在胞浆及核内都能发现。研究证实, 长为 78个氨基
酸的 PB1-F2能定位于线粒体, 而缺失线粒体定位
功能域的截短型 PB1-F2表现为胞质弥散分布 [ 4 ]。
在病毒感染过程中, PB1-F2主要定位于宿主细胞线
粒体的内膜和外膜, 可通过其羧基末端的线粒体靶
向序列 ( m itochondr ia l targeting sequence, MTS)而诱
导宿主细胞凋亡 [ 5]。 PB1-F2是流感病毒复制非必
需的蛋白, 但与流感病毒的致病性有关。 Co lem an
等 [ 6 ]研究发现, PB1-F2能够增强病毒在鼠中的致
病性。McAu ley等 [ 7 ]进一步证明, PB1-F2作为一个
新的流感病毒的毒力因子, 能促进病毒感染后继发
的细菌感染。
热休克蛋白 ( heat shock prote ins, HSPs)是一类
高度保守的糖蛋白超基因家族,存在于所有的原核
细胞和真核细胞中 [ 8 ]。热休克蛋白 40 ( heat shock
pro tein 40, Hsp40)家族成员根据结构域的不同可分
为 Ñ、Ò、Ó型,可包含 3个不同的结构域:高度保守
的靠近 N-末端的大约 70个氨基酸 J结构域、富含甘
氨酸 /苯丙氨酸 ( G /F )结构域和 C-末端的富含半胱
氨酸锌指样结构域。几乎所有的 H sp40都包含有
约 70个氨基酸的 J结构域。 Ñ型和Ò型的 Hsp40 J
结构域位于 N端, Ó型 H sp40家族的 J结构域位于
蛋白的任意位置 [ 9 ]。Hsp40蛋白作为共分子伴侣,
结合热休克蛋白 70 (H sp70), 促进其 ATP酶活性。
Hsp 40和 H sp70相互作用能参与 Hsp90对 100多
种信号转导相关蛋白的活性调节 [ 1 0 ]。由 H sp40,
Hsp70, H sp90和亲免蛋白构成的大分子复合体可结
合微管或进行入核转运 [ 1 1 ]。研究证实, H sp40影响
多种病毒的复制, H sp40通过降低乙型肝炎病毒的
核心蛋白和 X 蛋白的稳定性而抑制病毒的复
制 [ 1 2 ] ; H sp40在 Ne-f介导的 H IV-1基因表达和复制
的增强方面起重要作用 [ 1 3 ]。
本研究是在酵母双杂交试验的基础上, 通过
GST pu l-l dow n技术正反两方面进一步验证流感
病毒 PB1-F2蛋白与宿主的热休克蛋白 H sp40 /
Hd j1的相互作用, 将有助于揭示 A型流感病毒的致
病机理, 从而为流感病毒感染的预防和治疗提供
参考。
1 材料与方法
111 细胞、菌株和质粒
人胚胎肾细胞 ( 293T )、大肠杆菌 E. coli BL21
以及 pGBKT7-PB1-F2、PACT2-H sp40、pLEGFP-C1、
pCAGGS-N-FLAG和 pGEX-6P-1质粒由吉林大学人
兽共患病教育部重点实验室保存。
112 分子生物学试剂
E coR I、BamH I、Xho I、Sma I、T4 DNA连接酶、
PFU DNA聚合酶等工具酶购自 TaKaRa公司;谷胱甘
肽-Sepharose 4B树脂购自 GE hea lthcare公司;转染试
剂 L ipo fectm ine 2000购自 Inv itrogen公司; IPTG、蛋白
酶抑制剂 ( protease inhibitor cocktails)为 S igma公司
产品;抗 FLAG标签、绿色荧光蛋白 ( GFP)单克隆抗
体、辣根过氧化物酶 (HRP)偶联的羊抗兔 IgG和羊
抗鼠 IgG购自 San ta Cruz公司; 辣根过氧化物酶反
应底物购自美国 P ierce公司; PVDF膜为 Gelm an公
司产品, X光片为 Kodak公司产品。
113 表达载体的构建
11311 pGEX-6P-1-PB1-F2原核表达载体的构建
以实验室保存的 pGBKT7-PB1-F2为模板, 按常规方
法用高保真的 PFU DNA聚合酶进行 PCR扩增。引
物序列:上游引物 (下划线为 BamH I酶切位点 ) : 5c-
CGGGATCCATGGGACAGGAACAGGATACA-3c; 下游
引物 (下划线为Xho I酶切位点 ) : 5c-CCGCTCGA GC-
TACTCGTGTTTGCTGAACAAC-3c。 PCR 扩增程序:
94e 预变性 5 m in后, 按以下参数进行 30次循环:
94e 变性 1 m in, 65e 退火 35 s, 72e 延伸 1 m in, 最
后 72e 延伸 10 m in。
pGEX-6P-1载体和 PCR产物用 BamH I和Xho I
于 37e 酶切后回收, 将目的片段与载体用 T4 DNA
连接酶 16e 连接过夜。连接产物转化 E. coli DH 5A
感受态细胞, 提取质粒进行 PCR和酶切鉴定, 对阳
性重组质粒进行 DNA测序分析。
11312 pGEX-6P-1-Hsp40原核表达载体的构建
以实验室保存的 PACT2-Hsp40为模板, 按常规方法
进行 PCR扩增。引物序列: GPH 1: 5c-GGGATCCAT-
GGGTAAAGACTACTAC-3c; GPH2: 5c-CCGCT-CGAG
CTATATTGGAAGAACCTG-3c。设计的引物可以扩
增 H sp40的全部编码序列 ( 1 023 bp)。PCR程序:
94e 4m in, 94e 1 m in, 56e 40 s, 72e 2m in, 31个
203
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2011年第 1期
循环; 最后 72e 延伸 10m in。将 pGEX-6P-1载体和
PCR产物用 BamH I和 Xho I酶切后, 进行连接、转
化。重组质粒鉴定后,经 DNA序列测定证实阅读框
架无突变。
11313 pCAGGS-PB1-F2真核表达载体的构建 以
pGEX-6P-1-PB1-F2为模板扩增的 PB1-F2全长基
因,引物序列如下: 上游引物 (下划线为 Sma I酶切
位点 ): 5c-TCCCCCGGGCATGGGACAGGAACAGG AT-
AC-3c;下游引物 (下划线为 Xho I酶切位点 ) : 5c-
CCGCTCGAGCTACTCGTGTTTGCTGAACAAC-3c,
PCR产物用 Sma I和 Xho I双酶切后克隆于用同
样酶切的 pCAGGS-N-FLAG载体中。获得的重组
质粒利用 PCR鉴定和酶切鉴定后, DNA序列测定
验证。
11314 pLEGFP-Hsp40真核表达载体的构建 以实验
室保存的 PACT2-H sp40为模板, 进行 PCR扩增产物。
引物序列: 5c-CCCAAGCTTTGATGGGTAAAGACTAC-
TAC-3c; 5c-CGGGATCCCTATATTGGAAGAACCTG-3c。
PCR产物和 pLEGFP-C1载体用H ind Ó和 BamH I酶
切,按上述方法进行载体构建。
114 GST融合蛋白的表达与纯化
11411 GST-PB1-F2的表达与纯化 测序正确的
pGEX-6P-1-PB1-F2重组质粒转化 E. coli BL21, 挑
单菌落于含氨苄青霉素 ( Amp, 50 mg /mL)的液体
LB培养基中, 220 r /m in 37e 培养过夜。将过夜菌
按 1 /100接种量接种含 Amp的 LB液体培养基中,
220 r /m in 37e 摇菌至 OD6 00值 016 - 01 8之间时,
加入 IPTG至终浓度为 1 mmo l/L, 16e 诱导表达过
夜。 5 000 r /m in离心 10m in, 收集菌体,重悬于 10
mL PBS(加入终浓度为 1 mmo l/L DTT, 1 mmo l/L
PM SF, 1% T riton X-100) , 超声破碎后 12 000 r /m in
离心 15 m in, 上清、沉淀及对照样品进行 SDS-
PAGE电泳分析。用谷胱甘肽-Sepharose 4B树脂
纯化 GST融合蛋白: 收集大量上述诱导菌超声破
碎的上清液, 加入适量谷胱甘肽 Sepharose 4B颗
粒, 4e 结合过夜;用 PBS充分洗脱未结合蛋白质 4
次, 每次 15m in, 即得到结合有 GST-PB1-F2融合蛋
白的 Sepharose 4B颗粒。
11412 GST-H sp40的表达与纯化 测序正确的
pGEX-6P-1-H sp40重组质粒转化 E1co li BL21,将过
夜菌按 1 /100接种量接种含氨苄青毒素的新鲜 LB
液体培养基中, 方法同前, 纯化后的蛋白进行 SDS-
PAGE电泳分析。
115 融合蛋白的真核表达
将 293T细胞接种到 6 cm培养皿上,培养过夜
24 h左右,使细胞长到 80%的联合度。根据 Invitro-
gen公司说明, 用 Lipo fectam ine 2000试剂将 pLEG-
FP-H sp 40或 pCAGGS-PB1-F2载体转染细胞,用含
10%小牛血清的 DMEM培养 24 h后用预冷的 PBS洗
2次,加 015mL细胞裂解液 ( 50 mmol /L Tris pH810,
150 mmo l/L NaC ,l 015% NP-40, 1 mmo l/L PM SF,
011% DTT,蛋白酶抑制剂 )裂解细胞; 转移入 115
mL的离心管中,小号探头超声后, 12 000 r/m in, 4e
离心 10m in,取上清做 GST pu l-l dow n,留出 20 LL上
清作电泳分析。
116 GST沉淀试验
将吸附有 GST-PB1-F2融合蛋白的 G lutathione-
Sepharose凝胶 20 LL加入离心管中, 用 PBS洗涤 3
次后加入 pLEGFP-Hsp40真核表达的细胞裂解上清
液, 4e 结合 3 h后, 3 000 r /m in, 4e 离心 5 m in, 弃
上清。再用裂解液洗 Sepharose珠子 4次, 每次 15
m in, 吸净上清。各加 2 @ SDS-PAGE上样缓冲液 10
LL,煮沸 5 m in,电泳后进行W estern blotting免疫印
迹分析。阴性对照以凝胶纯化的 GST 蛋白代替
GST-PB1-F2 /H sp40融合蛋白。采用同样的方法进
行另一个方向的 pu l-l dow n试验, 将 GST-H sp40融合
蛋白的 G lutathione-Sepharose珠子与 pCAGGS-PB1-F2
真核表达的细胞裂解上清液结合, SDS-PAGE电泳后
进行Western blotting免疫印迹分析。
117 Western b lo tt ing免疫印迹分析
蛋白样品经 SDS-PAGE凝胶电泳后, 电转移至
聚偏二氟乙烯 ( PVDF )膜上; 将膜放入 Tris缓冲液
( TBST )中清洗 15 m in, 5%脱脂牛奶封闭 1 h; 加入
以 1B1 000、用 5%脱脂牛奶稀释的 FLAG或 GFP标
签的单克隆抗体, 室温轻摇 1 h, TBST液洗膜 3次,
每次 7 m in; 加入用 5% 脱脂牛奶稀释的二抗 (抗
FLAG抗体为辣根过氧化物酶偶联的羊抗鼠 IgG, 抗
GFP抗体为辣根过氧化物酶偶联的羊抗兔 IgG ), 室
温轻摇 1 h, TBST洗膜 3次后,用 ECL化学发光法
显色 5 m in,压片显影。
204
2011年第 1期 侯佩莉等: GST pul-l down验证流感病毒 PB1-F2蛋白与热休克蛋白 40的相互作用
2 结果
211 pGEX-6P-1-PB1-F2重组质粒的鉴定
以实验室保存的 pGBKT7-PB1-F2为模板, PCR
扩增获得 PB1-F2全长编码序列 ( 264个核苷酸 ) ,将
酶切产物插入到载体中,重组质粒 pGEX-6P-1-PB1-
F2的 PCR及酶切鉴定结果如图 1。 PCR及酶切鉴
定的结果都产生与目的条带大小相符的片段; 测序
结果表明,重组质粒中插入的序列完全正确。
M. DL2000M arker; 1. PCR产物; 2. B amH I和 X ho I双酶
切 pGEX-6P-1-PB1-F2
图 1 重组质粒 pGEX-6P-1-PB1-F2的 PCR及酶切鉴定
2. 2 pGEX-6P-1-H sp40载体的构建
以实验室保存的 H sp40-PACT2为模板进行
PCR扩增。将 PCR酶切产物插入到载体中,重组质
粒 pGEX-6P-1-H sp40的 PCR及酶切鉴定结果如图
2。 PCR及酶切鉴定的结果都产生与目的条带大小
相符的片段;测序结果表明,重组质粒中插入的序列
无突变。
M. Marker DL2000; 1. pGEX-6P-1-H sp40的 PCR鉴定; 2. pGEX-6P-
1-H sp40的 B amH I和 X ho I酶切鉴定
图 2 重组质粒 pGEX-6P-1-Hsp40的 PCR及酶切鉴定
213 pLEGFP-H sp40、pCAGGS-PB1-F2载体的构建
应用 PCR方法获得的 H sp40全长基因 ( 1 023
bp)克隆到 pLEGFP-C1真核表达载体上, 构建重组
质粒 pLEGFP-Hsp40。以 pGEX-6P-1-PB1-F2为模
板, 将 PB1-F2的全长基因构建到 pCAGGS-N-FLAG
载体上,构建重组质粒 pCAGGS-PB1-F2。两种重组
质粒的 PCR和酶切鉴定结果图略。鉴定的阳性重
组质粒测序表明无突变发生, 可以进行可溶性蛋白
的真核表达。
214 GST-PB1-F2表达纯化
pGEX-6P-1-PB1-F2重组阳性质粒转化 E1coli
BL21菌, 应用终浓度为 012 mmo l/L的 IPTG, 16e
诱导表达过夜。诱导表达的菌超声后上清用 G luta-
thione-Sepharose 4B亲和层析法纯化, 诱导表达后分
析融合蛋白的可溶表达情况, SDS-PAGE检测结果
(图 3 )表明, 表达的 GST-PB1-F2分子量约为
36 kD,仅部分可溶表达, 且蛋白较易降解。大量
纯化的 GST-PB1-F2蛋白将用于 GST 沉淀试验。
M.标准蛋白 M arker; 1.纯化于 G lu tath ione-Seph arose 4B
上的 GST-PB1-F2蛋白; 2.用 IPTG诱导的重组菌超声后
沉淀中的蛋白; 3.用 IPTG诱导的重组菌超声后上清中
的蛋白; 4.用 IPTG诱导的重组菌总蛋白
图 3 SDS-PAGE检测 GST-PB1-F2融合蛋白的纯化
2. 5 GST-Hsp 40表达纯化
pGEX-6P-1-H sp 40重组质粒转化 E. coli BL 21
菌, 用终浓度为 1mmo l/L的 IPTG, 16e 诱导表达过
夜。诱导表达的菌超声后上清用 G lutath ione-Sepha-
rose 4B亲和层析法纯化,得到了较纯的融合蛋白,
将纯化后的 GST-H sp40融合蛋白经 SDS-PAGE分离
后, 检测结果 (图 4)表明,表达的 GST-H sp40分子量
约为 66 kD, 且大部分可溶表达。
205
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2011年第 1期
M.标准蛋白 M arker; 1.诱导表达的重组菌总蛋白; 2.诱
导后上清中的蛋白; 3. 诱导表达沉淀中的蛋白; 4. 纯化
于 G lu tath ione-Sepharose 4B上的 GST-H sp40蛋白
图 4 GST-Hsp40融合蛋白的表达和纯化
2. 6 GST pu l-l dow n试验
用纯化于 G lutathione-Sepharose 4B上的 GST-
PB1-F2沉淀细胞内表达的 H sp40, 反复洗涤后,
W estern blotting鉴定, 用抗 GFP单克隆抗体检测
GST-PB1-F2与 H sp40是否结合, 结果 (图 5)显示,
GST-PB1-F2能够与 Hsp40在体外特异性结合。另
一方面, 采用相同的方法, 用 GST-H sp40沉淀细胞
内表达的 PB1-F2, 用抗 FLAG单克隆抗体检测,
W estern blotting结果 (图 6)显示, GST-H sp40能够与
PB1-F2在体外相互作用; 而阴性对照 GST不能与
Hsp40、PB1-F2蛋白结合。
图 5 GST-PB1-F2与 H sp40的 pul-l down试验
图 6 GST-H sp40与 PB1-F2的 pul-l down试验
3 讨论
流感病毒是严重威胁人和动物健康的重要的病
原体, 然而流感病毒蛋白与宿主细胞的作用和影响
比较复杂。 PB1-F2是最近发现的 A型流感病毒的
重要毒力因子,研究证实, PB1-F2通过作用于病毒
感染细胞的线粒体, 与线粒体腺苷酸转位分子 3
( ANT3)和电压依赖的阴离子通道 1( VDAC1)相互
作用,改变线粒体膜通透性, 释放细胞色素 C引起
线粒体途径诱导的细胞凋亡 [ 1 4 ]。 PB1-F2能直接与
PB1相互作用,调节聚合酶的活性,导致病毒聚合酶
活性的增强, 从而增加 RNA的积累, 保证病毒的充
分复制 [ 1 5 ]。同时, PB1-F2是一种磷酸化蛋白,蛋白
激酶 PKC介导的 PB1-F2的磷酸化作用表明能增强
诱导单核细胞凋亡的作用 [ 1 6 ]。研究病毒蛋白与宿
主蛋白的相互作用是探索分子机理的一个重要途
径, 所以寻找与 PB1-F2相互作用的协同因子将有助
于深入研究 PB1-F2介导的分子致病机制,对于流感
的防治具有重要意义。
以 PB1-F2为诱饵蛋白,利用酵母双杂交技术从
人肾文库中筛选出与其相互作用的宿主蛋白 Hsp40 /
Hd j1。Hsp40是 Hsp70蛋白的一种辅助分子伴侣,
H sp40协同 Hsp70在多种生理过程中发挥重要作用,
例如,蛋白质的折叠与转运、信号转导、大分子复合
物的组装和变性蛋白的复性与降解, 抑制病毒的复
制等 [ 17]。采用酵母双杂交技术研究蛋白质间的相
互作用,其结果可能存在着一定的假阳性,必须用其
他的试验做进一步的验证。本研究成功地构建了各
种原核和真核表达载体, 通过亲和纯化获得了较高
纯度的 GST-PB1-F2和 GST-H sp40融合蛋白。在蛋
白表达试验过程中添加了适量的蛋白酶抑制剂, 并
在真核表达中优化了表达蛋白的时间,有效地改善
了 PB1-F2蛋白的降解问题。最后, 利用 GST pu l-l
down试验在体外正反两方面进一步验证了酵母双
杂交技术筛选获得的流感病毒 PB1-F2蛋白与热休
克蛋白 H sp40的相互作用。PB1-F2与 H sp40蛋白
相互作用的深入研究,不但有助于揭示 PB1-F2的分
子作用机制,也为研究 H sp40的生物学功能奠定了
基础。
参 考 文 献
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