全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 1期
适用于微卫星标记的湿地松、加勒
比松 DNA快速提取法
李义良 赵奋成 张应中 吴惠姗
(广东省林业科学研究院林业研究所,广州 510520 )
摘 要: 以湿地松 ( P inus ellio ttii, PEE ), 包括古巴加勒比松 (P car ibaea var car ibaea, PCC )、洪都拉斯加勒比松
(Pcaribaea varhondurensis, PCH )、巴哈马加勒比松 (Pcar ibaea varbahm aensis, PCB) 3个变种在内的加勒比松,侧枝顶芽为试
验材料, 使用 RETSCH MM 400混合球磨仪破碎植物组织,然后利用改良 CTAB法提取基因组 DNA, 完成 48个样品仅用 1 h, 1
个工作日可提取 300个样品以上, DNA分子量大于 20 kb, 03 g样品可提取 DNA 20- 60 g, 能够满足几百次 PCR反应; 利用
所提 DNA进行 SSR分析,条带清晰, 多态性好,说明该方法提取的 DNA完全可以满足 SSR反应的需要。本研究为 SSR标记
用于湿地松、加勒比松分子标记辅助选择育种提供了经济、高效、可靠的 DNA提取方法。
关键词: 湿地松 加勒比松 DNA提取 SSR分子标记
Study of Rapid DNA ExtractionM ethod Suitable for
SSR Analysis in Slash Pine and Caribbean Pine
L iY iliang Zhao Fencheng Zhang Y ingzhong W uHuishan
( Institute of Forestry, Guangdong Academy of Forestry, Guangzhou 510520)
Abstrac:t One im proved CTAB me thod to extracted genom ic DNA from term ina l buds on late ra l branch of slash pine and Ca ribbe
an pine was prov idedAcco rd ing to the improved m ethod and the use o fRETSCH MM 400 fragm ented plant tissue fo r extracted o fDNA,
the e fficiencyw as ra ised compared to the norm a l process In the exper im ent, 48 sam ples cou ld be treated one tim e and the process could
be fin ished in one hour, and DNA of 300 sam ples could be ob tained in one w orkday It w as estim ated that m olecu lar we ight o f the ex
tracted DNA is larg er than 20 kbAnd 20- 60 g DNA cou ld be extracted from 03 g term ina l bud, which wou ld be enough fo r hundreds
o f tim es o f PCR reactionThe ex tracted DNA w as using in SSR ana ly sis, the band ing pa tterns w as c lea r and w ith good polym orph ism,
and the quality o f DNA extracted using thism e thod was suitable for SSR ana lys isThis study prov ide an econom ic, effic ient, and re liab le
DNA extraction m ethod for SSR m arke rs use for mo lecu lar m arkerassisted se lection b reeding o f S lash p ine, Ca ribbean p ine
Key words: S lash pine C aribbean pine DNA ex tract SSR mo lecu lar m arkers
收稿日期: 20090826
基金项目:广东省林业科技创新专项资金项目 ( 2008KJCX00501 ) ,广东省科技计划项目 ( 2007A0202000011)
作者简介:李义良,男,博士,助研,研究方向:林木遗传育种; Em ai:l lyl1209@ 163 com
目前,在松树分子标记辅助育种研究方面,使用
比较多的有 RFLP、RAPD、AFLP、SSR、ISSR等, SSR
标记因具有数量丰富、重复性好、稳定性强、为共显
性标记等优点,近年来在林木分子标记辅助选择育
种研究中受到广泛重视。在松树遗传育种方面, SSR
标记已在火炬松 (P inus taeda ) [ 1, 2]、辐射松 (P inus ra
d iata )
[ 3, 4]、扭叶松 (P inus contorta var. latifo lia ) [ 5]、美
国白松 ( P inus strobus L. ) [ 6, 7]、赤松 ( P inus densif lo
ra)
[ 8]等松树的群体遗传、遗传图谱构建、QTLs定位
等方面得到广泛应用。天然分布于北美洲东南部的
湿地松和中美洲地区的加勒比松 (洪都拉斯加勒比
松、巴哈马加勒比松、古巴加勒比松 ), 是世界上重
要的建筑材、纸浆材和产脂树种。我国于上世纪
30- 40年代、60- 70年代先后引种了湿地松和加勒
比松, 70年代中期至 80年代, 广东省湛江市林科所
首次开展了湿地松 古巴加勒比松杂交制种与测定
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 1期
研究, 初步证实杂交育种可取得较高的经济效
益 [ 9]。上世纪 90年代初广东省林科院进行了较大
规模的湿地松与加勒比松杂交育种研究, 目前已获
得了许多具有杂种优势的优良组合, 两个树种通过
杂交已获得 F2代家系,生长表现较好。
湿地松、加勒比松杂交获得了许多杂种优势突
出的杂交组合,但是关于其机理的研究还相对较少。
分子生物学技术的发展和完善,特别是分子标记技
术为杂种优势遗传机理研究提供了全新的方法。分
子标记应用要以基因组 DNA为模板, 而且要求样本
量较大,因此, 进行快速提取并获得高质量的模板
DNA成为进行此类研究的前提。CTAB法是提取植
物 DNA的主要方法,在不同植物的具体试验中需要
进行改良, 以提高 DNA的质量。常规用于 SSR分
析的 DNA的方法要经过研磨、提取和纯化, 虽然获
得 DNA质量较高,但是存在着步骤繁琐、耗时、损失
大等缺点。
为了缩短提取时间、降低 DNA损耗等,本研究
以湿地松、加勒比松侧枝顶芽为材料, 探索高效、经
济的基因组 DNA提取方法, 为大规模开展湿地松、
加勒比松及其子代分子标记辅助育种研究奠定
基础。
1 材料与方法
11 材料
湿地松、加勒比松侧枝顶芽采自广东省台山红
岭种子园、广东省林科院、湛江市林业良种繁育场。
12 仪器
Eppendorf紫外分光光度计 (德国 ), PTC200PCR
扩增仪 (美国 ), EBA12R离心机 (德国 ),君意电泳仪,
德国 RETSCH MM400混合球磨仪,紫外成像系统等。
13 试剂
1 kb DNA Ladders、50 bp DNA Ladders、Taq酶、
dNTP及引物购自上海生工生物工程技术服务有限公
司。氯仿,异戊醇,无水乙醇,琼脂糖, 2巯基乙醇等。
14 DNA提取步骤
取 03 g侧枝顶芽于 2mL离心管中,加入碳化
钨小球一粒,于液氮中预冷 5 m in; 预冷后将离心管
放在两个 24孔研磨适配器中的格栅中 (每个格栅
可放 1个小试管 ) , 然后将适配器固定在 RETSCH
MM 400DNA提取仪上,振荡研磨 2m in,若研磨不充
分, 可重复 1- 2次;
向装有植物材料的 20 mL离心管中加入
075 mL预热的 CTAB提取液 (含 2% CTAB、3% PVP、
14mo l/L NaC l、20 mmo l/L EDTA、100 mmol /L T ris
HC l、02%巯基乙醇 ) , 65! 水浴 20m in;
加等体积的氯仿 ∀异戊醇 ( 24∀1 ), 充分混匀,
12 000 r/m in离心 8 m in; 取上清于另一新离心管
中, 取上清加入 1 /10 V NaA c, 2- 3 V预冷的无水乙
醇;轻轻上下颠倒混匀, 于 - 20! 放置 10 m in, 沉淀
DNA; 取出, 9 000 r/m in离心 5 m in; 弃上清, 加入
75%乙醇洗 DNA沉淀 1次, 风干,加 100 L TE溶
解沉淀,电泳检测。
15 DNA浓度测定及电泳检测
利用 Eppendorf紫外分光光度计 (德国 )进行
DNA浓度测定。取 5 L模板 DNA与 3 L溴酚兰
指示剂混匀后, 在 08%琼脂糖凝胶 (每 100 mL中
含有 10mg /mL ErBr溶液 5 L)电泳检测质量, 点
1 kb DNA M aker做质量浓度。溴酚兰指示剂距离
凝胶前缘 1 cm时,停止电泳,取出凝胶于紫外成像仪
下拍照。
16 SSR分子标记检测
用于扩增反应的 SSR引物均 [ 1, 3]来源于火炬松,
表 1中引物由上海生工生物技术服务有限公司合成。
表 1 SSR引物及碱基序列
编号 引物名称 核苷酸序列 ( 5#- 3#)正向引物 反向引物
1 PtTX3011
AATTTgggTg
TATTTTTCTTAgA
AAAAgTTgAAggAgTT
ggTgATC
2 PtTX3105
TgTC ggTggAgTTg
gCAgTAgACT
AgggCCCAgC gTTTC
CTg
3 PtTX3106
gAAAATTATAg
gTCTgAT
ATACATgAAAggAg
gATTAg
4 PtTX4033
ACC CAT TTC CTT
TTC AAC
ggT ggC gAg gCA
TTA TTC
5 PtTX4062
TCT Agg CAA TCT
TTT ACC AAC
ATC ATA gCC TCA
TCC AAT ACA
随机选取 4个 DNA样本, 分别为 PEEB106,
PCBPCB04, PCCS142, PCHPCH 02进行 PCR 扩
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2010年第 1期 李义良等:适用于微卫星标记的湿地松、加勒比松 DNA快速提取法
增。PCR采用 25 L反应体系, 其中模板 DNA 30
ng、dNTP 3mM、10 buffer(含 20 mM M gC l2 ) 3 L、
TaqDNA聚合酶 1 U、3 M 正反向引物, 其余用
ddH 2O补足。扩增程序为 94! 预变性 5 m in; 94!
变性 40 s, 55! 退火 40 s, 72! 延伸 1 m in, 运行 35
个循环;最后 72! 延伸 5m in, 电泳检测同上 (表 1)。
2 结果与分析
21 DNA浓度及质量检测
采用 Eppendorf紫外分光光度计对 DNA质量进
行检测, 发现所提取的湿地松、加勒比松 DNA浓度
在 02 g /L以上, OD260 /OD280的值基本介于 18
和 19之间, 且提取的 DNA均为白色絮状沉淀,溶
液清亮,无粘稠感,说明 DNA溶液中基本无蛋白质、
多糖和酚类等杂质的污染, 质量较高 (表 2)。分别
取样品 5 L通过 08%的琼脂糖凝胶电泳检测质
量,以 1 TAE缓冲液,电泳至指示剂溴酚兰距底端
约 1 cm处结束。结果表明, 此方法所提 DNA分子
量达 20 kb以上, 点样孔不发亮,说明基本无无多糖
污染, DNA主带清晰, 只有有少量 RNA污染, 纯度
相对较高 (图 1)。
表 2 DNA质量检测结果
材料 ( g/L) OD 260 OD280 OD 260 /OD 280
PEEB022 0527 0207 0113 182
PEEA07 0435 0171 0092 186
PCHL01 0678 0266 0150 177
PCHL02 0314 0123 0067 184
PCBPCB04 0306 0120 0068 177
PCCPCC1 0239 0094 0049 190
22 SSR引物扩增结果
随机选择利用上述方法提取的 4个 DNA样本
进行 SSR分析 (图 2) ,尽管用快速方法提取的 DNA
中有少量 RNA污染等,但是并不影响 PCR扩增, 获
得的 SSR电泳图谱, 条带清晰, 分布均匀, 多态性
好, SSR分析结果没有影响, 由此可知, 用改良的
CTAB法快速提取的湿地松、加勒比松 DNA质量完
全可以满足利用 SSR分子标记的要求。
3 讨论
近年来随着分子标记研究的发展, 人们利用分
子标记相继开展了植物的种质资源研究、遗传图谱
构建和 QTL定位等研究,而如何保证分子标记检测
效率取决于 DNA的质量, 各种分子标记对 DNA的
质量要求不同,如何在保证 DNA质量的前提下尽快
提取各种分子标记所需 DNA成为完成此类研究的
前提,因此,不同标记的 DNA快速提取的方法先后
得到研究。目前用的比较多的主要有 CTAB法和
SDS法。如王灏等 [ 10]就优化和建立了无液氮处理,
可用于 RAPD分析的油菜总 DNA的提取方法;关荣
霞等 [ 11]开发了一种可从大豆种子及叶片中快速提
取 DNA的方法, 既节省时间, 又可获得供上百次
PCR扩增使用的 DNA, 并用于大豆 SSR分析; 沙红
等 [ 12]采用几种方法对甜菜 DNA提取试验表明,
CTAB法是甜菜 RAPD分子标记研究的最佳 DNA
提取方法; 葛建镕等 [ 13 ]用改良 CTAB法、SDS法和
碱提法在不用液氮研磨情况下,分别提取玉米 (Z ea
may s L )、水稻 (Oryza Sativa L innaeus )、大豆和高
粱 (Sorghum vu lgare Pers) 4种农作物种子 DNA并
用于 RAPD、SSR标记检测。
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 1期
本研究利用使用 RETSCH MM400混合球磨仪
破碎植物组织, 采用用改良 CTAB法提取基因组
DNA,具有如下优点: ( 1)采用改良 CTAB法提取样
品 DNA,在 DNA沉淀时有效地去除了多糖; 添加了
PVP去除了酚类等次生物质, 获得了较高质量的
DNA,避免了使用有害溶剂 ∃ 苯酚,减轻对人体的伤
害;不用 Rnase, 减少试验步骤, 缩短了时间, 降低
DNA的损失。 ( 2)采用一步氯仿的抽提,简化了操
作步骤的同时节约了时间,提高了 DNA的回收率。
( 3)采用 RETSCH MM400 DNA提取仪对材料进行
研磨, 大大加快了样品的研磨速度,每次可研磨样品
48个,最多只需要 5 m in, 加上 CTAB法的步骤, 提
取 48个样品仅用 1 h, 是普通方法 [ 14]提取速度的 5
倍左右,一个工作日可提取 300个样品以上,能够完
成一个比较大的构图群体对 DNA的需要。同时所
提 DNA分子量达 20 kb以上, 而且每个样品 DNA
得率达 20- 60 g, 可进行几百次 PCR反应, 优势
明显。 ( 4)使用 RETSCH MM 400DNA提取仪在同
一时间 (同一工作日 )内完成, 尽量减小了材料间
DNA提取的浓度差异。 ( 5)从微卫星 DNA扩增结
果可以看出, 以改良 CTAB法提取的 DNA为模板
扩增条带清晰、稳定, 该方法获取的 DNA更适于
湿地松、加勒比松 SSR分子标记研究。研究的开
展为 SSR技术的规模化快速分析和应用奠定了
基础。
参 考 文 献
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