全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 6期
桃多聚半乳糖醛酸酶基因的 cDNA克隆及序列分析
陈鑫 1 　李唯 2 　王旺田 2 　杨德龙 2
(1 甘肃农业大学农学院 , 兰州 730070; 2 甘肃农业大学生命科学院 ,兰州 730070)
　　摘 　要 : 　以白粉桃成熟果实为材料 ,用 Trizol法提取桃总 RNA,根据已发表的多聚半乳糖醛酸酶 ( PG)基因的序列设计
合成一对特异引物 ,经 RT2PCR扩增出一条 1 188 bp的目的片段 ,包括一个 393个氨基酸组成的开放阅读框。通过 TA克隆 ,
把它连接到 pGEM 2T vector上。PCR、酶切鉴定后进行基因测序 ,结果表明所克隆的 PG基因与 GenBank中 肥城桃 PG基因序
列 (AF095577)同源性为 98165% ,相应的氨基酸的同源性为 97146% ,说明此片段为桃 PG基因片段。
关键词 : 　桃 　多聚半乳糖醛酸酶 　RT2PCR　克隆
Clon ing and Sequenc ing of cDNA of Polygalacturonase in Peach
Chen Xin1 　L i W ei2 　W ang W angtian2 　Yang Delong2
(1 College of Agronom y, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070; 2L ife2Science Institute of Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070)
　　Abs trac t: 　Total RNA was extracted from mature fruits of Baifen peach by Trizol method1 By using the specific p rimers designed
from the PG gene in GenBank, a fragment about 1 188 bp with an open reading frame of 393 am ino acids was p roduced by RT2
PCR1The amp lified fragment was cloned into pGEM 2T vector and was identified by sequence analysis after PCR and restriction en2
zyme1The cDNA nucleotide sequence and deduced am ino acid sequence were highly homologous to the reported peach PG cDNA1Thus,
this fragment was p roved as PG gene fragments of Peach1
Key wo rds: 　Peach　Polygalaturonase　RT2PCR　Clone
收稿日期 : 2009201204
基金项目 :甘肃省科技厅计划项目 (0708NKCA070)
作者简介 :陈鑫 (19842) ,女 ,陕西西安人 ,在读硕士 ,主要从事转基因研究 ; E2mail: chenxin_0219@1261com
通讯作者 :李唯 (19552) ,男 ,甘肃成县人 ,博士 ,教授 ,主要从事作物组织培养与种质改良等相关研究 ; E2mail: liwei@gsau1edu1cn
　　多聚半乳糖醛酸酶 (polygalacturonase, PG)是一
种细胞壁结合蛋白 ,可以催化果胶分子中α21, 42聚
半乳糖醛酸的裂解 ,参与果胶的降解 ,使细胞壁结构
解体 ,导致果实软化 [ 1 ]。植物的 PG基因首先从番
茄中得到克隆 [ 2 ] , PG基因的导入不能推迟果实软
化 ,但转基因果实的加工性能有所改善 ,且能抵抗继
发性真菌的感染。研究人员利用反义 RNA技术获
得的番茄植株果实中 PG基因表达被抑制 ,从而成
熟果实中果胶溶解降低 [ 3 ]。此后近十年中 ,先后从
不同植物中得到 PG基因和 cDNA克隆序列 ,如苹
果、鳄梨、番茄、棉花、玉米、草莓、烟草 [ 4～9 ]。
白粉桃为兰州特产 ,品质优良 ,但果实成熟后软
化速度快 ,不耐贮运 ,是制约该桃生产和经济效益充
分发挥的主要因素。基于上述原因 ,根据马庆虎报
道的桃 PG cDNA核苷酸序列 ,以白粉桃成熟果实的
mRNA为模板 ,利用 PT2PCR技术克隆了一个 1 188
bp的 PG基因 cDNA片段 ,命名为 pGEM 2PG。本研
究通过对白粉桃 PG基因的 cDNA 克隆与序列分
析 ,为采用反义技术选育耐贮性的桃品种 ,研究果实
成熟机理 ,促进桃的生产方面奠定研究基础。
1　材料与方法
111　材料
11111　供试材料 　白粉桃成熟果实采自甘肃省兰
州市安宁区兴隆苗圃。
11112　供试试剂　反转录酶 PrimeScrip tTM RNase、Taq
酶购自 Fermentas公司 ;限制性内切酶 Sac I、B amH I购
自大连宝生物工程公司 ; Trizol试剂购自上海生工生物
技术有限公司 ;DNA回收试剂盒、DNA Marker DL15000
购自北京百源基因有限公司 ;氨苄青霉素 (Amp )为
Amresco公司产品。
2009年第 6期 陈鑫等 :桃多聚半乳糖醛酸酶基因的 cDNA克隆及序列分析
11113　载体及菌株 　pGEM 2T Simp le Vector克隆载
体购自 Promega公司 ;大肠杆菌菌种 DH5α由本实
验室保存。
11114　引物　PG基因引物参照 NCB I网站中发布的
序列设计 (登录号 : AF095577) ,在引物 5′端分别加入
Sac I和 B am H I酶切位点 ,由上海生工生物技术有限
公司合成。 PG1: 5′2GCGAGCTCGTTAATGGCGAAC2
CGTAG23′; PG2: 5′2GCGGATCCCTCTACAAACAACTT2
GTAGGC23′。
112　方法
11211　桃总 RNA的提取及电泳检测 　取 - 70℃保
存的白粉桃成熟果肉 012 g,按照 Trizol试剂盒说明
书步骤提取总 RNA。RNA电泳检测采用 1%的琼
脂糖凝胶电泳。
11212　RT2PCR体系 　按反转录试剂盒说明进行 ,
在 PCR管中加入 5 μl的 RNA, O ligo ( dT) 18 ( 215
μM ) 1μl, DEPC处理 ddH2 O 6μl,混匀后 ,于 70℃
水浴保温 5 m in。保温后立即置冰上 ,加入 4μl 5 ×
reaction buffer, 1μl RNase inhibitor ( 20 U /μl) , 2μl
10 mM dNTP,混匀后轻微离心 ,于 37℃温浴 5 m in,
在冰上加入 1 μl MLV2RT ( 200 U /μl) , 42℃ 60
m in, 70℃10 m in, 4℃取出。
11213　PCR 体系 　PCR 反应体系为 25 μl: 10 ×
PCR buffer 215μl; MgCl2 115μl; dNTP 2μl; PG21、
PG22各 015 μl ;模板 cDNA 1 μl; Taq酶 015 μl;
ddH2 O补至 25μl。 PCR 反应条件 : 95℃预变性 5
m in; 94℃变性 1 m in, 56℃退火 1 m in, 72℃延伸 75
s, 30个循环 ;再 72℃10 m in; 4℃保存。1%的琼脂
糖凝胶电泳检测。
11214　电泳 　PCR扩增产物用 1%琼脂糖凝胶电
泳检测 ,电极缓冲液为 1 ×TAE,电压 120 V ,电泳 30
m in,用 EB染色 ,以 DL2000为 PCR Marker,目的片
段用 DNA回收试剂盒回收。
11215　PCR产物与 pGEM 2T载体的连接反应 　10
μl连接反应体系 : 2 ×buffer 5μl, pGEM 2T vector 1
μl,纯化 PCR产物 3μl, T4 DNA连接酶 1μl。16℃
保温 14～16 h。
11216　重组载体的构建、筛选及鉴定 　将连接产物
转化大肠杆菌 DH5α感受态细胞 ,接种到含有 Amp i2
cillin / IPTG/X2Gal的固体 LB平板上 ,培养 14～16 h,
用蓝白斑进行初步筛选 ,挑蓝斑和白斑单菌落于氨苄
青霉素抗性的 LB液体培养基中 , 37℃ 280 r/m in震荡
培养过夜 ,划线保存菌 ,碱法提取质粒 ,用蓝斑做对照
进行电泳 ,筛选滞后质粒 ,初步判断提取的质粒是否
含有外源基因。用 PCR和酶切检测法鉴定重组质
粒 ;将含有目的片段的重组质粒记作 pGEM2PG,重组
子阳性克隆菌单菌落再摇菌 ,培养物制备 20%甘油
管 ,送交测序公司进行测序 ,序列同源性由 DNAMAN
软件完成。
2　结果与分析
211　总 RNA质量分析
用 1%琼脂糖电泳检测白粉桃果肉总 RNA ,可
观察到 28 S、18 S和 5 S三条电泳条带 ,条带完整清
晰 ,且 28 S的亮度是 18 S的两倍左右 ,表明所提取
总 RNA完整性较好 ,没有降解。紫外分光光度法测
得 OD260 /OD280的比值介于 118～210,表明总 RNA
的纯度较高 ,没有糖、蛋白质和 DNA等污染 (图 1)。
图 1　总 RNA琼脂糖凝胶电泳图
212　cDNA的合成和 PCR扩增
以白粉桃成熟果实 mRNA 为模板 ,通过 RT2
PCR技术扩增 PG基因 ,电泳检测结果 (图 2)显示 ,
扩增片段大小约为 112 kb,与预期大小一致。
213　重组子的筛选与鉴定
对扩增得到的预期片段采用切胶回收法回收 ,
连接到克隆载体 pGEM 2T Simp le Vector上 ,导入宿
主菌大肠杆菌 DH5α,经蓝白斑筛选、滞后质粒鉴定
后 ,其重组质粒用 PCR扩增方法 (图 3的 1～3泳
道 )和酶切方法进行鉴定均得到分子大小符合的片
段 ,说明扩增片段已成功连接于 pGEM 2T Simp le
Vector载体中。
79
生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 6期
M1DL15000 Marker; 1～41PCR产物
图 2　PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳
1～31pGEM2PG重组质粒 PCR结果 ; 4～61pGEM2PG重组质粒双酶
切结果 ;M1DL15000 Marker
图 3　重组质粒 pGEM 2PG的 PCR和酶切鉴定
214　测序及序列分析结果
图 4　桃 PG基因测序结果
含 PG基因的 pGEM 2PG重组质粒送公司测序 ,
结果经 DNAMAN分析软件进行同源性比对 ,显示得
到的核苷酸序列与 GenBank中已经登录的肥城桃
PG基因序列同源性为 98165% ,表明此片段为桃
PG基因片段。说明提取的 RNA可以满足基因克隆
和表达研究的需要 (图 4)。
3　讨论
在分子生物学研究中。获得高纯度且完整性好
的核苷酸序列是基因克隆、表达等研究的前提。本
研究采用 Trizol试剂盒提取桃果实的总 RNA,其纯
度和完整性良好 ,经 RT2PCR、酶切、测序检测 ,显示
提取的 RNA可以满足基因克隆和表达的需要 ,同时
证明白粉桃果实中存在 PG基因的正确性。
为提高测序的精确度 ,随机选取了 3个独立的
克隆 ,分别从两端进行测序 ,获得 3个 PG基因 cD2
NA的核苷酸序列 ,从中选出一个核苷酸差异较少
的序列并推导了氨基酸序列。该克隆片段全长
1 188 bp,含 1 179个核苷酸组成的开放阅读框 ,这
个开放阅读框架从 5′端 ATG开始 ,终止于第 1 179
个核苷酸。本试验所克隆的白粉桃 PG基因 cDNA
核苷酸序列与马庆虎等报道的肥城桃 PG基因 cD2
NA核苷酸序列相比较 ,有 16个碱基的差异 , 10个
氨基酸差异 ,其中有 2个极性氨基酸转变为 2个非
极性氨基酸 , 3个非极性氨基酸转变为 3个极性氨
基酸 , 1个极性带正电荷氨基酸转变为极性不带电
荷氨基酸 ,其它氨基酸的极性没有发生改变。其核
苷酸序列与推测的氨基酸序列同源率分别为
98165%和 97146%。但是碱基的突变及氨基酸的
变异说明桃品种不同 ,则 PG基因也存在差异 ,说明
PG基因存在多态性 ,这一点同李惠 [ 10 ]在番茄研究
中的结论具有相似性。
导致这些突变的原因大概有两个方面。第一 ,
PCR扩增时可能产生的错误 ,在 PCR过程中变性温
度、退火温度、延伸温度都会影响特异性 ,本试验用的
是普通 Taq酶 ,不像高保真酶能保证有较高的可靠
性 ;第二 ,同一物种不同品种之间的单核苷酸可能存
在差异。但个别碱基的不同将不会影响反义 RNA转
录及对靶基因的专一性的抑制。本试验已获得了白
粉桃 PG基因 cDNA克隆 ,为下一步反义 RNA表达及
其在果实成熟中的作用的研究奠定了基础。
参 考 文 献
1　寇晓虹 ,罗云波 1生物技术通报 , 2003, 5: 15～181
89
2009年第 6期 陈鑫等 :桃多聚半乳糖醛酸酶基因的 cDNA克隆及序列分析
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(上接第 95页 )
参 考 文 献
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3　Mathilde O, Anne K, Francoise DV1 Plant Physiology, 2002, 129:
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4　 J iang X, Hao DL, W ei HW , et al1 Cell, 2006, 125: 1347～13601
5　 Chen ZH, Jenkins GI, N immo HG1 Plant Cell Physiol, 2008, 10
(1093) : 1571
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7　陈忠良 , 林飞影 1福建分析测试 , 2007, 16 (3) : 58～601
8　郭新红 , 王婕 , 刘选明 , 等 1西北植物学报 , 2008, 28 (4) : 675 ～67919　 Dom inique L, Uwe L, N icolaus V, et al1 Plant Physiology, 2005,137: 671～680110　Marla TN, Elena G, Em ilio F, et al1 Plant Physiology, 2000, 122:283～289111　Siddiqi M, Glass AD, Ruth TJ1 Plant Physiol, 1990, 93: 1426～1432112　W ang MY, SiddiqiMY, Ruth TJ, et al1 Plant Physiol, 1993, 103:1259～1267113　Loque D, Ludewig U, Yuan L, et al1 Plant Physiol, 2005, 137:671～680114　Loque D, Yuan L, Kojima S, et al1 Plant J, 2006, 48: 522～534115　Yuan L, Loque D, Kojima S, et al1 Plant Cell, 2007, 19: 2636～26521
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