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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 7 期
小麦叶片类囊体膜蛋白复合体的分离和分析技术研究
向小聪1，2 孟庆石2 鲍锦库1 潘映红2
(1四川大学生命科学学院，成都 610065;2中国农业科学院作物科学研究所 国家农作物基因资源与基因改良重大科学工程，北京 100081)
摘 要: 膜蛋白复合体在生命活动中执行着重要的生物化学功能，具有重要的研究意义，但由于其低表达和高度疏水
的特点，完整状态和低丰度的膜蛋白复合体的分离分析仍是一大挑战。首先，采用蓝绿温和胶非变性电泳作为第一维分离技
术，大量分离制备叶绿体类囊体膜蛋白复合物;其次，采用电洗脱方法差异富集第一维电泳分离到的各种蛋白复合体;最后，
采用 SDS-PAGE作为第二维分离技术，分析差异富集的不同种蛋白复合体的亚基构成。研究结果表明，利用这种分离分析模
式，能有效地富集膜蛋白复合体尤其是低丰度膜蛋白复合体，明显提高第二维分离分析的分辨率和蛋白覆盖率。
关键词: 蓝绿温和胶电泳 类囊体膜蛋白复合体 电洗脱 SDS-PAGE 低丰度
Technological Study on Separation and Analysis of Thylakoid
Membrane Protein Complexes from Wheat Leaves
Xiang Xiaocong1，2 Meng Qingshi2 Bao Jinku1 Pan Yinghong2
(1College of Life Science，Sichuan University，Chengdu 610065;2The National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement，
Institute of Crop Science，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081)
Abstract: Membrane protein complexes perform important biochemical function in cellular process，but the analysis of membrane
protein complexes is a significant challenge due to their hydrophobic properties and relatively low abundance． In this study，blue-native
polyacrylamide gel electrophoresis(BN-PAGE)was used to separate and prepare a large number of chloroplast thylakoid membrane pro-
tein complexes in the first dimension． Then，electroelution was performed to differentially enrich various native protein complexes separa-
ted in the first dimension． Electroeluted protein complexes were analyzed to determine the subunit composition with sodium dodecyl sul-
fate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)in the second dimension． The application of the BN /SDS-PAGE strategy to the
separation and analysis of membrane protein complexes，especially in relative low-abundance，demonstrated that a high resolution and
protein coverage was achieved by enrichment of low-abundant membrane protein and separation of complexes subunits in the second -di-
mensional SDS /PAGE．
Key words: BN-PAGE Thylakoid membrane protein complexes Electroelution SDS-PAGE Low-abundance
收稿日期:2011-03-25
基金项目:国家自然科学基金项目 (30971874) ，国家“863”高技术研究发展计划项目(2008AA10Z115) ，转基因生物新品种培育科技重大专项
(2009ZX08012-011B)
作者简介:向小聪，女，硕士研究生，研究方向:蛋白质组学;E-mail:xxc8753@ yahoo． cn
通讯作者:潘映红，男，研究员，E-mail:pyh51@ yahoo． com． cn
生物体中的蛋白质主要是通过蛋白与蛋白间的
相互作用方式发挥其功能［1］，大多数相互作用的蛋
白以结合态的复合体形式存在［2］，如在膜系统上，
蛋白复合体执行着呼吸作用，信号转导和分子传递
等重要的生物学功能［3］。通过蛋白复合体的研究，
可以揭示体内蛋白的互作关系和真实的动态变
化［4］，但分离分析完整状态的蛋白复合体仍是当前
研究工作的难点之一［5］，特别是低丰度和高度疏水
性膜蛋白复合体研究所面临的难度更大［6 － 8］。
建立适宜的技术方法是开展蛋白复合体研究的
关键。许多传统的方法被用于膜蛋白复合体的分离
分析，如基于液相色谱的多维 LC MS /MS［9，10］、免疫
共沉淀［11］、标签或串联亲和纯化［12］、以及基因枪蛋
白组学［13，14］。但是，由于膜蛋白丰度低，在纯化过程
中易损失且亚基容易解聚，这些方法仍然存在很大的
局限性。
2011 年第 7 期 向小聪等:小麦叶片类囊体膜蛋白复合体的分离和分析技术研究
基于凝胶的非变性电泳技术已发展为当前蛋白
复合体分离的主要技术方法，如非变性等电聚焦电
泳［15］、蓝绿温和聚丙烯酰胺凝胶电泳(BN-PAGE)［16］、
清澈温和非变性凝胶电泳(CN-PAGE)［17］和高分辨清
澈温和非变性凝胶电泳(HrCN-PAGE)［18］等，其中 BN-
PAGE 技术已被广泛用于膜蛋白复合体的分
离［16，19 －22］。在这些方法基础上建立起来的二维电泳技
术，比如 BN/BN-PAGE［23］，hrCNE/SDS-PAGE［24］，IEF/
SDS-PAGE［25］和 BN/SDS-PAGE［26］已广泛用于分离分
析膜蛋白复合体。通过优化膜组分制备和膜蛋白复
合体抽提技术，结合第一维 BN-PAGE 分离和第二
维 SDS-PAGE分离，可以实现低丰度和高度疏水性
膜蛋白复合体如植物类囊体蛋白复合体的富集与分
离分析［27 － 29］，但实际研究显示，第一维 BN-PAGE分
离出的各种蛋白复合体常存在较大的浓度差异，直
接进行第二维 SDS-PAGE分离极容易损失丰度较低
的复合体的信息。
为了更深入全面地开展膜蛋白复合体研究，本
研究将在已经建立一套分离分析小麦叶片叶绿体类
囊体蛋白复合体的系统流程(Meng，et al． 待发表)
的基础上，通过电洗脱技术富集第一维 BN-PAGE
分离到的低丰度蛋白复合体，提高第二维 SDS-
PAGE分离分析的分辨率和蛋白覆盖率。
1 材料与方法
1. 1 材料
将小麦(Triticum aestivum)Taichuang29 种子用
0. 1%的双氧水 20℃下浸种 2 d后，播于花盆中在恒
温 20℃的温室培养并每天给予 16 h的光照。以 7 d
小麦幼苗叶片为材料提取叶绿体。
1. 2 方法
1. 2. 1 完整叶绿体的提取 取 20 g 叶片剪碎后，加
入 100 mL 4℃预冷的提取缓冲液(330 mmol /L 山梨
醇;50 mmol /L Hepes-KOH，pH7. 8;5 mmol /L EDTA;
5 mmol /L EGTA;1 mmol /L 氯化镁;10 mmol /L 碳酸
氢钠;1. 9 mmol /L 抗坏血酸和 1 mmol /L 苯甲基磺
酰氟(PMSF)用时再加)。用匀浆机低转速匀浆
3 min，4 层纱布过滤;2 000 r /min 离心 5 min去除细
胞碎片，上清经 5 000 r /min 离心 15 min(Sorvall
RC6，SLA-1500) ，得到的沉淀悬浮于提取缓冲液中，
悬浮液置于预先铺好的蔗糖梯度(30% /40% /60%，
W/W) ，水平离心 13 200 r /min，1 h(Beckman Optima
L-100 XP SW 32Ti)。收集位于 40%和 60% 间的绿
色部分即完整的叶绿体，用提取缓冲液洗 2 － 3 次以
去除多余的蔗糖。
1. 2. 2 类囊体膜蛋白的制备 用低渗缓冲液(50
mmol /L Hepes-KOH，pH7. 8;10 mmol /L EDTA;2
mmol /L 氯化镁)将完整叶绿体在冰上涨破，8 000
r /min 离心 5 min，得到的沉淀为类囊体。将类囊体
悬浮于裂解缓冲液(20 mmol /L Bis-Tris，pH7. 0;500
mmol /L 6-氨基己酸;20 mmol /L NaCl;2 mmol /L ED-
TA;10%甘油;1 mmol /L PMSF) ，加入 10%去污剂
十二烷基麦芽糖苷(DDM)使其终浓度为 1%，冰上
放置 30 min后，42 900 r /min 超速离心 1 h，弃不溶
性沉淀，上清即为类囊体膜蛋白复合体，用于非变性
电泳。
1. 2. 3 第一向 BN-PAGE 分别配制 1 mmol /L 厚
制备型和 0. 75 mmol /L厚分析型 4% － 15% (W/V)
(Protean II xi cell electrophoresis system，Bio-Rad)梯
度的聚丙烯酰胺分离胶，3. 5%的浓缩胶［30］，凝胶中
含有 0． 1%DDM。上清加入溶于裂解缓冲液的 10%
考马斯亮蓝 G250 使其终浓度为 0． 1%，充分混匀
后，进行电泳。电泳在 4℃下进行，阴极缓冲液为 50
mmol /L Tricine，15 mmol /L Bis-Tris，pH7. 0，0. 01%
(W/V)G250。阳极缓冲液为 50 mmol /L Bis-Tris，
pH7. 0。当电泳一半时，用不含 G250 的阴极缓冲液
取代阴极缓冲液。
1. 2. 4 电洗脱蛋白 电泳完后，切下制备型 BN 胶
的目的蛋白带，用 SDS-PAGE电泳缓冲液(25 mmol /L
Tris，192 mmol /L 甘氨酸，1% SDS)平衡 30 min，室
温下进行电洗脱(165-1250 Whole Gel Eluter，伯乐)
30 min，恒流为 200 mA。
1. 2. 5 第二向 SDS-PAGE 收集电洗脱蛋白样品，
丙酮沉淀，沉淀用增溶液(7 mol /L 尿素，2 mol /L 硫
脲，1. 5%DTT)裂解后，加入上样缓冲液并在室温条
件下放置 30 min，点样于含 8 mol /L尿素，分离胶浓
度为 12%的 SDS-PAGE，恒压为 80 V。电泳完后，用
考马斯亮蓝 R250 染色。
对于分析型 BN胶，切下一个完整的泳道用平衡
液(6 mol /L 尿素;4. 0% SDS;25%甘油;140 mmol /L
Tris-HCl，pH6. 8;5% β-巯基乙醇)在室温平衡
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30 min，将胶条旋转 90℃水平放置于预先配好的含
8 mol /L 尿素的 12%的 SDS 胶上方，紧密接触防止
胶接触界面产生气泡。100 V 恒压电泳 30 min，再
恒压 150 V 直至溴酚蓝跑至凝胶底部，停止电泳。
电泳完后，用考马斯亮蓝 R250 染色。
2 结果与分析
2. 1 叶绿体组分的富集
在提取叶绿体时，以新鲜叶片为材料，低转速间
歇匀浆以保证细胞在大量破碎的情况下，释放更多完
整的叶绿体。在低速离心去除一部分细胞残留碎片
后，再高速离心以沉淀叶绿体。用提取缓冲液悬浮粗
叶绿体后，平铺于预先铺好的用不含山梨糖醇的提取
缓冲液配制蔗糖梯度(30% /40% /60%，W/W)顶部。
用超速离心机水平离心后，会出现两个明显的绿色条
带，位于上层的条带为破碎的叶绿体，下层的条带为
完整的叶绿体，小心收集 40%与 60%间的叶绿体，用
提取缓冲液洗涤两次以去除多余的蔗糖后，得到的沉
淀为干净的完整叶绿体。通过差速离心和不连续蔗
糖梯度分离和富集叶绿体，提高了后续分离蛋白即低
丰度的类囊体膜蛋白复合体的检出率。
2. 2 膜蛋白复合体的裂解
用低渗溶液涨破叶绿体以释放类囊体，离心等
比富集类囊体后，要完全去除上清液体，以避免可溶
性蛋白对膜蛋白的污染以及对非变性电泳的影响。
用 BN-PAGE 样品制备液悬浮类囊体沉淀，加入蛋
白酶抑制剂 PMSF，以防止蛋白的降解。裂解缓冲
液必须是低盐浓度的缓冲液，低浓度的盐可以增加
膜蛋白的溶解性，而较高的离子浓度会导致蛋白在
凝胶上样孔堆积以及高浓度的膜蛋白聚集［31］。在
低离子浓度时，两性离子化合物 6-氨基己酸可以保
持溶液所需的离子强度以溶解和稳定膜蛋白复合
体［32］。低浓度的 6-氨基己酸和 EDTA 可以抑制蛋
白酶的水解作用。10%的甘油可以防止去污剂敏感
型的膜蛋白的解聚，在电泳过程中对蛋白起沉降作
用。裂解膜蛋白时，温和的去污剂的种类和浓度选
择很重要。一个理想的去污剂在保持膜蛋白的可溶
性状态的同时，不影响脂质双分子层包裹状态时的
功能、结构和热力学特性［33］。最佳的去污剂浓度不
仅能把膜蛋白从膜上解离下来，防止其聚集，还要保
持膜蛋白的复合体状态。在确定最佳的去污剂种类
和浓度后(Meng，et al．待发表) ，本试验加入裂解效
果较好的 10% DDM使其终浓度为 1%，冰上放置 1
h，以有效解离类囊体膜上的蛋白，并保证其复合体
状态，防止膜蛋白的聚集。超速离心去除不溶性蛋
白，以减少不溶性蛋白对非变性电泳的影响，所得上
清即为类囊体膜蛋白复合体。
2. 3 用蓝绿温和胶电泳分离小麦类囊体膜蛋白复
合体
用于蓝绿温和胶电泳的类囊体膜蛋白复合体在
点样之前，需加入 0. 5%的阴离子染料 G250。大量
的染料分子与疏水性膜蛋白结合后，使蛋白带上负
电荷而在电泳过程中向阳极移动。膜蛋白因表面大
量的负电荷而相互排斥，这在一定程度上减少了蛋
白的聚集;另一方面，膜蛋白与染料结合后失去了其
疏水特性而溶解性增加。因此，在 G250 与蛋白结
合后，BN 胶中不需要加去污剂，这不仅减少了电泳
过程中去污剂敏感型的蛋白的变性机率，还对膜蛋
白复合体的结构有保护作用［34］。膜蛋白在电泳中
的移动决定于所结合 G250 的负电荷以及蛋白复合
体的大小和形状。点样后，加入含 0． 01% G250 的
阴极缓冲液，以源源不断地补充蛋白在迁移过程中
损耗的 G250，在电泳一半时，更换阴极缓冲液为不
含 G250 的无色缓冲液，以降低凝胶的背景而能检
测到相互作用较弱的蛋白复合体。从图 1 可以看
出，1% DDM 增溶小麦类囊体膜蛋白后，能在蓝绿
温和胶中检测到 12 条主要条带。条带 5、7、9、11 是
含量比较高的膜蛋白复合体，其余的为丰度比较低
的蛋白，这些低丰度膜蛋白的研究是当前分离分析
技术面临的难点之一。
2. 4 复合体亚基的 SDS-PAGE
为了更进一步研究类囊体膜蛋白复合体，采用
经典的 BN /SDS-PAGE 技术对组成膜蛋白复合体的
亚基进行了第二维 SDS-PAGE 分离分析(图 2)。从
图 2 可以看出，膜蛋白复合体的各亚基分别按分子
量不同在 SDS胶内分开，得到的总亚基数为 40。在
第一维 BN-PAGE 分离了 12 条主要蛋白条带时，各
膜蛋白复合体在经平衡液处理后，解离成亚基蛋白。
平衡液中高浓度的尿素通过破坏疏水键和离子键使
蛋白去折叠增加了疏水性膜蛋白在胶内的溶解度，
同时断裂二硫键解聚膜蛋白复合体成亚基。SDS在
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图 1 类囊体膜蛋白复合体的 BN-PAGE 图谱
a． BN-PAGE分离的类囊体膜蛋白复合体;b． 水平转移
BN胶中蛋白到 SDS胶后亚基的分布情况
图 2 类囊体膜蛋白复合体的经典
二维 BN/SDS-PAGE图谱
解聚复合体的同时，与亚基蛋白结合增加蛋白的电
荷性，促进膜蛋白的溶解和在胶内的电泳移动性。
β-巯基乙醇还原二硫键而增加膜蛋白的溶解度。保
持膜蛋白的高度溶解性，使膜蛋白不易在第一向胶
内聚集，大大提高了膜蛋白进入第二向胶的转移率。
这种方法能够直观地看到膜蛋白复合体亚基的真实
位置，但是二维图上的亚基大多属于一维胶中浓度
较高的膜蛋白复合体的亚基，各低丰度的膜蛋白复
合体的亚基均未检测到。解决这一问题的方法是电
洗脱膜蛋白复合体进行差异富集，以提高低丰度蛋
白的电泳分辨率。
切取 BN 胶的 4 个复合体条带(5、9、10、11) ，在
SDS-PAGE 电泳缓冲液平衡 30 min后，进行电洗脱，
收集洗脱的蛋白进行电泳。平衡后，膜蛋白复合体
解聚成亚基，在与 SDS 结合后带负电荷，在洗脱过
程中向阳极移动。因为膜蛋白的溶解性较低，在配
制 SDS-PAGE 凝胶时，加入 8 mol /L 尿素增加膜蛋
白在凝胶内的溶解度，在蛋白点样时，膜蛋白与
SDS-PAGE 上样缓冲液充分混匀后，在室温下放置
30 min，膜蛋白与缓冲液中的 SDS 充分结合，溶解性
增加不易发生蛋白的聚集，提高 SDS-PAGE 的分辨
率。80 V 低电压电泳使电泳过程中产热减少，膜蛋
白不会发生热变性而影响分辨率。从图 3 可以看
出，各复合体蛋白所含亚基的数目和种类不同。复
合体蛋白 5 在解聚后形成 12 个亚基;复合体蛋白 9
解聚后形成 10 个亚基;复合体蛋白 10 在解聚后形
成 12 个亚基;复合体蛋白 11 在解聚后形成 10 个亚
基。在所选的 4 个蛋白复合体中，第二维的 SDS-
PAGE已检测到 44 个蛋白亚基;与经典的 BN /SDS-
5，9，10，11 分别为复合体蛋白 5、9、10、11 的亚基在含
8 mol /L 尿素的 SDS-PAGE分离
图 3 类囊体膜蛋白的第二维 SDS-PAGE图谱
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 7 期
PAGE相比，电洗脱方法富集低丰度膜蛋白能显著
提高二维电泳的分辨率和蛋白的覆盖率。
3 结论
由于膜蛋白表达量低和高度疏水的特点，分离
分析完整状态和低丰度的膜蛋白复合体面临较大的
困难。一般情况下，通过差速离心和不连续蔗糖梯
度等比富集膜组分，再使用适宜浓度的去污剂，从膜
上完整地解离出膜蛋白复合体并保持其溶解性，通
过非变性蓝绿温和胶电泳使膜蛋白在保持其复合体
状态的条件下得到良好的分离，然后直接进行第二
维 SDS-PAGE分析蛋白复合体的亚基构成。但在这
种经典的二维 BN /SDS-PAGE 电泳过程中，极容易
损失丰度较低的复合体的信息，即在第二维电泳中
很难检测到低丰度膜复合体的亚基。以小麦叶片类
囊体膜蛋白复合体为材料进行的研究表明，通过电
洗脱技术差异富集第一维电泳分离出的各种蛋白复
合体后，利用含尿素的 SDS-PAGE 电泳技术进行亚
基蛋白的分离分析，可明显提高分析的分辨率和蛋
白覆盖率，获得更多的低丰度膜蛋白复合体的信息。
该技术流程特别适用于低丰度膜蛋白复合体的分离
和分析研究，具有较广泛的应用前景。
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(责任编辑 李楠)
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