全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2013, 39(11): 2030−2038 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家自然科学基金项目(31271621), 江苏省普通高校自然科学研究计划项目(11KJA180001)和江苏高校优势学科建设工程项
目资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 陈国祥, E-mail: gxchen@njnu.edu.cn, Tel: 025-85891578
第一作者联系方式: E-mail: yeluhuan@hotmail.com, Tel: 15050589874
Received(收稿日期): 2013-03-04; Accepted(接受日期): 2013-06-09; Published online(网络出版日期): 2013-08-12.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20130812.1751.018.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2013.02030
两优培九剑叶衰老过程光合膜功能及蛋白质复合物的变化
叶露幻 1 沈唯军 1 郑宝刚 1 宋 涛 1 陈国祥 1,* 吕川根 2
1 南京师范大学生命科学学院植物资源与环境研究所, 江苏南京 210023; 2 江苏省农业科学院粮食作物研究所, 江苏南京 210014
摘 要: 为探讨高产杂交稻两优培九在衰老过程中, 剑叶光合膜蛋白质复合物的含量变化规律及其与光能吸收、转
化、传递的关系, 以大田栽培自然衰老剑叶为材料, 利用活体叶绿素荧光动力学技术, 并结合类囊体膜蛋白质复合物
蓝绿温和胶电泳分析。结果表明, 两优培九剑叶叶绿素含量、光合性能、类囊体膜蛋白稳定性等都在抽穗期达到顶
峰, 随后开始衰退, 在扬花期、灌浆期尚保持较高水平, 而进入籽粒成熟阶段衰退明显; 随着衰老进程, 光合膜蛋白
质复合物有序非同步降解, 稳定性为 LHCII > PSIIcore > PSIcore > ATPase & Cyt b6/f > LHCI; PSI和 PSII蛋白和相应
电子传递活性的稳定性及下降幅度差异较大; 衰老过程叶绿素 a/b 的不断下降与相对于反应中心更稳定的捕光天线
有关, 剑叶生长后期 LHCII 维持高水平保持了叶片对光能的吸收, 并可能在调节光系统间能量分布和协助过剩能量
耗散中起重要作用。
关键词: 两优培九; 衰老; 叶绿素荧光动力学; 光系统; 类囊体膜蛋白质复合物; 蓝绿温和胶电泳
Changes of Photosynthetic Membrane Function and Protein Complexes in Flag
Leaves of Liangyoupeijiu during Leaf Senescence
YE Lu-Huan1, SHEN Wei-Jun1, ZHENG Bao-Gang1, SONG Tao1, CHEN Guo-Xiang1,*, and LÜ Chuan-Gen2
1 College of Life Sciences, Nanjing Normal University, Nanjing 210023, China; 2 Institute of Food & Crops, Jiangsu Academy of Agricultural
Sciences, Nanjing 210014, China
Abstract: The purpose of this study was to explore the content variation of thylakoid membrane protein complexes and its
relationship with light absorption, transformation and transfer in flag leaves of high-yield hybrid rice Liangyoupeijiu during
senescence. A rice cultivar, Liangyoupeijiu was grown in the field. Through chlorophyll a fluorescence transient, physiological
and biochemical techniques, we studied the function of photosynthetic membrane. The content changes of thylakoid membrane
protein complexes were also investigated by Blue-native polyacrylamide gel-electrophoresis (BN-PAGE). The results showed that
chlorophyll content, photosynthesis and thylakoid membrane protein content of flag leaves rose and peaked at heading stage, then
began to decline. It still maintained a high level at flowering and filling stages, and the significant decline appeared untill the stage
of milky and wax ripeness. The stability of protein complexes (i.e. inverse degradation rate) during leaf senescence showed an
order of LHCII > PSIIcore > PSIcore > ATPase & Cyt b6/f > LHCI. Protein complexes and electron transport activity of PSI
declined later but more quickly than those of PSII. The decreased chlorophyll a/b ratio could be explained by the relative
enrichment of light-harvesting antenna to reaction center with leaf senescence. The stable LHCII kept the high level of absorbing
energy in the late of flag leaf growth, which may play an important role in adjusting the energy distribution and dissipation during
leaf senescence.
Keywords: Liangyoupeijiu; Senescence; Chlorophyll fluorescence kinetics; Photosystem; Thylakoid membrane protein com-
plexes; Blue-native PAGE
在水稻生长过程中, 叶片衰老是伴随生殖生长
进程而必然发生的, 衰老发生的早晚、衰老进程的
急缓会严重影响水稻的产量 , 特别对于杂交水稻 ,
早衰已成为限制其产量进一步提高的重要因素[1]。
第 11期 叶露幻等: 两优培九剑叶衰老过程光合膜功能及蛋白质复合物的变化 2031


叶片光合性能下降和光合机构改变是衰老最典型的
特征, 衰老与叶绿体类囊体膜即光合膜各个色素蛋
白质复合物和相关电子载体中的一系列光能吸收、
转化、传递过程的变化密切相关。
两优培九具有产量高、米质优和抗性强等优点,
其功能叶片叶绿体结构优势明显, 全展初期类囊体
数量丰富且结构稳定, 基粒类囊体膜垛叠程度高[2],
光能转化和被膜转运光合产物的能力较强, 但在生
育后期易出现早衰现象, 特别在低温或水分逆境条
件下更明显[3]。剑叶是两优培九功能期最长、衰老
最晚、对产量影响最大的叶片[4], 对于其衰退进程相
关光合作用效率、抗氧化系统、光合暗反应关键酶、
叶绿体超微结构和类囊体膜脂肪酸成分变化等已有
相关报道[5-7], 但对光合膜功能性大分子蛋白质复合
物的变化及其与衰老过程光反应变化间的相互关系
还有待进一步探索。
类囊体膜主要有 4 种高丰度的多亚基膜整合蛋
白质复合物, 即光系统 I (Photosystem I, PSI)、光系
统 II (Photosystem II, PSII)、细胞色素 b6/f 复合体
(cytochrome b6/f complex, Cyt b6/f)和 ATP合酶复合
体(ATP synthase complex, ATPase)[8], 这些复合物参
与完成原初光化学反应、电子传递和光合磷酸化 ,
并为叶绿体囊腔酶系统完成卡尔文循环提供 ATP与
还原力。为分离这类疏水性强的大分子膜蛋白 ,
Schägger等 [9] 建立了蓝绿温和凝胶电泳系统 (blue-
native polyacrylamide gel-electrophoresis, BN-PAGE),
利用该技术可以近似天然的形态分离复合物, 真实
反应复合体的大小、数量、组成及相对丰度等。目前
BN-PAGE 常用于拟南芥、水稻等叶绿体突变型的类
囊体膜构成分析 [10-11], 而关于对水稻类囊体膜蛋白
组分响应衰老等逆境的过程性变化研究尚较少。
本研究利用无损伤叶绿素荧光动力学技术和离
体光合电子传递活性反应测定技术, 分析两优培九
剑叶类囊体膜在田间自然衰老进程中的功能变化 ,
并结合蛋白质复合物的蓝绿温和胶电泳分离, 从蛋
白质水平分析和解释这些变化, 为两优培九生殖后
期的衰老特性提供理论补充。
1 材料与方法
1.1 试验材料
杂交稻两优培九种子由江苏省农业科学院粮食
作物研究所提供, 2011年和 2012年在其试验基地大
田栽培, 5月中旬播种, 6月中旬栽插, 常规水作管理,
及时防治杂草和病虫害。从剑叶全展起每隔 9 d 于
上午 10:00左右测定指标, 并采集剑叶, 及时以鲜叶
实验, 或者将完整叶片−80℃冷冻保存备用。采样从
8 月中旬起至 9 月底止, 于拔节孕穗期(剑叶刚全
展)、抽穗期、扬花期、灌浆期、乳熟期、蜡熟期采
样。到 10月两优培九进入完熟期剑叶已全黄或枯萎
衰亡, 故不再取样分析。
1.2 叶片叶绿素含量测定
参照 Arnon[12]的方法稍做改动。取 0.1 g 去中
脉剑叶加入预冷的 80%丙酮充分研磨成匀浆, 6000
转 min−1冷冻离心 10 min留上清液, 继续用 80%丙
酮洗涤沉淀 1~2 次, 至沉淀灰白色, 将每次离心的
上清液混匀定容至 10 mL, 用 Thermo GENESYS
10UV紫外-可见分光光度计测定 645 nm和 663 nm
吸光值。设立 5组重复, 每组测量 5次, 取平均值。
1.3 叶绿素荧光动力学参数测定
使用英国 Hansatech 公司连续激发式荧光仪
Handy PEA 测定剑叶荧光参数。于上午 10:00 左右
暗适应叶片 20 min, 用 3000 μmol m−2 s−1饱和红闪
光照射, 仪器自动记录从 10 μs到 1 s之间高分辨率
间隔荧光信号, 测得叶绿素荧光诱导参数。每次随
机选用 20片叶, 测定重复 3次。利用配套软件 PEA
Plus V1.04 处理分析数据。参考 Strasser 等[13]和魏
晓东等[14]的方法计算相关参数。
1.4 类囊体膜电子传递活性测定
参照 Dunahay等[15]的方法加以改进制备类囊体
膜。称取 2 g去脉剑叶于研钵中, 加入预冷的缓冲液
B1 (0.4 mol L−1 Sucrose, 2 mmol L−1 MgCl2, 0.2%
BSA, 20 mmol L−1 Tricine pH 8.0), 冰浴研磨, 4层纱
布过滤; 滤液经 300×g冷冻离心 2 min去除组织沉淀,
再经 4000×g冷冻离心 10 min, 得破碎叶绿体沉淀; 沉
淀与缓冲液 B2 (0.15 mol L−1 Sucrose, 5 mmol L−1 MgCl2,
0.2% BSA, 20 mmol L−1 Tricine pH 8.0)匀浆, 以 4000×g
冷冻离心 10 min得沉淀; 再用 B3 (15 mmol L−1 NaCl,
5 mmol L−1 MgCl2, 20 mmol L−1 MES pH 6.5) 匀浆,
即得类囊体膜悬浮液; 参照 Coombs等[16]的方法, 在反
应基质(0.2 mol L−1 Sucrose, 5 mmol L−1 MgCl2, 5 mmol L−1
NaCl, 5 mmol L−1 NH4Cl, 25 mmol L−1 Tricine-NaOH
pH 7.6)中加入不同反应介质、电子传递抑制剂、人
工电子受体和等叶绿素浓度的类囊体膜悬浮液, 用
Hansatech Chlorolab-2 Clark型液相氧电极测定电子
传递链活性。
1.5 完整叶绿体提取
参照 Chen 等 [11] 的方法加以改进。将去中脉
剑叶剪碎, 加入提取缓冲液(330 mmol L−1 Sorbitol,
2032 作 物 学 报 第 39卷


50 mmol L−1 HEPES-KOH pH 7.8, 2 mmol L−1 EDTA,
2 mmol L−1 MgCl2, 10 mmol L−1 NaHCO3, 0.05%
BSA, 5 mmol L−1 Ascorbic acid), 低温条件下用高速
组织捣碎机进行 5次 2 s研磨, 4层纱布过滤, 200×g
离心 2 min去除组织沉淀, 2000×g离心 5 min得到粗
叶绿体沉淀。用悬浮缓冲液(330 mmol L−1 Sorbitol,
50 mmol L−1 HEPES-KOH pH 7.6, 2 mmol L−1 MgCl2,
1 mmol L−1 DTT)悬浮叶绿体并加入到 35%/70% (1︰1)
Percoll梯度介质中, 用 Beckman L8离心机 SW28水
平转子 4500×g, 4℃离心 10 min抽取中间绿色层即为
完整叶绿体。
1.6 类囊体膜蛋白制备
将完整叶绿体在低渗裂解液 (50 mmol L−1
HEPES-KOH pH 7.6, 2 mmol L−1 MgCl2, 1 mmol L−1
EDTA, 1 mmol L−1 PMSF)中冰浴涨破, 14 000×g离
心 3 min得到类囊体膜沉淀。用适量样品缓冲液(25
mmol L−1 BisTris-HCl pH 7.0, 20% Glycerol)悬浮类
囊体膜并调整叶绿素浓度至 1 mg mL−1, 缓慢滴加等
体积含 2% (W/V) DM的样品缓冲液, 混匀冰浴增溶
30 min, 15 000×g离心 10 min去除不溶物质, 即得到
类囊体膜蛋白溶液。
1.7 蓝绿温和胶电泳
采用北京六一仪器厂 DYCZ-28A型单板夹芯式
垂直电泳仪制胶和电泳。灌制 1 mm 厚度 5%~12%
非变性梯度聚丙烯酰胺分离胶和 4%浓缩胶, 凝胶中
均含有 50 mmol L−1 BisTris pH 7.0和 500 mmol L−1
6-amino-n-caproic acid。类囊体膜蛋白样品中加入
1/10 体积上样缓冲液 (5% Coomassie brilliant blue
G250, 100 mmol L−1 BisTris-HCl pH 7.0, 500 mmol L−1
6-amino-n-caproic acid, 30% Glycerol)混匀后上样电
泳, 阴极缓冲液中含 0.01% Coomassie brilliant blue
G250。在 4℃条件下, 浓缩胶以 100 V恒压运行, 分
离胶以 180 V恒压运行, 并于进行到 1/2时更换为不
含考马斯亮蓝的阴极缓冲液, 大约 2~3 h完成电泳。
1.8 图像及数据分析
采用 Microsoft Excel 2007及 IBM SPSS Statis-
tics 20分析数据, 1D BN-PAGE电泳结果经 GE Im-
age Scanner III 扫描仪获取图像, Bio-Rad Quantity
One V4.6.2进行分析, 采用 OriginPro 8作图。
2 结果与分析
2.1 衰老过程中两优培九剑叶叶绿素含量的变化
叶片衰老最明显的特征是叶绿素的丧失[17]。图
1显示, 自全展开始, 两优培九剑叶叶绿素含量先上
升, 到抽穗期达最大, 随后逐渐下降, 全展 35 d 后
下降明显, 到蜡熟期叶绿素含量仅为峰值的 38.3%。
剑叶叶绿素 a 与 b 的比值(Chl a/b)同样呈下降趋势,
总体降低 37.4%, 说明叶片衰老过程中叶绿素 a的降
解速度较叶绿素 b更快。


图 1 剑叶衰老过程中叶绿素含量的变化
Fig. 1 Changes in chlorophyll content of flag leaves during
senescence

在活体叶片中叶绿素均以叶绿素-蛋白质复合
物的形式存在, 结合于类囊体膜上, 其中叶绿素 a
主要存在于 PSI 和 PSII 核心复合体中, 而叶绿素 b
主要存在于捕光色素复合物中[18]。实验显示, 两优
培九剑叶叶绿素 a 在衰老过程中更快速减少, 可以
推测在光合膜相关色素蛋白复合物中, 光系统核心
的降解先于捕光天线发生。
2.2 快速叶绿素荧光诱导动力学曲线分析
叶片经过暗适应后加以强光照射发出的荧光随
时间变化形成的多相上升曲线, 即为快速叶绿素荧
光诱导动力学曲线, 通常会出现 O (20~50 µs)、J (2×
103 µs)、I (3×104 µs)、P (3~10×105 µs) 4个特征性位
点。O点为初始荧光(F0), 即 PSII反应中心完全开放,
所有电子受体(QA、QB、PQ等)处于最大程度氧化态
时的荧光, O 点荧光强弱与天线色素含量的多少及
作用中心的活性状态有关。J 点为 PSII 反应中心被
激发使 QA 第一次处于瞬时最大程度还原态时的荧
光[19]。如图 2, 两优培九剑叶全展后各时期 O–J–I–P
曲线在 J 点相交, 表明电子从 QA向 QB的传递状态
没有明显受到衰老的影响, 而 F0 呈整体上升趋势,
到腊熟期上升 30.5%, 说明反应中心接受光量子的
能力逐渐衰退, 且其失活快于天线色素的降解[20]。
J–I 段荧光值变化不明显, 而 I–P 段荧光值先上升,
抽穗期后开始下降, P点即 PSII电子受体处于最大
程度还原态时的荧光(Fm)在衰老后期下降速度逐渐
增大。
第 11期 叶露幻等: 两优培九剑叶衰老过程光合膜功能及蛋白质复合物的变化 2033



图 2 剑叶衰老过程快速叶绿素荧光诱导动力学曲线变化
Fig. 2 Changes in chlorophyll a fluorescence transient of flag
leaves during senescence

到生长后期, 荧光曲线表现出 O–K–J–I–P特征,
K 点是 O–J 之间大约 300 µs 处的位点。对 OJIP 曲
线进行 O–J、O–K标准化[21], 以全展 9 d剑叶荧光值
为基准得到 ΔWO–J、ΔWO–K以表现 K点和 L点(图 3)。
在抽穗至灌浆期剑叶荧光曲线没有明显 K 点, 随后
开始出现 K点, ΔWO–J值急剧增高。K点的出现是叶
绿体放氧复合体 (OEC)受到伤害的特异性标志 [22],
说明两优培九进入乳熟生长期后, 剑叶 PSII 供体侧
光抑制显著增强。100~120 μs处的 L点从全展初期
至灌浆期均不明显, 而到乳熟期迅速升高, 随后继
续上升但幅度小于 K 点的上升。L 点上升为类囊体
解离的特异性标志[23], 说明剑叶全展后 PSII 可以维
持 20 d左右基本稳定随后发生变化, 到衰老进入后
期稳定性大幅度下降, 能量交流受到抑制, 结合腊
熟期 I、P 点荧光值的明显降低的现象, 推测此时
PSII的整体结构可能已经基本瓦解。

图 3 剑叶衰老过程 ΔWO−J、ΔWO−K值的变化
Fig. 3 Changes in ΔWO−J and ΔWO−K of flag leaves during senescence
WO−J = (Ft − F0)/(FJ − F0); ΔWO−J = WO−J 测试−WO−J 基准; WO−K = (Ft − F0)/(FK − F0); ΔWO−K = WO−K 测试−WO−K 基准.

2.3 衰老过程中 PSII反应中心性能变化
两优培九剑叶 PSII最大光化学效率(Fv/Fm)及以
光吸收为基础的光合性能指数(PIABS)在整个过程中
先上升, 至全展 9 d左右开始下降, 两者呈显著正相
关性, 相关系数 0.955 (P<0.01)。Fv/Fm常用来衡量植
物受外界胁迫的程度[19], 在衰老进程中整体变化幅
度不大, 如图 4, 腊熟期较抽穗期降低 13.8%; 而性
能指数 PIABS综合了反应中心密度、原初光化学量子
产率和电子在 2 个光系统之间的传递效率, 可以更
准确地反映光合机构的状态, 敏感性更强 [24], 从抽
穗期起以每期 20%左右的速率下降, 最终仅剩峰值
的 15.1%。
图 5 以剑叶刚全展时各荧光参数为基准做雷达
图, 显示 PSII 和能量分配相关指标的变化。单位叶
面积 PSII 反应中心数(RC/CS0)及活性反应中心数
(RC/ABS)从全展 9 d左右之后开始下降, 到乳熟期后
下降剧烈, 并且活性反应中心数下降更明显。单位
反应中心吸收的光能(ABS/RC)、用于还原 QA的能量

图 4 剑叶 PSII最大光化学效率(Fv/Fm)及以光吸收为基础的光
合性能指数(PIABS)变化
Fig. 4 Changes of maximum photochemical efficiency and
performance index in PSII reaction center of flag leaves
Fv/Fm = 1− (F0/Fm) = φP0; PIABS= (RC/ABS)×[φP0/(1 −
φP0)]×[Ψ0/(1 − Ψ0)].
2034 作 物 学 报 第 39卷


(TR0/RC)和用于电子传递的能量(ET0/RC)随衰老上
升, 说明每一个有活性的反应中心随着叶片衰老承
担了更多的光能转化任务; ET0/RC 后期下降较前两
者慢 , 可见活性反应中心捕获的光能优先保证推动
PSII电子传递; ET0/RC变化趋势与图 3中 L点变化相
吻合(显著正相关性, 相关系数 0.979, P<0.01), 说明
类囊体结构的稳定性、光系统亚单位之间的稳固性对
于光合电子传递具有很大影响。而在整个过程中单位
叶面积捕获的光能(TR0/CS0)几乎没有差异 , 单位反
应中心耗散的能量(DI0/RC)急剧增大, 可见随着不断
衰老, 光合能量收支愈渐失衡, 结合图 1 叶绿素 a/b
的变化可以推测两优培九剑叶在衰老进程中捕光系
统功能维持时间较反应中心长, 以维持能量的吸收
并通过协助剩余能量耗散的机制保护反应中心。

图 5 PSII反应中心数目及能量分配的变化
Fig. 5 Changes in PSII reaction center number and energy allocation

2.4 类囊体膜电子传递活性变化
反应介质添加人工电子受体和供体 DCPIP→
MV 发生的耗氧反应速率用以测定 PSI 电子传递活
性, H2O→K3Fe(CN)6 发生的放氧反应速率用以测定
PSII电子传递活性, 结果如图 6。
PSI 和 PSII 电子传递活性均呈先上升后下降趋
势, PSI耗氧活性始终高于 PSII放氧活性, 但两者变
化趋势有较大差异。PSI 活性在剑叶全展 18 d左右
后开始快速下降, 而 PSII 活性维持较高水平的时间
更长, 在全展 27 d左右快速下降。电子传递活性降
低可能是伴随衰老而产生的光合膜组分降解或不可
逆失活造成的, 而 PSI 和 PSII 电子传递活性变化的
失衡也可能加速衰老的进程。
2.5 蓝绿温和胶电泳分析衰老过程蛋白质复合
物的变化
2.5.1 以 BN-PAGE 分离鉴别类囊体膜蛋白质复
合物 蓝绿温和胶电泳中, 类囊体膜结合叶绿素
的蛋白质复合物呈绿色, 不含叶绿素的蛋白质复合
物呈蓝色, 直观反映结果。两优培九剑叶类囊体膜
以 1% (W/V) DM增溶膜蛋白, 在 5%~12%梯度凝胶
范围内分离到 9 条主要的蛋白质复合物条带, 因衰
老各个时期蛋白质复合物有差异, 故选取条带最丰
富清晰的抽穗期样品进行鉴别。电泳后直接脱去考
马斯亮蓝底色, 即可以清晰观察到 3条蓝绿色条带、
3条蓝色条带、3条绿色条带(图 7)。

图 6 类囊体膜 PSI和 PSII电子传递活性变化
Fig. 6 Changes in electron transport activity of PSI and PSII


图 7 以蓝绿温和胶电泳分离类囊体膜蛋白质复合物
Fig. 7 BN-PAGE analysis of thylakoid membrane protein
complexes
第 11期 叶露幻等: 两优培九剑叶衰老过程光合膜功能及蛋白质复合物的变化 2035


图 7 最上方的大分子量条带丰度极低 , 是类
囊 体膜结构最稳定时分离到的超级复合物
(supercomplexes), 在两优培九类囊体膜中出现较少;
最下方的蓝色线为上样缓冲液中的考马斯亮蓝指示
前沿。电泳相对分子量标准采用 Amersham High
Molecular Weight Calibration Kit for Native Electro-
phoresis。利用 Bio-Rad Quantity One V4.6.2对图像
预测分子量, 参考 Shao 等[25]和 Chen 等[26]的研究,
鉴别各复合物条带(表 1)。
经过优化的 BN-PAGE 可以完整分离出两优培
九剑叶类囊体膜上各种膜整合功能性蛋白质复合物,
为进一步对光合膜蛋白质组学研究提供条件。

表 1 蛋白质复合物表观分子量
Table 1 Apparent MW of thylakoid membrane protein complexes
No.
分子量
MW (kD)
蛋白质复合物
Protein complexes
条带颜色
Color
A 606 光系统 I与捕光复合物 I PSIcore + LHCI 蓝绿 Bluish green
B 578 F0F1-ATP合酶复合体 F0F1-ATPase 蓝 Blue
C 423 光系统 I核心 PSIcore 蓝绿 Bluish green
D 315 F1-ATP合酶复合体&细胞色素 b6/f复合体 F1-ATPase & Cytb6/f 蓝 Blue
E 228 光系统 II核心 PSIIcore 蓝 Blue
F 185 三聚体捕光复合物 II LHCII3 (Trimeric) 绿 Green
G 165 二聚体捕光复合物 II LHCII2 (Dimeric) 绿 Green
H 111 单体捕光复合物 II LHCII1 (Monomeric) 绿 Green

2.5.2 两优培九剑叶衰老过程中类囊体膜蛋白质复
合物的变化 利用蓝绿温和胶电泳分析衰老各时
期两优培九剑叶类囊体膜蛋白质复合物含量变化 ,
其中蜡熟期剑叶(全展 45 d样品)因叶绿素含量过低,
无法获得足够浓度的完整叶绿体而未比较。如图 8-a,
每条泳道均以等叶绿素含量(1 mg mL−1, 20 μL)的类囊

图 8 衰老各时期类囊体膜蛋白质复合物在蓝绿温和胶电泳中
的变化
Fig. 8 Changes of thylakoid membrane protein complexes in
BN-PAGE during senescence

体膜进行蛋白质增溶处理后上样, 单泳道蛋白质总
量约 30~50 μg。为分析各条带蛋白质相对含量, 用 1D
凝胶分析软件 Bio-Rad Quantity One V4.6.2处理电泳
图像, 得到光密度曲线如图 8-b, 可以直观对比显示
各条带光密度值大小和面积, 用以半定量分析。
经过 3 组重复实验, 得到蛋白质电泳条带相对
含量变化(图 9)。可以看出两优培九剑叶类囊体膜上
丰度最高的蛋白质复合物为光系统 II 捕光色素蛋白
复合体(LHCII), 包括三聚体、二聚体、单体 3 种形
式, 以单体最多, 3种形式的 LHCII数量在衰老过程
中都有所减少但并不显著。光系统 II 核心复合体
(PSIIcore)数量先上升, 到抽穗期后下降, 至乳熟期
后下降迅速, 与前述荧光参数 RC/CS0反映的结果吻
合。电泳结果显示, 光系统 I在整个过程中出现降解
更早, 扬花期后开始大幅度减少, 并且非常明显的
光系统 I 捕光色素蛋白复合体(LHCI)较之其核心复
合体(PSIcore)先减少且幅度极大, 扬花期后 LHCI几
乎难以从 BN-PAGE中得到展现。另外 ATP合酶复合
体(ATPase)及细胞色素 b6/f复合体(Cyt b6/f)也在扬花
期后快速减少 , 随后降解速度减缓 , 但因 1D
BN-PAGE分辨率制约, F1-ATPase与 Cyt b6/f出现条
带位置相近, 无法准确区分, 需要进一步做二维分
离才可具体判断。
2036 作 物 学 报 第 39卷



图 9 衰老各时期类囊体膜蛋白质复合物相对含量变化
Fig. 9 Changes in relative content of thylakoid membrane protein complexes during senescence

3 讨论
叶片叶绿素含量和光合性能的相对稳定时间可
以用于衡量水稻光合功能期的长短[27], 进而对衰老
阶段评价。本研究显示, 两优培九剑叶在水稻拔节
孕穗期开始逐步全展后 , 先出现光合性能的提升 ,
到抽穗期达到顶峰, 随后开始下降, 总体在扬花期、
灌浆期尚能保持较高水平, 为高产打下基础 [28], 而
进入籽粒成熟阶段, 剑叶衰退明显。叶片类囊体膜蛋
白质复合物的增减与此过程保持同步, 可以看出光
合膜结构功能的变化与衰老进程有密切的因果关系。
叶绿素 a 与 b 降解速度的差异在类囊体膜蛋白
蓝绿温和胶电泳结果中得到解释, 富含Chl b的捕光
天线比富含 Chl a的反应中心维持含量的时间更长。
PSI 和 PSII 的降解模式也存在显著区别, 对于 PSII
而言, 其捕光天线 LHCII 在衰老过程中的稳定性高
于 PSIIcore 的稳定性, 而 PSI 情况相反, LHCI 的降
解速率快于 PSIcore。PSII主要分布在垛叠的基粒类
囊体膜上, 在光下介导水到质醌的电子传递; PSI则
分布在非垛叠的基质类囊体上, 除进行非循环电子
传递生成 NADPH 外还介导循环式电子传递[18]。两
优培九剑叶光合膜上, PSI丰度较 PSII低, PSI数量与
相应的电子传递活性衰减与 PSII存在异步性, PSI衰
退发生在扬花期后且幅度较大, 而 PSII 从剑叶光合
性能到达峰值(即抽穗期 )就开始下降但幅度较小 ,
直到衰老后期才明显衰退。2个光系统变化的不协调
可能打破原初反应和同化力形成过程中原本的平衡
关系, 增加活性氧自由基产生的机会, 加速衰老发
生[29]。
衰老过程中 PSII光化学效率呈现与相关蛋白质
复合物变化相一致的趋势。叶绿素荧光动力学曲线
L 点在乳熟期开始大幅度上升, 表明 PSII 亚单位之
间的连接开始松散, 稳固性减弱, 从可逆保护性失
活开始转向不可逆失活[30]; K 点的变化显示 PSII 供
体侧放氧复合体的显著破坏发生在衰老的末期。关
于各蛋白亚基具体的变化情况, 需要对一维蓝绿胶
电泳作二向分离鉴定才可得出。
PSII 在衰老进程中最为典型的是对光能捕获与
利用之间变化的不平衡, 这是 LHCII 在生殖后期始
终保持较高相对含量的结果。LHCII 是光合膜含量
最丰富的蛋白质, 并且结合 PSII 近 60%的叶绿素,
天然生理状态主要以三聚体存在, 离体分离后会出
现解聚[31], 除了光能的吸收与传递, LHCII在维持类
囊体膜垛叠, 调节两个光系统之间的能量分布和光
保护等方面起着重要作用。两优培九剑叶 LHCII 在
衰老过程中表现出最稳定的特征使叶片光能捕获始
终保持一定水平, 同时 LHCII 通过磷酸化和迁移调
节激发能在 PSI 和 PSII 之间的分配, 保证光能最大
程度传递到反应中心 [32]。过剩光能的耗散(DI0/RC)
在衰老前期较小, 到后期明显增大可能与依赖叶黄
素循环的热耗散的增加相对应, 而叶黄素循环主要
在 LHCII中进行[33], 因此衰老过程中 LHCII的相对
稳定性有利于减轻光合机构遭受光破坏。但 LHCII
的大小和稳态也并非越高越好, 许晓明等[34]对于低
叶绿素 b 突变体水稻的研究显示, 保持合适的捕光
天线与反应中心比例才能提高光能利用效率, 降低
第 11期 叶露幻等: 两优培九剑叶衰老过程光合膜功能及蛋白质复合物的变化 2037


光抑制, 减少光氧化, 维持衰老过程中的光合作用
水平。
4 结论
两优培九进入抽穗期后, 剑叶光合膜蛋白质复
合物开始有序降解, 随衰老进程其稳定性呈 LHCII >
PSIIcore > PSIcore > ATPase & Cyt b6/f > LHCI, 光
能转化水平在衰老前期缓慢下降, 而到籽粒成熟阶
段明显衰退, PSII 捕光色素复合物系统的相对稳定
可能在维持光合膜功能中起重要作用。但是类囊体
膜复杂的功能蛋白质系统如何在衰老过程中改变和
调节, 有待对蛋白质复合物亚基以及 BN-PAGE 无
法分离的各种膜附着小分子蛋白质进一步分析。
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