全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2009年第 2期·技术与方法·
收稿日期：2008-10-23
作者简介：朱捷（1964-），女，教授，在读博士，研究方向：数量遗传学；E-mail：zhujie6411@163.com
通讯作者：王军，E-mail：junwang1966@yahoo.com.cn
荧光定量 PCR 技术（Real-time fluorescent quan-
titative PCR，FQ-PCR）是指在 PCR 反应体系中加入
荧光基团， 利用荧光信号积累实时监测整个 PCR
进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析
的方法。 实时荧光定量 PCR 是在普通 PCR 定性技
术基础上发展起来的核酸定量技术 。 在荧光定量
PCR 技术发展的过程中，两个重要的发现起着关键
的作用： 一是 Taq DNA 多聚酶的 5′端核酸外切酶
活性被发现， 它能降解特异性荧光标记的探针，使
得间接检测 PCR 产物成为可能； 另一个是荧光双
标记探针被使用在一密闭的反应管中能实时地监
测反应全过程。 在 1996 年由美国 Applied Biosyste-
ms 公司推出了一种实时荧光定量 PCR 技术， 它是
利用荧光信号的变化实时检测 PCR 扩增反应中每
一个循环扩增产物量的变化， 通过 Ct 值和标准曲
线的分析对起始模板进行定量分析 [1]。 该技术不仅
实现了 PCR 从定性到定量检测的飞跃， 而且所有
反应均在同一溶液中进行， 不需任何后处理过程，
具有特异性更强、有效解决 PCR 污染问题、自动化
程度高、能实现多重反应、定量结果具实时性和准
确性等特点 [2]。 目前在不同的研究领域得到广泛的
应用。
1 基本原理
在荧光定量 PCR 反应中， 引入了一种荧光化
学物质，随着 PCR 反应的进行，PCR 反应产物不断
累计，荧光信号强度也等比例增加。 每经过一个循
环，收集一个荧光强度信号，这样就可以通过荧光
强度变化监测产物量的变化。从而得到一条荧光扩
荧光定量 PCR技术及其在科研中的应用
朱捷 1，2 杨成君 2 王军 2
（1东北林业大学林学院，哈尔滨 150040；2黑龙江科技学院数力系，哈尔滨 150027）
摘 要： 荧光定量PCR技术是一种新型的核酸定量技术，与常规的PCR相比，荧光定量PCR具有检测灵敏，精
确，特异性强，无污染，快速等特点。目前该技术已广泛应用于不同研究的多个领域。主要从荧光定量PCR的基本原理，
主要类型和检测应用进行了综述。
关键词： 荧光定量PCR 主要类型 检测应用
Real-time Fluorescent Quantitative PCR and Application
in Scientific Research
Zhu Jie1，2 Yang Chengjun2 Wang Jun2
（1College of Forestry，Northeast Forestry University，Harbin 150040；2Department of Mathematics an Mechanics Heilongjiang
Institute of Science and Technology，Harbin 150027）
Abstract： Real-time fluorescent quantitative PCR（FQ-PCR） s a new kind of nucleic acid quantitative technique
by using different fluorescence. In comparison with the conventional PCR technique，real-time fluorescent quantit tive
PCR is sensitive，accurate，specific，pollution-f ee and speedy. At present，real-time fluoresc nt quantitative PCR has been
widely used in different research fields. In this paper，the basic principles，main types and detection applecations were
introduced.
Key words： Real-time fluorescent quantitative PCR Main types Detection applications
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2009年第 2期
增曲线。荧光扩增曲线包括 3 个阶段：基线期，扩增
期和平台期。 只有在荧光信号扩增期，PCR 产物量
的对数值与起始模板量之间存在线性关系，所以可
以在这个阶段进行定量分析。为了便于对所检测样
本进行比较，在荧光定量 PCR 反应的指数期，需要
设定一定荧光信号的阈值，一般这个阈值是以 PCR
反应的前 15 个循环的荧光信号作为荧光本地信
号， 荧光阈值的缺省设置是 3~15 个循环的荧光信
号的标准偏差的 10 倍。 如果检测到荧光信号超过
阈值被认为是真正的信号，它可以用于定义样本的
阈值循环数（Cycle Threshold，Ct）。每个模板的 Ct 值
与该模板的起始拷贝数存在线性关系。 在 PCR 过
程中可以连续不断地检测反应体系中荧光信号的
变化 。 当信号增强到荧光阈值时 ，Ct 值被记录下
来。 起始拷贝数越多，Ct 值越小。 利用己知起始拷
贝数的标准品可作出标准曲线，只要获得未知样品
的 Ct 值， 即可从标准曲线上计算出该样品的起始
拷贝数。
2 主要类型
2.1 SYBR Green I
SYBR Green I 是一种只与双链 DNA 小沟结合
的具有绿色激发波长的染料 ， 也是荧光定量 PCR
最常用的 DNA 结合染料，当与 DNA 结合的时候可
以发出荧光。 在游离状态下，SYBR Green I 发出微
弱的荧光，但是一旦与双链 DNA 结合后，其荧光强
度是游离状态下的 1 000 倍。 所以一个反应发出的
全部荧光信号与出现的双链 DNA 量成正比， 可以
根据荧光信号检测出 PCR 体系中的双链 DNA 的
数量。 SYBR Green I 的优点是检测方法简单，不需
要设计探针，成本低，通用性好，且能够进行融解曲
线分析检测扩增反应的特异性。但其缺点是 SYBR
Green I 可以与所有的双链 DNA 结合， 因此不能进
行多重 PCR 反应，由引物二聚体、单链二级结构以
及错误的扩增产物引起的假阳性会影响定量的精
确性。 但通过优化 PCR 的反应条件，减少或去除非
特异性产物和引物二聚体的产生，另外，也可以借
助融解曲线分析产物的均一性，有助于增加定量结
果的准确性。
2.2 TaqMan 探针技术
TaqMan 荧光定量 PCR 技术是以 TaqMan 荧光
探针为基础， 利用 DNA 多聚酶的 5′→3′外切酶活
性来水解与目的序列杂交的探针。 TaqMan 荧光探
针为一个 20 bp 以上的寡核苷酸，其 5′端标记荧光
发射基团，3′端标记淬灭基团。 当探针保持完整时，
3′端淬灭基团抑制 5′端发射基团的荧光发射，只能
检测到 3′端荧光信号， 而不能检测到 5′端的荧光
信号。 但在 PCR 扩增中，溶液中的模板变性后低温
退火时，引物与探针同时与模板结合。 在引物的介
导下，沿模板向前延伸至探针结合处，发生链的置
换，Taq DNA 聚合酶的 5′→3′外切酶活性将探针 5′
端连接的荧光基团从探针上切割下来，游离于反应
体系中，从而脱离 3′端荧光淬灭基团的屏蔽，接受
光刺激发出荧光信号。即每扩增一条 DNA 链，就有
一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与 PCR
产物形成完全同步。由于理论上被释放的荧光基团
数目和 PCR 产物数量是一对一的关系， 且光密度
同被释放的荧光基团的数目也是正比关系，因此该
技术可对模板进行准确定量。 TaqMan 探针技术特
异性好，假阳性低，线性关系好，准确性高，但是需
要设计特异性的探针 ，所以成本较高 ，另外 ，采用
Taq 酶的 5′→3′外切活性，因此定量时常受酶性能
的影响。
2.3 分子信标技术
分子信标是一种呈发夹结构的茎环双标记寡
核苷酸探针， 是 TaqMan 探针的衍生形式。 两端的
核酸序列互补配对，因此标记在一端的荧光基团与
标记在另一端的淬灭基团紧紧靠近 。 在茎环结构
中，环一般为 15~30 个核苷酸，并与目标序列互补，
茎一般为 5~7 个核苷酸，并相互相配对形成茎的结
构。 荧光基团连接在一个臂的末端，淬灭基团则连
接在另一个臂的末端。 当探针分子呈发夹结构时，
结合在其两端的荧光基团距离很近，使其产生能量
转移效应，而检测不到荧光信号。 当互补序列出现
时，探针与 DNA 杂交，探针转变成一个呈线性开放
的结构。 荧光基团与淬灭荧光基团彼此分开，当荧
光基团被激发时，因淬灭作用被解除，发出激发光
子。 荧光基团脱离了淬灭基团的能量转移效应，从
而产生可被检测到的荧光。与探针互补的靶分子数
量越多荧光信号也就越强，这样就达到了定量的目
的。分子信标的方法优点是灵敏度高，特异性强，荧
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光背景低。 其缺点是设计要求高，杂交探针不能完
全与模板结合 ，稳定性较差，探针合成的时候标记
较复杂。
3 应用
荧光定量 PCR 技术比起普通 PCR， 不用进行
琼脂糖凝胶电泳，EB 染色， 人工分析数据等步聚。
较之与以前的以终点法进行定量的 PCR 技术具有
很大的优势。它操作简便、快速高效，荧光定量 PCR
技术不仅具有普通 PCR 的高灵敏性， 而且可以实
时检测 PCR 每个循环过程中荧光信号的变化 ，并
获得定量结果， 具有 DNA 杂交的高特异性和光谱
技术的高精确性，可以降低污染，进行多重扩增，克
服了普通 PCR 的许多不足。 目前该技术已经被广
泛应用于基础科学，食品、医学、药物开发以及分子
生物学等多个领域。
3.1 DNA 或 RNA 的定量检测应用
包括病原微生物或病毒含量的检测，转基因动
植物转基因拷贝数的检测 ，RNAi 基因失活率的检
测等。 实时荧光定量 PCR 技术可以快速、准确定量
测出高至 1010，低至 101 个拷贝数的病原体，定量范
围极宽。已经应用于细菌、病毒、衣原体、支原体、寄
生虫等许多病原体的检测研究 [3]。 程小雯等 [4]收集
集体暴发疑似流感、SAPS 患者的咽拭子标本 16 起
207 份和双份血清标本 104 份， 应用荧光定量 RT-
PCR 检测方法、MDCK 细胞培养法和血凝抑制试验
进行病原学和血清学检测。结果 207 份集体暴发疑
似流感 、SAPS 患者的咽拭子标本中用荧光定量
RT-PCR 检测， 阳性 79 份， 阳性率 38．16％；MDCK
细胞培养，16 起中有 13 起共 145 份咽拭子有 62 份
标本阳性，阳性率 29．95％；两者的阳性率差异有显
著意义（χ2=8．64，P<0．005）。有 9 起 104 份成功地采
集了双份血清，经 HI 试验有 64 份双份血清与 H3N2
亚型抗原产生血抑 4 倍增长，阳性率 61．54％。 表明
荧光定量 RT-PCR 方法检测流感病毒能够在 3～4 h
内得出结果，因此可作为一种快速的流感病毒检测
诊断方法。 王晓建等 [5]以 TG-CARK 转基因首见鼠
为研究对象，选取小鼠的高度保守基因 Fabpi 为内
参， 利用绝对定量的实时荧光 PCR 法鉴定转基因
小鼠拷贝数， 并与传统的 Southern blot 方法的定量
结果进行比较。 得出实时定量 PCR 鉴定的转基因
拷贝数与 Southern blot 法完全一致 ，3 只 TG-CARK
首见小鼠的拷贝数分别为 1，7，45。 Haugland 等 [6]应
用实时定量 PCR 对曲霉菌， 青霉菌和拟青霉菌进
行了种和亚种之间核苷酸序列差异的比较鉴定，并
据此确定了它们之间的亲缘关系。
3.2 基因表达研究的检测应用
在基因表达的研究中 ， 比较常用的方法是
Northern 杂交、RT-PCR 等方法， 传统的 Northern 杂
交方法定量的下限时 106~107 个分子。 这种方法需
要的 mRNA 的量较大。 对于较少的材料在研究基
因表达上受到很大的限制。 而荧光定量 PCR 技术
对 mRNA 水平的检测比 Northern 杂交 、RT-PCR 等
定量方法要方便 、快速、准确得多。 荧光定量 PCR
技术可以对不同组织、不同处理之间（如药物处理、
物理处理和化学处理等）、 不同发育阶段基因表达
差异进行检测，检测各基因在组织细胞中的表达丰
度， 分析基因的表达调控、mRNA 的表达模式等研
究。 张中保等 [7]应用实时荧光定量 PCR 技术研究了
玉米中 10 个水分胁迫诱导基因的相对表达量及表
达模式。 在花丝中，除基因 Mads 和 Grp 外，其他 8
个基因均随干旱胁迫程度加重 ， 相对表达强度增
加；在幼穗中，除基因 Mads 外，其他 9 个基因均随
干旱胁迫程度加重，相对表达强度增加。 牛艳梅等 [8]
研究不同成熟阶段的番木瓜果实中 Cp-EXP1 基因
表达是有差异的， 其表达水平受乙烯调控 ， 证实
EXP1 基因的表达与番木瓜的成熟软化密切相关 。
叶嘉良等 [9]克隆了家蚕 UBRPS27a 基因 ，用荧光定
量 PCR 对该蛋白在家蚕不同发育时期和各组织中
的表达差异作了初步分析， 发现 RPS27a 在活性增
殖细胞中表达量很高。 亚细胞定位试验发现 BmU-
BRPS27a 在细胞核和细胞质中都存在。 合成该基因
的 dsRNA， 并通过脂质体包埋 dsRNA 转染家蚕细
胞，发现 BmUBRPS27a 基因沉默后引起了细胞形态
的变化。
3.3 食品安全中的检测应用
人们在日常生活中食品是否安全，进出口食品
和粮食是否含有危险或潜在危险的成分，都可以用
荧光定量 PCR 技术进行快速检测， 例如食源微生
物、食品过敏源、转基因食品、乳品等检测。 在食品
发酵过程中， 利用荧光定量 PCR 技术可不经过培
朱捷等：荧光定量 PCR技术及其在科研中的应用 75
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2009年第 2期
养活菌， 可以直接分析发酵产物中的微生物种群 [10]。
转基因作物生产加工的食品全世界有近万种全世
界有近万种。 荧光定量 PCR 方法是国内外进行转
基因成分含量检测的常用方法。 例如， 利用 RQ -
PCR 技术定量检测谷物基因来控制缺乏麦麸的婴
儿食物 [11]。 利用 TaqMan-FQPCR 法共对 15 份未知
实物样品（包括 9 份大豆类样品和 6 份玉米类样品）
进行了转基因成分 cp4epsps、cry1Ab 的筛选检测 ，
其中大豆类样品 5 份检出含有转基因成分 cp4eps-
ps， 玉米类样品 3 份检出含有转基因成分 cry1Ab，
其余 7 份样品均为阴性。 试验证实 TaqMan-FQPCR
方法同样具有荧光阈值较低 （Ct< 300）、重复性较
好、灵敏度和准确度较高的特点 [12]。
3.4 医学及药物开发中的检测应用
荧光定量 PCR 的出现克服了传统 PCR 技术普
遍存在的假阳性及不能定量等问题， 使得 PCR 技
术更广泛的应用于临床及其药物方面，目前已经在
肿瘤研究，乙肝诊断，病毒检测，动物疾病检测与防
御，药物疗效的评价与考核等方面，为临床理论研
究、 治疗疾病和药物开发提供了客观的物质基础。
癌基因的表达增加和突变在许多肿瘤早期和良性
阶段就会出现， 荧光定量 PCR 技术不但能有效地
检测基因的突变，而且能准确测定表达量，所以可
进行肿瘤早期诊断、分型、分期和预后判断 [13]。 通过
检测肿瘤标记， 荧光定量 PCR 技术适合于高通量
检测癌症 [14]。 荧光定量 PCR 技术在新药的开发、畜
用药物，经济动植物的药物研究过程中，可以快速
了解药物对疾病进程的影响，为新药开发节约大量
的人力、时间和资金。
3.5 遗传学及 SNPs 分析上的应用
荧光定量 PCR 技术还可以用在点突变分析 、
等位基因分析、DNA 甲基化检测、单核苷酸多态性
（SNP）分析及特异突变基因检测等。利用 Real-time
PCR 和有关的间接测序方法， 可对已知 DNA 序列
进行基因突变及多态性的分析，如位置突变基因及
序列多态性的定位， 或通过扩增 DNA 限制性位点
检测遗传变异等。 根据 TaqMan 探针法在扩增之前
处理 DNA， 然后用特异的引物和探针可以区分甲
基化和非甲基化的 DNA。SNP 分析从根本上来说是
确定一对染色体的每种基因的两个拷贝，结合荧光
定量 PCR 可以快速的检测 SNP 结果。
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