全 文 ：·技术与方法·
生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 12期
DGGE技术在环境微生物多样性研究中的应用
张珍妮 1, 2 　吴晓芙 1 　陈永华 1, 2 　石卉 1
(1中南林业科技大学环境科学与工程研究所 ,长沙 410004; 2中南林业科技大学生物环境科学与技术研究所 ,长沙 410004)
　　摘 　要 : 　微生物是污水净化的主要作用者之一。采用变性梯度凝胶电泳 ( denaturing gradient gel electrophresis, DGGE)方
法培育和鉴定土壤微生物具有可靠性强、重复性好、方便快捷等优点 ,已被广泛应用于环境科学和污染防治研究领域。综述
了基于 PCR2DGGE技术的基本原理、关键环节及其在微生物多样性研究中的应用 ,同时就其自身存在的不足进行了评价并提
出了解决方案。
关键词 : 　PCR2DGGE　微生物 　多样性
Application in Research on M icrobia l D iversity
of Environment by DGGE Techn ique
Zhang Zhenni1, 2 　W u Xiaofu1 　Chen Yonghua1, 2 　Shi Hui1
(1 Institu te of Environm ent Science and Engineering, Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004; 2 Institute of
B iology Environm ent Science and Technology, Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004)
　　Abs trac t: 　M icroorganism p lays an important role in wastewater treatment1Accounted for by its high levels of reliability and rep ro2
ducibility as well as its convenience in operation, the denaturing gradient gel electrophoresis(DGGE) has been widely used for cultiva2
tion and identification of m icrobial communities in the fields of environmental sciences with focus on pollution control1The p rincip le of
the DGGE technique and the concerned key factors in its app lication for analysis of m icrobial communities were described in this pa2
per1 In comparison, the potential app lication areas of the DGGE technique and its lim itations were also discussed1
Key wo rds: 　PCR2DGGE　M icroorganism　D iversity
收稿日期 : 2009207220
基金项目 :国家水体污染控制与治理科技重大专项 ( 2008ZX072122001) ,国家科技部国际合作项目 ( 20072DFA91420) ,湖南省博士后基金
(2008RS4027) ,中南林业科技大学校青年基金重点项目 (2008001A) ,中南林业科技大学生物环境科学与技术研究所开放基金 ,湖南省
环境科学学科建设项目 (2006180)
作者简介 :张珍妮 (19852) ,女 ,在读硕士 ,研究方向 :环境生物学 ; E2mail: zhangzhenni_2003@1631com
通讯作者 :吴晓芙 (19532) ,男 ,教授 ,研究方向 :水土污染控制 ; E2mail: wuxiaofu530911@ vip11631com环境中微生物的种类和数量是及其丰富的 ,微生物能把有机质作为营养源转化为组成物质和能量 ,它们在污染物的吸附和降解起着核心作用 [ 1, 2 ]。所以在分析环境样品时 ,了解微生物的群落结构 ,对鉴定和分离处理系统中的优势菌很重要。自 1985年 Pace等 [ 3 ]利用核酸测序方法来研究微生物的进化问题以来 ,分子生物学技术逐渐被引入到微生物多样性研究中。1993年 Muyzer等 [ 4 ]最初将变性梯度凝胶电泳DGGE技术引入微生物生态研究 , DGGE技术是一种DNA指纹技术 ,是多态性分析技术的一种 ,可分辨出相同长度但序列不同的 DNA片段。这种方法可以有效地避免在传统富集、培养、分离、研究过程中造成的 微生物多样性丢失 ,种群构成发生变化等弊病 ,能够更直接、可靠地反映出微生物的原始组成情况。Muyzer[ 4 ]研究表明占整个群落细菌数量约 1%或以上的类群就能够通过 DGGE监测到 ,而传统方法只能分离出占环境微生物总数 011%～10%的微生物。因此 ,综述了 DGGE的基本原理与关键环节、及其在微生物多样性研究中的应用 ,同时就其自身存在的缺点进行了评价并提出了解决方案。1　D GGE技术的原理DGGE技术是使用具有化学变性剂梯度的聚丙烯酰胺凝胶对 DNA进行电泳 ,该凝胶电泳时能够有区别地解链 PCR扩增产物。在进行变性梯度凝胶
2009年第 12期 张珍妮等 : DGGE技术在环境微生物多样性研究中的应用
电泳时 ,长度相同而在碱基序列上存在差异的 DNA
双链的解链需要不同的变性剂浓度。序列不同的
DNA片段就会在各自想用的变性剂浓度下变性 ,发
生空间构型的变化。起初双链 DNA以现状向正极
移动 ,随着变性剂浓度的增加 , DNA中具有低 G + C
含量的序列的部分被打开 ,而高 G + C含量的部分
仍保持双链。DNA双链一旦解链 , DNA分子形成端
部的叉状或中间的环节 (即 DNA部分熔化 )。其在
聚丙烯酰胺凝胶中的电泳速度将会急剧下降 ,以至
停留在其相应的不同变性剂梯度位置 ,染色后可以
在凝胶上呈现为分开的条带。如此使能将具有相同
长度而序列有差异的 DNA分子分离开 (图 1)。
图 1　D GGE研究微生物多样性的一般步骤
2　D GGE技术的关键环节和优化
211　提取 DNA的方法的比较
样品群落总 DNA 的提取是 DGGE研究微生
物群落的基础。人工湿地样品中细菌种类复杂且
混杂有大量有毒物质、腐殖质 [ 5 ] ,如何使所有细胞
裂解、充分释放 DNA、有效去除杂质 ,建立高效、可
靠的 DNA提取方法成为研究者关注的热点。从土
壤中提取 DNA的方法可以分为两类 [ 6 ] ,一类是直
接提取法 ,在土壤中直接裂解微生物体 ,再提取
DNA [ 7 ] 。另一类是间接提取法 ,先将微生物菌体
与土壤颗粒分开 ,再提取 DNA [ 8 ] ,其优缺点见表
1。采用直接提取法的较多 ,包括 3种方法 ,且样
品总 DNA提取质量的高低多以获得量大、能用于
后续分子操作和尽可能地包含样品中所有微生物
类群的遗传信息为指标。DNA提取过程中一般用
乙醇、异丙醇和聚乙二醇 ( PEG)等有机溶剂沉淀
DNA分子 ,这些有机溶剂对样品的 DNA均有一定
的优先选择性。 Porteous等 [ 12 ]认为异丙醇沉淀核
酸量较高 ,且腐殖酸污染较少。M iller[ 13 ]认为 SDS
结合氯仿或苯酚进行玻璃研磨可以优化 DNA
提取量。
表 1　土壤微生物 D NA提取方法的比较
类型 原理 方法 优缺点
直接
提取法
将样品直接悬浮在
裂解缓冲液中处理 ,
使其释放 DNA, 继
而抽提纯化
SDS2高盐
提取法 [ 11 ]
SDS2酚氯仿抽提法 SDS高盐提取 DNA得率较高 ; SDS酚氯仿抽提 DNA得率较低 ,且会造成 DNA的剪切 [ 9 ]SDS法提取的 DNA 中含有较多腐殖酸等杂质 ,要经过纯化才能用于后续研究 [ 10 ]
CTAB2SDS法 DNA纯度较高 ,片段完整 ,可以直接用于后续一般的操作 [ 10 ]
间接
提取法
先将微生物菌体与
土壤颗粒分开 ,再提
取 DNA
Nycodenz法 [ 15 ]
B lending法 [ 16 ]
间接提取法的 DNA得率明显低于直接提取法 , Nycodenz介质密度梯度离心可得
到相对干净的菌泥 ,且细胞分离效率较高 ,可达 20% ～50% [ 14 ] ,但其价格昂贵 ,
操作复杂 ;而 B lending法操作简单快速 ,成本低 ,但分离出的菌泥中含有非细胞
物质和土壤污染物
212　PCR的扩增及其偏差和优化
PCR扩增是 PCR2DGGE技术中至关重要的步
骤之一。通常采用 16S rDNA中的保守区作为引物
进行 PCR反应。这是由于 16S rDNA具有以下几个
特点 : (1) 16S rDNA约为 1 540个核苷酸长 ,序列长
短适中 ,适合用作分类学上的研究 [ 17 ] ; ( 2 )原核生
物体都具有 16S rDNA; ( 3) 16S rDNA非常保守 ,不
会在不同的个体间进行基因交换 ,各物种具自己的
独特序列 [ 18, 19 ] ; (4)目前已有相当完备的 16S rDNA
基因资料库 ,经过 GenBank和 R ibosomal Database
Project(RDP)基因资料库作对比分析 ,并可进行亲
源关系分析、鉴定等。目前被广泛被广泛使用的细
菌 16S rDNA 通用引物是 338f /518r (V3区 )、341f /
926r(V3～V5区 )和 968f /1401r (V6 ～V8 区 )。 Yu
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 12期
等 [ 20 ]认为扩增 V3区及 V3～V5区的引物为最佳引
物选择 ,V3区的 PCR2DGGE条带数最多、分离效果最
好。如果需要较长的扩增产物 ,则选择 V3～V5区。
PCR技术主要由高温变性、低温退火和适温延
伸 3个步骤反复的循环构成 ,是在一种特异耐热酶
Taq DNA聚合酶的催化下完成的由 DNA聚合酶催
化反应。总结不同的 PCR扩增反应体系 [ 21, 22 ] ,然后
根据土壤微生物总 DNA的特性 ,依据常规的 PCR
反应体系 ,试验不同的反应程序 ,得出效果较好的
PCR条带。其反应程序如下 : 94℃ 1 m in; 50℃ 1m in
和 72℃ 1 m in,共 33个循环 ,然后 72℃5 m in为最后
的延伸阶段。对基本组成以外的其它变化再进行描
述 :在 90～96℃内每间隔 2℃设系列变形温度 ,结果
表明 , 90℃无区带 ,最适变性温度为 94℃。在 40～
60℃内 ,每隔 5℃设系列退火温度。结果表明 ,最适
温度为 45℃和 50℃。当其它扩增条件确定后 ,设扩
增的循环次数分别为 25、30、35和 40个。结果表
明 ,以 35个循环的产物较为理想。从研究的结果可
看出 ,任何试验条件偏离最佳试验条件将导致扩增
无产物或非特异性产物 ,将影响 PCR 试验的可
靠性。
213　最佳电泳条件的选择
电泳条件的选择在整个分析过程中具有至关重
要的作用 ,电泳条件的优劣直接关系到条带分离的
好坏 ,影响后续分析工作。DGGE电泳条件不同 ,即
使是相同的样品所得的图谱也会有差异 [ 23 ]。DGGE
电泳条件选择包括变性剂梯度、电泳温度和时间、显
影的效果的确定。理论认为 ,只要选择的电泳条件
足够精细 ,有 1个碱基差异的 DNA片段都可被分
开。DGGE电泳条件一般通过经验数据或反复试验
来确定。
通常根据基因片段的大小来确定聚丙烯酰胺凝
胶浓度 ,当片段大小在 200 bp左右时 ,一般采用 8%
的凝胶。变性剂的梯度范围要根据垂直 DGGE试
验来确定 ,垂直试验曲线斜率较大的部分代表解链
区域的 Tm (解链温度 )值 ,此时低温解链区的不同
分子达到最佳分离状态 [ 24 ]。通常选择水平胶的的
变性剂梯度范围为 30% (相当于 Tm 范围 10℃左
右 ) ,对于不同的样品还需要进行调整。对大多数
DNA片段 50～65℃是比较适合的 ,通常电泳的温度
要低于样品解链区域的 Tm 值。土壤样品相对而言
比较复杂多样 ,其解链温度通常选择在 60℃左右进
行优化 [ 25 ]。电泳时间取决于样品的片段大小、凝胶
浓度、变性剂梯度和电泳时的电压等因素 ,一个条件
的改变都可能引起电泳时间的不同 ,可以用时间进
程法优化出最佳电泳时间。
Muyer和 Smalla[ 26 ]建议利用时间进程试验确定
最佳的电泳时间。具体方法是将待测样品以恒定的
时间间隔在同一块凝胶上电泳 ,以获得样品最大分
辨率的时间为最佳电泳时间。在 Sigler[ 23 ]的研究中
发现 ,较长时间的电泳会改变 DGGE胶中变性剂梯
度 ,导致电泳图谱的变化 , 3个不同的样品 ,同样在
电压 1 000 V的体系下进行电泳分离 ,随着电泳时
间的减少 ,分离的效果变好。
为了更好的显示 DGGE条带 ,可以选择不同的
染色方式 ( EB、SYBR Green I和银染 )。其中 , SYBR
Green Ⅰ染色的优点是背景色低 ,可以观察到尽可
能多的条带 ;银染的灵敏度最高 ,但银染过后的条带
不能用于杂交分析 [ 27 ]。
3　D GGE在环境治理中的应用
311　DGGE技术在废水生物处理研究中的应用
刘新春等 [ 28 ]应用 PCR2DGGE方法 ,对在相同
的操作条件下分别用低温菌和常温菌接种的两套活
性污泥系统中的微生物群落结构的动态变化进行了
追踪。由于工艺相同 ,使得接种的低温菌和常温菌
群在相同的操作条件下 ,产生了相似的微生物群落
结构。随着运行时间的增加 ,其菌群结构相似程度
也越来越高 ,说明环境的变化是决定微生物群落结
构的关键因子。赵兴青等 [ 29 ]采用 PCR2DGGE分子
指纹图谱技术比较南京玄武湖、莫愁湖和太湖不同
位置的表层沉积物微生物群落结构 ,研究结果表明 ,
三湖泊沉积物微生物的 16S rDNA的 PCR扩增结果
约为 626 bp,为 16S rDNA V3～V5区特异性片段。
三湖泊除具有特征性的微生物种属外 ,还分布约 5
个相同的细菌种群。赵继红等 [ 30 ]用 PCR2DGGE技
术分析啤酒废水处理系统的微生物区系 ,对 SBR池
活性污泥细菌多样性进行比较 ,得出 SBR池不同深
度和不同曝气量的微生物种群结构完全一致 ,不同
处理时段和不同时间的微生物种群结构一致 ,但优
势菌群不同。说明水解酸化池的活性污泥微生物多
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2009年第 12期 张珍妮等 : DGGE技术在环境微生物多样性研究中的应用
样性受深度的影响变化较大 ,在结构组成和种群数
量上均有较大的差异。吴卿等 [ 31 ]应用 PCR2DGGE
研究饮用水中微生物的多样性 ,得出不同取样点饮
用水样品中虽然存在特异菌 ,但各取样点水样中的
优势菌相同。从这些研究中可以看出菌群结构主要
是由环境条件决定 ,一般在相同的废水中采用不同
的处理 ,微生物种群结构一般一致 ,但优势菌群
不同。
312　DGGE技术在土壤微生物研究中的应用
罗海峰等 [ 32 ]采用 PCR2DGGE技术分析农田土
壤微生物多样性 ,得出了 DGGE能够对土壤样品中
的不同微生物的 16S rRNA基因的 V3区的 DNA扩
增片段进行分离 ,为这些 DNA片段的定性和鉴定提
供了条件。林曦等 [ 33 ]进行了南极中山站排污口土
壤中微生物群落的 DGGE分析 ,针对 16S rDNA基
因中 V3保守区域进行比较分析 ,结果发现中山站
排污口样品中的微生物组成表现出与周围环境不同
的特征。滕应等 [ 34 ]用 PCR2DGGE技术分析了重金
属污染农田土壤细菌群落的多样性 ,反映了重金属
复合污染影响到农田土壤生态系统的细菌丰富度 ,
改变土壤环境的优势菌群 ,使农田土壤微生物群落
结构多样性发生变化。Muller等 [ 35 ]用 PCR2DGGE
方法研究了 Hg污染对土壤微生物群落 ,特别是细
菌群落结构的影响。结果反映了 Hg污染改变了细
菌群落结构以及降低了其多样性 ,同时耐 Hg速生
细菌明显变多 ,证明了多样性的减少会降低生态系
统稳定性 ,甚至导致生态系统机能的衰退。
313　DGGE技术在膜生物处理研究中的应用
孙宝盛等 [ 36 ]应用 PCR2DGGE技术解析膜生物
反应器中微生物群落多样性 ,指出不同的膜生物反
应器在长期稳定运行后形成了各自特定的生态群落
结构 ,既有共同的优势种群也有各自特有的种群 ,相
同的微生物种群在不同反应器中的优势地位不同 ,
各自特有的微生物群落则是由于水质的不同经过长
期演替而来。苏俊峰等 [ 37 ]利用 PCR2DGGE技术初
步分析了生物陶粒反应器细菌的种群演替情况 ,结
果表明群落结构和优势种群的数量具有时序动态
性 ,微生物多样性与废水的处理效果出现协同变化
的特征。蒋建文等 [ 38 ]采用 PCR2DGGE技术比较了
生物膜和水体微生物多样性的差异。结果表明随着
微生物膜的逐渐成熟和微生物群落的稳定 ,生物膜
上微生物多样性呈高于水体微生物多样性的态势。
肖勇等 [ 39 ]利用 PCR2DGGE研究处理垃圾渗滤液序
批式生物膜反应器 ( SBBR )中的细菌多样性。结果
表明该驯化后的 SBBR生物膜和渗滤液原水中都有
比较丰富的细菌多样性 ,渗滤液中存在着丰富的厌
氧细菌 ,为生物膜驯化提供了丰富的脱氮功能菌种 ,
驯化的生物膜中同时存在好氧反硝化细菌、厌氧氨
氧化细菌、大量的硝化细菌和反硝化细菌。
4　D GGE技术的展望
DGGE其自身也存在一些缺点 : (1)只能分离较
小的片段 ( < 500 bp) ,对于大片段的分离效率下降。
因此 ,给引物设计和系统发育分析带来一定困难。
(2) DGGE图谱中单一的条带并不总是代表单一的
菌株 ,或是在不同的泳道中移动到同一位置的条带
可能由不同的细菌组成。Sehiguchi等 [ 40 ]在试验中
发现 DGGE图谱中的单一条带不能被测序 ,对带中
DNA进行克隆和基因文库研究发现 ,此条带中包含
多条不同的 DNA序列。 (3) DGGE通常显示群落中
优势种类的 rDNA片段 ,只有占整个群落细菌数量
约 l%或以上的类群能够通过 DGGE检测到。Val2
laeys[ 41 ]发现 DGGE并不能分离样品中所有的 DNA
片段。 (4)由于某些种类的 16S rDNA不同拷贝之
间的多态性问题 ,可能导致自然群落中细菌数量的
过多估计 [ 42 ]。 (5) DGGE技术对微生物的分类鉴定
依赖于基因数据库 ,若数据库中基因序列信息不够
丰富 ,将会限制 DGGE的使用。
DGGE技术作为一项新兴的研究手段和工具 ,
还需要加强和改进以下几个方面 : ( 1)需要摸索适
合具体样品的 DNA提取方法和最佳 PCR条件 ; (2)
优化 DGGE条件和仔细分析具体结果。 ( 3 )加强
DGGE技术与其它技术的联用。有研究中发现 [ 37 ] ,
同一种样品采用不同的方法分析 ,传统方法能够检
测到的细菌 ,在分子方法中却不能被发现 ,这可能是
在 PCR过程中该菌未被扩增的缘故。DGGE方法
可以采用双梯度 DGGE /TGGE,如联合使用一个丙
烯酰胺梯度或温度梯度以达到更好的分辨率 ;利用
末端标记的荧光 PCR产物、附加荧光内泳道标准化
检测稀少群落组成和精确的样品对样品比较。使用
功能型基因作为分子标记也能区别关系相近但生态
15
生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 12期
差异的种群 ; DGGE与克隆文库等技术结合 ,可克服
局限性 ,充分发挥分离的优势。目前的发展趋势是
PCR2DGGE /TGGE与其他分子技术以及微生物学、
地球化学方法联合使用 ,这样可以减少不同技术的
弊端与局限性 ,综合各种技术的优势 ,从而更真实地
揭示环境微生物群落结构和功能的本质。 ( 4)进一
步丰富基因数据库 ,建立更加完善的基因序列信息 ,
为 DGGE技术对微生物的分类鉴定提供更好的信
息平台。
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