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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010 年第 6 期
两种检测生鲜乳中 β-内酰胺酶方法的比较
康海英1，2 王加启1，2 卜登攀1 魏宏阳1，2 李旦1 刘开朗1 王俊2 刘萍2
(1中国农业科学院北京畜牧兽医研究所动物营养学国家重点实验室，北京 100193;
2农业部奶及奶制品质量监督检验测试中心，北京 100193)
摘 要: 采用 Unisensor试剂盒法和杯碟法对 22 份来自不同奶站的生鲜乳中 β-内酰胺酶进行了检测，指出了两种方法
各自的优点和缺点。β-内酰胺酶检测过程中，两种方法应配合使用，简便、快捷的 Unisensor试剂盒法可以做现场及快速检测，
杯碟法可以对 Unisensor试剂盒法的检测结果进行确证。
关键词: 生鲜乳 β-内酰胺酶 Unisensor试剂盒 杯碟法
Comparison of Unisensor Kit and Cylinder Plate
Methods to Detect β-lactamase in Raw Milk
Kang Haiying 1，2 Wang Jiaqi 1，2 Bu Dengpan 1 Wei Hongyang1，2 Li Dan 1
Liu Kailang 1 Wang Jun2 Liu Ping 2
(1State Key Laboratory of Animal Nutrition Institute of Animal Science，Beijing 100193;
2Ministry of Agriculture Milk and Dairy，Quality Supervision and Inspection Evaluation Center，Beijing 100193)
Abstract: β-lactamases in 22 raw milk samples from different milk stations were detected using Unisensor kit and cylinder plate
methods. The advantages and shortcomings of two methods were finally resulted. The conclusion was that two methods should be used at
the same time in detection of β-lactamases. Unisensor kit was used for simple and rapid detection，and cylinder plate method was used
for authentication of the results from Unisensor kit.
Key words: Raw milk β-lactamase Unisensor kit Cylinder plate
收稿日期:2009-12-14
基金项目:国家科技支撑计划(2006BAD04A17-E) ，现代农业产业技术建设专项资金
作者简介:康海英，女，硕士研究生，研究方向:反刍动物营养;E-mail:ying-chinese@ 163. com
通讯作者:王加启，男，研究员，博士生导师;E-mail:Wang-jia-qi@ 263. net
乳中残留的抗生素危害食品安全及人体健
康［1］。近年来，随着国家对乳制品抗生素残留量监
管力度的加大，β-内酰胺酶被一些非法奶商加入奶
及奶制品中，作为“解抗剂”以掩盖其中残留的抗生
素。β-内酰胺酶(β-lactamase，EC 3. 5. 2. 6)是由多
种酶组成的酶家族，能水解 β-内酰胺类抗生素［2］。
2009 年，全国打击违法添加非食用物质和滥用食品
添加剂专项整治领导小组公布的食品中可能违法添
加的非食用物质名单(第二批)》，将 β-内酰胺酶列
入乳与乳制品掩蔽抗生素的违法添加的非食用
物质。
常用的 β-内酰胺酶检测法有理化检测法、微生
物检测法、免疫法检测和试剂盒检测，它们各有优缺
点。理化检测法［3］是利用 β-内酰胺酶分子中的基
因所具有的特殊反应或性质来测定其含量，如高效
液相色谱法、气相色谱法、质谱法和联用技术等。理
化检测法准确性好，敏感性强，重现性好［4］;但检测
程序较复杂，检测费用较高。免疫法是依据抗原抗
体特异性反应的基本特性而设计的检测方法，操作
简单、速度快、特异性强，但操作过程复杂。微生物
法是在规定条件下选用适当微生物测定某物质含量
的方法。杯碟法是微生物法的一种，成本低廉、准确
性好。
本研究通过对卫生部检测乳及乳制品中舒巴坦
敏感 β-内酰胺酶类药物活性的杯碟法试验条件进
行优化，并对该方法与 Unisensor 试剂盒法在对 22
2010 年第 6 期 康海英等:两种检测生鲜乳中 β-内酰胺酶方法的比较
份来自不同奶站的生鲜乳样 β-内酰胺酶检测结果
进行了比较分析。
1 材料与方法
1 1 材料
试验样品为 22 份新鲜奶样。试验菌种为藤黄
微球菌(Micrococcus luteus)CMCC(B)28001，购自
国家医学菌种保管中心。培养基包括斜面营养琼脂
培养基、液体营养琼脂培养基、抗生素检测培养基
Ⅱ。标准物质包括青霉素标准物质、β-内酰胺酶标
准物质、舒巴坦标准物质，均购自中国药品生物制品
检定所。Unisensor试剂盒，购自北京陆桥有限责任
公司。
1 2 杯碟法［5］
1 2 1 培养基的制备 (1)斜面营养琼脂培养基:
10 g蛋白胨，3 g 牛肉膏，5 g NaCl，15 － 20 g 琼脂，
1 000 mL 蒸馏水，搅混均匀，在 120℃下，高压灭菌
15 min，铺斜面待冷却。(2)液体营养琼脂培养基:
10 g蛋白胨，3 g牛肉膏，5 g氯化钠，1 000 mL 蒸馏
水，搅混均匀，在 120℃下，高压灭菌 15 min。(3)抗
生素检测培养基Ⅱ:10 g 蛋白胨，3 g 牛肉浸膏，5 g
NaCl，3 g 酵母膏，1 g 葡萄糖，14 g琼脂，1 000 mL蒸
馏水，搅混均匀，取部分分装至 10 mL离心管中各 5
mL，分装后与余下部分培养基在 120℃高压灭菌 15
min，其最终 pH值约为 6 6。
1 2 2 菌悬液的制备 将藤黄微球菌接种于斜面
营养琼脂培养基上，经(36 ± 1)℃培养 18 h，在斜面
上挑取菌落接种于 1 － 1 5 mL 液体营养培养液中，
(36 ± 1)℃培养 18 h，4 ℃保存，贮存期限 2 周。从
原液中吸取 1 mL的菌液，加入到 9 mL 的生理盐水
中，充分振荡混匀，然后再在稀释 10 倍的菌悬液中
吸取 1 mL，加入到 9 mL 生理盐水中，如此类推，分
别稀释 10 －1 － 10 －6共 6 个梯度的菌悬液，4℃保存，
贮存期限 1 周。
1 2 3 检测平板的制备 取 90 mm 灭菌玻璃培养
皿，底层加 10 mL灭菌的抗生素检测用培养基Ⅱ，冷
却凝固后，上层加入 5 mL含有不同浓度藤黄微球菌
的抗生素检测用培养基Ⅱ，凝固后备用。每个梯度
共制备 3 个平行的检测平板。
1 2 4 标准溶液的配制 (1)青霉素标准溶液:准
确称取适量青霉素标准物质，用磷酸盐缓冲溶液溶
解并定容为 0 10 mg /mL 的标准溶液。现配现用。
(2)β-内酰胺酶标准溶液:准确量取或称取适量 β-
内酰胺酶标准物质，用磷酸盐缓冲溶液溶解并定容
为 1 6 × 104 U /mL的标准溶液。现配现用。(3)舒
巴坦标准溶液:准确称取适量舒巴坦标准物质，用磷
酸盐缓冲溶液溶解并定容为 1 0 mg /mL 的标准溶
液，分装后 － 20 ℃保存备用，不可反复冻融使用。
1 2 5 样品的制备 取 4 个 1 5 mL 离心管，分别
标记为 A、B、C、D，各加入 1 mL生鲜乳样。取纯水 1
mL加入到 1 5 mL离心管中作为对照。
1 2 6 样品的测定 按照表 1 所列顺序分别将青
霉素标准溶液、β-内酰胺酶标准溶液、舒巴坦标准
溶液加入到样品及纯水中，混匀后，将上述 A － D 试
样各 100 μL，加入放置于检验用平板上的 4 个无
菌牛津杯中，(36 ± 1)℃培养培养 18 － 22 h ，测量抑
菌圈直径。每个样品取 3 次平行试验平均值。
表 1 牛奶样品的处理
编号 牛奶样品的处理方法
A 青霉素 G 5 μL
B 舒巴坦 25 μL、青霉素 G 5 μL
C β-内酰胺酶 25 μL、青霉素 G 5 μL
D β-内酰胺酶 25 μL、舒巴坦 25 μL、青霉素 G 5 μL
1 3 杯碟法条件的优化
1 3 1 指示菌浓度对检测方法的影响 采用杯碟
法检测舒巴坦敏感 β-内酰胺酶类药物活性时，控制
检测平板中指示菌的浓度非常重要［6］。分别取
10 －1 － 10 －6共 6 个梯度的 1 mL 菌悬液制备检测培
养基平板，进行检测。
1 3 2 培养时间对检测方法的影响 分别对藤黄
微球菌培养 16、18、22 及 24 h，然后加入检测培养基
中，进行检测。
1 4 Unisensor试剂盒法
1 4 1 试样制备 取经检测为无抗的生鲜牛乳样
品，恢复至室温，充分混匀后备用。
1 4 2 测定步骤 参照试剂盒使用说明进行。打
开加热器，调节温度到 40℃备用;移取 400 μL 的待
测样品至试剂瓶中，混合均匀;将制备好的样品置于
40℃加热器孵育 45 min，使样品中残余的 β-内酰胺
酶与试剂瓶中抗生素结合，充分反应;从试剂瓶中量
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2010 年第 6 期
取 200 μL 试液于微孔试剂中，混合均匀;40℃加热
器孵育 3 min，微孔试剂中的特异性蛋白配体与 β-
内酰胺类抗生素结合反应、显色;将测试条载体编
号，依次按照顺序插入微孔试剂中，40℃孵育3 min，
显色反应完全，取出测试条，与对照显色带目测比较
或于读数仪上判读数值。打开试剂盒之前应先将其
恢复至室温，避免有冷凝水产生使受潮。
2 结果与分析
2 1 杯碟法的优化
杯碟法成本低廉、重复性和准确性好、操作简便，
但是要求条件严密，操作仔细。试验过程中发现，在
众多影响因素中，指示菌浓度和培养时间对试验结果
影响较大，因此本试验对杯碟法的指示菌浓度和培养
时间做了优化，以期得到更准确的检测结果。
不同菌株对敏感物的活性不同，在检测乳酸菌素
中，指示菌浓度为 106个 /mL［7］，但是根据本试验中对
不同梯度菌数进行检测，发现藤黄微球菌对青霉素敏
感程度很高，即使菌数大于 1010时，产生的抑菌圈差
异也很明显，且根据标准中提供的检出限，也能得出
很好的检测结果，因此，在使用杯碟法检测 β-内酰胺
酶类药物活性时，可以考虑将该菌传代 1 －2 次后，适
当稀释 10 － 100 倍(菌浓度为 1010 － 1011)后，进行检
测。指示菌浓度优化结果如表 2所示。
进一步分析了培养时间对指示菌生长情况和抑
菌圈大小的影响，结果(表 3)发现，培养时间过短，
该菌生长偏稀;时间过长菌过密，抑菌圈偏小，产生
较大的测量误差。在培养 18 h 时抑菌圈边界清晰，
抑菌圈大小适中。
表 2 检测平板中指示菌浓度
对抑菌圈大小的影响
指示菌浓度
(个 /mL)
稀释
倍数
抑菌圈 指示菌生长情况
1012 100 清楚，但圈小 过密
1011 10 －1 清楚，圈适中 较密
1010 10 －2 清楚，圈稍大 密
109 10 －3 较清楚，圈偏大 稍密
108 10 －4 较清楚，圈过大 稀疏
107 10 －5 不太清楚，圈过大 很稀疏，且生长不均匀
106 10 －6 不清楚，圈太大 非常稀疏，且生长不均匀
表 3 培养时间对抑菌圈大小的影响
培养时间(h) 抑菌圈 指示菌生长情况
16 较清楚，但圈偏大 稍密
18 清楚，圈适 中密
22 清楚，圈偏小 过密
24 清楚，圈偏小 过密
2 2 结果判定
根据杯碟法的结果判定，纯水样品结果应为
A、B、D均应产生抑菌圈;A 的抑菌圈与 B 的抑菌
圈相比，差异在 3 mm以内(含 3 mm) ，且重复性良
好;C 的抑菌圈小于 D 的抑菌圈，差异在 3 mm 以
上(含 3 mm) ，且重复性良好。如为此结果，则系
统成立，可对样品结果进行判定。如果样品结果
中 B 和 D均产生抑菌圈，且 C 与 D 抑菌圈差异在
3 mm以上(含 3 mm)时，可按以下标准判定结果:
A的抑菌圈小于 B 的抑菌圈，差异在 3 mm 以上
(含 3 mm) ，且重复性良好，应判定该试样添加有
β-内酰胺酶，报告 β-内酰胺酶类药物检验结果
(图 1)阳性;A的抑菌圈与 B 的抑菌圈差异小于 3
mm，且重复性良好，应判定该试样未添加有 β-内
酰胺酶，报告 β-内酰胺酶类药物检验结果阴性。
如果 A和 B 均不产生抑菌圈，应将样品稀释后再
进行检测。
图 1 杯碟法结果
分别采用杯碟法与 Unisensor 试剂盒，对 22 份
来自不同奶站的奶样中 β-内酰胺酶进行检测，结果
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如表 4 所示。由表 4 可以看出，被检 22 份样品经
Unisensor试剂盒法可检测出 15 份阳性样品，阳性
率为 68. 2%;杯碟法可检出 18 份阳性，阳性检出率
为 81 2%。用 Unisensor 试剂盒检测每个样品耗时
1 h左右，成本为 20 － 30 元;杯碟法检测耗时 18 h，
成本在 5 元以内。
表 4 Unisensor试剂盒和杯碟法结果
方法 阳性份数 阴性份数 合计份数 阳性率 检测成本(元) 检测时间(h) 检出限
Unisensor试剂盒 15 7 22 68 2 20 － 30 1 12 ×10－3 IU/mL
杯碟法 18 4 22 81 2 5 00 18 4 U /mL
3 讨论
杯碟法是微生物测定法的其中一种，主要采用
对青霉素类药物绝对敏感的标准菌株(藤黄微球
菌) ，利用舒巴坦特异性抑制 β-内酰胺酶的活性，并
加入青霉素作为对照，通过比对加入 β-内酰胺酶抑
制剂与未加入抑制剂的样品所产生的抑制圈的大
小，间接测定样品是否含有 β-内酰胺酶类药物。该
检测方法对试验要求比较严格，试验条件也要求严
密。本试验对每个样品做了 3 个重复，重复性为
95%，结果重复性良好;检测限为 4 U /mL，最小检出
限率较低，且从本试验中看出，经条件优化后，其检
测限低于4 U /mL，可低至 1 U /mL;操作简便，容易
上手，适合大批量样品的实验室集中检测，不但可以
提高准确性，还能节约成本。
Unisensor试剂盒法采用间接竞争法，利用 β-内
酰胺酶可分解 β-内酰胺类抗生素的原理，通过配
体-受体识别法快速测定与 β-内酰胺酶反应后残留
的青霉素 G 抗生素的含量。生鲜牛乳样品中添加
已知含量的 β-内酰胺类抗生素受体与样品中残留
的 β-内酰胺酶特异性配体蛋白结合反应，残余的 β-
内酰胺酶与载体上包被有 β-内酰胺类抗生素的结
合反应，β-内酰胺类抗生素被分解后显色，与标准
溶液色带对照定性。该法快速、精确、结果稳定，不
需要经过复杂的样品前处理，结果直观易懂，但是单
个样品检测价格昂贵，较适用于少量样品的现场操
作及快速检测。
本试验中 β-内酰胺酶阳性率较高，这可能与样
品采集有关，因为只采集了某一市区的奶样，不代表
整个奶业的现状。我国 β-内酰胺酶添加状况，有待
于全国范围内采样证实。杯碟法和 Unisensor 试剂
盒法各有优缺点，Unisensor 试剂盒法可用于现场操
作及快速检测，国标杯碟法可以对 Unisensor 试剂盒
法的检测结果进行确证。
参 考 文 献
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