全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 1期
金玉兰酶制剂 ( 内酰胺酶 )抗体制备及初步应用
张小兵 1 吴萌 1 齐颖颖 1 邸禄芹2 李君华 1
李春生 1 成凯琳 3 闫静辉1
( 1河北省生物研究所,石家庄 050081; 2河北医科大学第三医院,石家庄 050051; 3石家庄市第一中学,石家庄 050011)
摘 要: 以金玉兰酶制剂 (内酰胺酶 )为抗原, 制备出对 内酰胺酶特异的多克隆抗体和单克隆抗体, 并进行了抗体
纯化和特性分析。采用 TasELISA, 初步对牛奶中的 内酰胺酶进行了检测。结果表明利用该检测体系可实现对牛奶中 内
酰胺酶的检测, 并且该体系灵敏度高, 特异性强,重复性好。
关键词: 单克隆抗体 多克隆抗体 牛奶 内酰胺酶 免疫检测
Production of Antibodies AgainstLactamase and
Prelim inary Study on Detecting the Enzyme
Zhang X iaobing
1
W uM eng
1
Q iY ingying
1
Di Luqin
2
L i Junhua
1
L iChunsheng
1
Cheng Kailin
3
Yan J inghui
1
(
1
B iology Institute of H ebei, Shijiazhuang 050081;
2
The ThirdH osp ital ofH ebeiM edical University,
Shijiazhuang 050051; 3TheN o. 1 H igh School of Shijiazhuang, Shijiazhuang 050011)
Abstrac:t Us ing Lactam ase produced by J in Yulan com pany as the antigen, po lyclona l antibodies( PcAbs) and m onoc lona l anti
bod ies(M cAbs) spec ific to Lactam asew ere generated, cha racte rized and purified. By using a threeantibodysandw ich enzymelinked
immunoso rbent assay( dasELISA ), pre lim inary study on detec ting Lactam ase w as d iscussed. The resu lts show ed that the TasELISA
had h ighe r spec ific ity, sensitiv ity, and repeatability in detecting Lac tam ase.
Key words: M onoclona l antibody Po lyc lona l antibody M ilk Lactam ase Imm unoassay
收稿日期: 20090713
基金项目:河北省科技支撑计划项目 ( 09227114D )
作者简介:张小兵,男,高级工程师,主要从事生物技术的应用研究; Em ai:l 9 xiaob ing9@ sina com
通讯作者:闫静辉,男,研究员,主要从事细胞生物学及抗体工程技术的研究; Em ai:l Yan jinghu@i 126 com
随着国家对食品安全问题的关注和部分乳制品
企业 2010年 无抗奶 !目标的提出, 抗生素残留问
题成为影响乳制品安全的重要因素之一。目前,青
霉素作为 内酰胺类药物是治疗牛乳腺炎的首选
药物,是牛奶中最常见的残留抗生素。由于国内多
数乳品企业对抗生素残留超标的牛乳采取降价收购
的原则,出于经济利益的驱动, 一些不法奶站人为的
使用一些生物制剂降解牛乳中残留的抗生素, 生产
人造 无抗奶 !。 2005年至今,已有数家公司公开宣
称出售分解牛乳中残留抗生素的解抗剂。该解抗剂
的主要成分是 内酰胺酶,由革兰氏阳性细菌产生
和分泌,可选择性分解牛奶中残留的 内酰胺类抗
生素。内酰胺酶能够使青霉素内酰胺结构破坏而
失去活性,导致病原体对青霉素、头孢菌素等抗生素
类药物耐药性增高,从而大大降低了人们抵抗传染
病的能力,给消费者的身体健康带来危害。因此,
内酰胺酶为我国不允许使用的食品添加剂, 该酶的
使用掩盖了牛奶中实际含有的抗生素。
迄今为止,还没有针对人造 无抗奶 !的相应检
测方法、检测标准, 无法从源头上监测、把控原奶质
量。因此,建立快速、简单、方便、有效的检测手段是
控制 内酰胺酶非法使用的关键。目前, 已初步建
立了利用 T asELISA免疫检测技术测定牛奶中 内
酰胺酶的方法。
2010年第 1期 张小兵等: 金玉兰酶制剂 ( 内酰胺酶 )抗体制备及初步应用
1 材料与方法
11 主要试剂和仪器
新西兰大白兔 (河北实验动物中心 ) , 雌性
BALB /c小鼠 (河北实验动物中心 ) , 内酰胺酶
( 2 mg /mL,酶活性∀ 3 000万单位,金玉兰酶制剂 ) ,
HAT、HT、PEG、福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂
( Sigma公司 ) ,辣根过氧化物酶标记羊抗兔 IgG(北
京中杉金桥生物技术有限公司 ), 小鼠 SP2 /0AG14
骨髓瘤细胞 (本研究室保存 ), DMEM 培养基、细胞
培养板 ( G IBCO公司 ) ,辣根过氧化物酶标记羊抗小
鼠 IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司 ) ,小鼠单
克隆抗体亚型试剂盒 ( S igma公司 )。其它试剂均为
分析纯。
96孔聚苯乙烯酶标板 (厦门云鹏科技发展有限
公司 )、酶联免疫检测仪 ( TECAN )、凝胶成像仪
(UVP)。
12 多克隆抗体的制备 [ 1]
用于免疫的 4只新西兰大白兔为健康雄性,体
重为 2- 3 kg, 分别命名为生 1A、生 1B、生 2A和
生 2B。免疫方案:取 内酰胺酶 700 g用生理盐
水稀释至 500 L, 加等体积福氏佐剂充分乳化后,
于兔背部皮下多点注射。第 1次基础免疫用福氏完
全佐剂,以后的加强免疫用福氏不完全佐剂。每次
免疫间隔 2周。每次免疫后 10 d在兔耳缘静脉抽
取少许血,分离血清, 检测免疫效果。在血清效价达
到 1#60万以上时,从颈动脉放血,分离血清。
13 单克隆抗体的制备
131 动物免疫及杂交瘤细胞株的建立 [ 2] 用 6
只 7- 8周龄雌性 BALB / c小鼠, 首次基础免疫用福
氏完全佐剂与等体积 内酰胺酶溶液 ( 内酰胺酶
用量为 100 g /只小鼠 )混合乳化后颈背部多点注
射。两周后作第 2次免疫, 用福氏不完全佐剂与首
次相同剂量抗原乳化后颈背部多点注射。再两周后
ELISA法测小鼠血清抗 内酰胺酶效价, 选取一只
最佳免疫小鼠融合前 3 d腹腔注射抗原液 100 g
作加强免疫。
取对数生长期的小鼠 SP2 /0骨髓瘤细胞与免疫
脾细胞按常规方法用 50% PEG进行融合。用间接
ELISA检测培养上清。选择强阳性克隆,用有限稀
释法连续克隆化 2 - 3次, 直至有克隆孔 内酰胺
酶抗体 100%阳性。将建立的稳定分泌高特异、高
效价 内酰胺酶单克隆抗体的杂交瘤细胞株扩增
培养后,置液氮中保存。
132 腹水抗体的制备及特性分析 将各种抗
内酰胺酶杂交瘤细胞分别接种于预先注射石蜡油致
敏的成年雌性 BALB / c小鼠腹腔内, 7- 10 d后收集
腹水。
14 抗体的特性分析
以间接 ELISA法对多克隆抗体和各种杂交瘤
腹水的抗体效价进行测定; 用阴性鲜牛奶包被酶标
板, 采用间接 ELISA法对各抗体特异性进行测定;
多克隆抗体检测以免疫前血清为阴性对照, 单克隆
抗体以免疫小鼠血清为阳性对照, Sp2 /0细胞培养
上清为阴性对照。采用 S igma公司抗体亚型检测试
剂盒对单克隆抗体抗体类型及亚类进行测定。采用
非竞争酶免疫试验 [ 3]对单克隆抗体的亲和力常数
进行测定。
15 抗体的纯化与鉴定
用蛋白 A纯化兔抗血清和小鼠腹水 [ 4, 5]。用
SDSPAGE法对抗体纯度进行鉴定 [ 6] , 并用凝胶成
像系统进行分析。采用紫外吸收法 [ 7]对抗体浓度
进行测定。
16 牛奶中 内酰胺酶的检测方案
用 001 mol /L pH96碳酸盐缓冲液将单克隆
抗体稀释至 5 g /mL包被酶标板, 4∃ 过夜; 用
PBS /T20洗板 3次, 每次 3 m in; 用含 3%小牛血清
的 PBS /T20封闭, 37∃ 孵育 1 h, 洗板; 牛奶样品,
37∃ 孵育 30 m in, 洗板; 加入多克隆抗体, 37∃ , 30
m in, 洗板;加入 HRP标记羊抗兔 IgG, 37∃ , 30m in,
洗板;加入 TMB显色液, 37∃ 避光反应 15 m in后,
加入终止液;读取波长为 450 nm时的 OD值。
2 结果与讨论
21 兔抗 内酰胺酶多克隆抗体的获得及其免疫
学分析
新西兰大白兔免疫 4次后,测定效价分别达到
生 1A 1#327万、生 1B 1#655万、生 2A 1#163万
和生 2B 1#163万 (图 1), 分别获得抗血清 30、55、
30和 60mL。
包被 内酰胺酶阴性牛奶,利用间接 EL ISA测
定多克隆抗体的特异性,结果如图 2,表明 4株多抗
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 1期
的交叉反应分别是生 1A 1#6400、生 1B 1#400、生
2A 1#400、生 2B 1#400。
选取特异性好、效价高的多克隆抗体生 1B
28mL进行纯化, 获得 300 L纯化抗体。纯化兔抗
内酰胺酶多抗蛋白含量用紫外分光光度法测定为
1083mg /mL, 凝胶成像分析纯度可达 88%。
22 鼠抗 内酰胺酶单克隆抗体的获得
221 分泌抗 内酰胺酶单克隆抗体的杂交瘤细
胞株的建立 共进行了两次细胞融合, 每次用 6块
96孔板,平均每孔有 1- 2株融合细胞生长, 融合率
为 100%。经过对阳性杂交瘤细胞株进行多次有限
稀释克隆,共获得 18株稳定分泌抗 内酰胺酶单
克隆抗体杂交瘤细胞株, 经过初步的试验优选其中
的 5株细胞株进行下一步试验, 分别命名为 4A 2、
1B3、4G11、3G4和 1B10。
222 单克隆抗体的制备及纯化 5株杂交瘤细
胞株分别注射到小鼠腹腔诱发腹水, 每只获取 4-
8 mL的优质腹水。腹水效价为 10万 - 655万 (图
3)。分别取 2- 3 mL进行纯化,获得抗体约 250 -
300 L。纯化后蛋白含量 106- 155 mg /mL,凝胶
成像分析纯度达到 84% - 87%。
23 抗体的免疫学特性检测结果
在包被阴性鲜牛奶的间接 ELISA试验中, 单
克隆抗体皆无交叉反应; 经亚型检测试剂盒鉴定,
4株单克隆抗体分别是 1B3和 1B10为 IgG1, 4A2、
4G11和 3G4为 IgG2b(图 4 )。 5株抗体的亲和力
常数为 1 % 107 - 1 % 1010 L /m o,l其中, 4A2的亲和
力是 1 % 1010 L /mo l(图 5)。经比较后, 选择多克隆
抗体生 1B与单克隆抗体 4A 2配对做下一步
试验。
24 TasELISA检测限范围的确定
选择金玉兰酶制剂的初始酶活力为 1 500 U /
L,按 2n ( n= 0, 1, 2& )倍比稀释,进行 内酰胺酶
的测定。反应后的 OD值结果 ( R2 = 0994 14)如图
6所示。
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2010年第 1期 张小兵等: 金玉兰酶制剂 ( 内酰胺酶 )抗体制备及初步应用
由图 1可以看出,当金玉兰酶制剂稀释 29倍至
2
15倍 (即 5 859- 9155 U /mL)之间时, OD值与金
玉兰酶制剂酶活浓度呈正相关线性关系。该 Tas
ELISA法的检测线性范围是 9155- 5 859U /mL。
25 T asELISA检测标准曲线确定
选择金玉兰酶制剂的初始酶活浓度为 5859酶
活单位 /mL,按 2n倍比稀释,进行测定。根据试验结
果,可绘制 内酰胺酶酶活浓度与 OD值标准曲线,
如图 7。根据线性回归公式得线性回归方程。
图 7 内酰胺酶活力单位标准曲线
将代测样品做适当稀释后,运用双抗夹心 ELISA
法,测定 OD值,就可以根据同时绘制得标准曲线, 计
算出牛奶样品中的 内酰胺酶的酶活单位。
26 T asELISA检测的特异性
牛奶的化学成分很复杂,至少有 100多种, 主要
成分由水、脂肪、磷脂、蛋白质、乳糖、无机盐等组成。
检测新鲜 内酰胺酶阴性乳头奶中的各成分对
TasELISA的干扰是必要的,结果如图 8。
图 8 TasELISA法特异性试验结果
从图中可以清晰的得出, 内酰胺酶阴性乳头
奶中的成分对该方法没有干扰, 效果与空白对照无
异。但含有 内酰胺酶的处理可容易的测出, 表明
该方法可用于检测牛奶中添加的金玉兰酶制剂, 特
异性较强。
27 准确性试验
取 55份原料奶用该方法进行检测,阳性样品用
杯碟法进行验证,结果符合率为 100%。
3 小结
本试验建立了利用免疫学方法检测牛奶中的金
玉兰酶制剂的 TasELISA法。该方法具有专一、灵
敏、准确、快速的特点。检测的线性范围是 9155 -
5 859U /mL之间。对单克隆抗体的进一步筛选和
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 1期
改造, 可以提高抗体的亲和力, 生物素和亲合素系统
可提高检测的灵敏度,正在进行进一步的研究,以期
提高该系统的灵敏度。
说明: 作者于 2009年在本刊第 11期发表的文章 ∋单克
隆抗体与多克隆抗体配对 ELISA方法比较(的基金项目与
此文相同
参 考 文 献
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湖北科学技术出版社, 2002, 23- 25.
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