全 文 ：综述与专论
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2009年第 4期
昆虫病原线虫共生菌杀虫蛋白的研究进展
薛仁风 王晓婧 李梅 曾凡荣
(中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室,北京 100094)
摘 要: 昆虫病原线虫共生菌杀虫蛋白对许多农业害虫都有很明显的毒杀作用, 作为一种新型的具有开发潜力和应用
前景的生物防治资源 ,已经引起科学家们的关注并成为国内外研究的热点之一。综述了昆虫病原线虫共生菌杀虫蛋白基因
的结构和功能及其杀虫机制方面的研究进展。
关键词: 昆虫病原线虫共生菌 嗜线虫致病杆菌 发光杆菌 杀虫蛋白
Research Progress of Toxic Protein from Entomopathogenic
Nematodes Symbiotic Bacteria
XueRenfeng W ang X iaojing L iM ei Zeng Fanrong
( StateK ey Laboratory for B io logy of PlantD iseases and InsectP ests, Institu te of P lant Protection, CAAS, B eijing 100094)
Abstrac:t En tom opathogen ic nem atodes symb io tic bacteriaw ith a var iety o f tox ic prote in have obv ious tox icity to m any ag ricu ltur
a l insects. This paper rev iew ed the progress on struc ture, function of the tox ic prote in gene from entomopathogenic nema todes sym biotic
bacter ia , and m echanism of tox ic prote in to k ill insects.
Key words: En tom opathogen ic nem atodes symb iotic bacteria X enorhabdus Pho torhabdus Tox ic prote in
收稿日期: 20080919
基金项目:中国农业科学院人才基金和人事部优秀项目基金
作者简介:薛仁风 ( 1982) ,男,在读硕士研究生,研究方向:生物化学与分子生物学; Te:l ( 010) 821095713514, Ema i:l xu er@f yahoo. cn
通讯作者:曾凡荣, Em ai:l zengfr@ caas. net. cn
昆虫病原线虫共生菌是一类新型的具有开发潜
力和应用前景的生物资源。在昆虫病原线虫共生菌
复合体对昆虫的致病作用中, 起主要作用的是共生
菌。当线虫进入昆虫体内后,即在昆虫血腔内释放共
生菌,共生菌大量繁殖并分泌杀虫物质,在短时间内
使昆虫死亡。近年来,随着研究的不断深入,昆虫病
原线虫共生菌杀虫蛋白表现出杀虫能力强、杀虫快速
高效等诸多优点,因而从共生菌中克隆杀虫蛋白基因
用于新型生物农药的研制和转基因抗虫作物的开发。
现已描述的共生菌有两个属 嗜线虫致病杆菌属
(X enorhabdus)和发光杆菌属 (Photorhabdus)。
1 嗜线虫致病杆菌属杀虫蛋白基因及其
功能
嗜线虫致病杆菌 (X enorhabdus)是与斯氏属线
虫 ( S teinernema )共生的一种致病杆菌, 包括 X.
nematophilus、X. poinarii、X. bovienii、X. beddingii、X.
japonica等多个属,其中对 X. nematophilus来源的杀
虫蛋白研究报道较多。Xpt杀虫蛋白是一类由 X.
nematophilus分泌的一种杀虫谱广、杀虫活性很高的
蛋白复合体,是目前为止研究最透彻、应用前景最被
看好的杀虫蛋白之一。
2001年, M organ等 [ 1]从 X. nematophilus PMF1296
品系的粘粒文库中筛选到一个粘粒克隆, 对菜青虫
(P ieris rapae )有口服毒性。该粘粒克隆所携带的杀虫
蛋白基因簇包括多个开放读码框 ( ORFs),主要由 3个
相同方向转录的开放读码框 xp tA2、xptB1、xptC1和一个
反方向终止开放读码框 xp tA1构成 [ 2], xp tA1和 xptA2之
间有一定同源性。崔龙等 [ 3, 4]从X. nematophilus BP的
粘粒文库中筛选出多个克隆对棉铃虫 (H elicoverpa ar
migera)具有口服毒性。对这些粘粒克隆中的杀虫基因
分析发现, X. nematophilus BP中的杀虫基因簇同样具
有 xptA1、xp tA2、xp tB1、xp tC1和 xp tD1等 5个开放读码
框,且基因结构与 X. nematophilus PMF1296的杀虫基
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2009年第 4期
因簇相同。X. nematophilus的 xptA1、xp tA2、xp tB1、xp tC1
和 xp tD1等 5个开放读码框的核苷酸序列和编码氨基
酸序列与已经公布的 P lum inescensW14分泌的杀虫基
因及蛋白均有一定的同源性。
编码 Xpt杀虫蛋白的 xp t基因簇中各基因对不同
的目标昆虫杀虫活性是不同的,而且杀虫活性是由多
个基因共同决定的,虽然各个基因的单独表达产物都
具有一定毒性,但多个基因联合表达时杀虫活性会大
幅度地提高。Morgan等 [ 1]对 Xnematophilus杀虫蛋白
基因 xp tA1、xp tA2、xp tB1、xp tC1和 xp tD1基因插入突变
子的昆虫口服毒性进行了分析,发现 xp tA1是表达杀虫
活性的主效基因,在大肠杆菌中表达的重组蛋白对欧
洲粉蝶 (P ieris brassicae)有抑制和杀死作用, xp tA1与
xptB1和 xp tC1基因联合表达蛋白具有更高的杀虫活
性。Sergeant等 [ 2]研究了 xp tA1、xp tA2、xp tB1和 xp tC1
基因交互作用。其中 xp tA1、xptB1和 xp tC1基因表达产
物对欧洲粉蝶 (Pbrassicae)和菜青虫 (Prapae)具有杀
虫活性, xp tA2、xp tB1和 xptC1基因表达产物对烟蚜夜
蛾 (H eliothis virescens)具有杀虫活性, 单个基因在大肠
杆菌中的表达产物对目标昆虫的杀虫活性较低。xp tB1
和 xp tC1联合表达产物与 xptA1表达产物混合饲喂欧
洲粉蝶和菜青虫,或 xp tB1和 xp tC1联合表达产物与
xptA2表达产物混合饲喂烟蚜夜蛾则恢复较高的杀虫
活性。Sergeant等的研究显示, xp tA1和 xp tA2基因是该
基因簇的主效基因, xp tB1、xp tC1和 xp tD1基因则主要
起到增效的作用,能明显提高 xp t基因簇的杀虫活性。
崔龙等 [ 3, 4]通过对 X nematophilusBP杀虫基因簇中各
开放读码框与对棉铃虫口服毒性的关系研究发现,
xptC1和 xp tA2两个基因中缺少任何一个都会使口服毒
性大幅度地下降或完全消失,而缺少 xp tD1和 xp tA1对
杀虫活力影响很小。xp tA2的单独表达产物具有口服
毒性,但与多基因的联合表达产物相比,其杀虫活性明
显降低。
随着研究的深入, X enorhabdus中陆续有其他杀
虫蛋白及基因被发现,已经成为杀虫蛋白家族重要的
组成部分。Brown等 [ 5]从 47种 X enorhabdus中均分
离出一个编码 40 kD蛋白的完整杀虫基因, 或杀虫基
因片段。分析发现,不同菌株中得到的基因之间具有
很高的同源性, 但与其他种杀虫基因差异较大,是近
年来发现的又一系列新型杀虫蛋白。X enorhabdus菌
株中分离到的 Txp40系列的杀虫蛋白对大蜡螟幼虫、
棉铃虫幼虫和铜绿蝇都具有很好的口服毒性,向鳞翅
目昆虫的幼虫体内注射 Xnematophilus A24产生的
Txp40毒素 ( A24tox)几乎可以立即使测试昆虫拒食。
Morgan等 [ 1]从 X bovieniiH31和 I73菌株中分离到高
活性杀虫蛋白,对欧洲粉蝶等多种农业害虫都有毒杀
作用,并发现这些杀虫蛋白和 Bt杀虫蛋白具有交互
增效作用, 杀虫活性可提高 6倍以上。 Sm ig ielsk i
等 [ 6]从嗜线虫致病杆菌 Xnematophilus A24中获得
一个 12 kb的基因, 编码一个 30 kD的杀虫蛋白,数
微升含该毒蛋白的发酵液即可杀死大蜡螟幼虫。该基
因在高强度洗脱条件下仅与同一种的菌株 DNA杂交,
而不能与其他同属细菌杂交,显示该杀虫蛋白基因类
型的分布具有局限性。 Joo Lee等 [ 7]从 X nematophilus
中克隆的 tccC1杀虫基因在大肠杆菌中表达杀虫蛋白,
注射大蜡螟幼虫 2 d后致死率达到 80%。Khandelw al
等 [ 8]首次提取X nematophilus中的菌毛蛋白质复合物,
克隆表达得到 17 kD重组蛋白, 重组蛋白对棉铃虫
(Harm igera)初孵幼虫具有杀虫活性,对较大龄期的棉
铃虫的发育也有一定的影响。
2 发光杆菌属杀虫蛋白基因及其功能
发光杆菌 (Photorhabdus)与异小杆属线虫 (H eter
orhabd itis)共生, 1993年该属从嗜线虫致病杆菌属中
分出,现已分离到具有不同程度的杀虫活性的菌株。
在脱离昆虫寄主培养的条件下, Photorhabdus能够向
胞外分泌大量复合物,包括杀虫蛋白、蛋白酶、脂肪酶
和脂多糖等,其中对 tc杀虫基因及其编码的蛋白的研
究报道较多。2003年, Plum inescens TT01菌株基因
组全序列测序完成,序列分析表明发光杆菌为已知基
因组序列的细菌中含有杀虫蛋白基因最多的一类细
菌,这些杀虫蛋白对多种害虫都具有毒杀和生长抑制
的作用 [ 9] ,有很高的研究价值和应用前景。
Tc杀虫蛋白复合物是一种高活性毒素,由 tc杀虫
基因簇编码。 1998年, Bowen等 [ 10, 11]首次报道在发光
杆菌 (Plum inescens) W 14中存在一个杀虫蛋白复合
体,并克隆到 4个杀虫基因,分别为 tca、tcb、tcc和 tcd。
这 4个基因有两种基因组织结构: ( 1) tca、tcc和 tcd有
多个开放读码框,其中 tca含有 tcaA、B、C、Z 4个开放
读码框, tcc同样含有 tccA、B、C、Z 4个开放读码框, tcd
含有 tcdA、B 2个开放的读码框,其中 tcaZ和 tccZ开放
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2009年第 4期 薛仁风等: 昆虫病原线虫共生菌杀虫蛋白的研究进展
的方向均与其他读码框相反; ( 2) tcb则只有一个长开
放读码框,但这些杀虫基因之间有较高的同源性 [ 12, 13]。
W aterfield等 [ 14]在P lum inescensW14的基因组中找到
一个基因岛包括多个拷贝的 tc基因,在这个基因岛中,
有 3个拷贝的 tcdA类似基因 ( tcdA1、tcdA2和 tcdA3 )、2
个拷贝的 tcdB类似基因 ( tcdB1和 tcdB2 )以及 5个拷贝
的 tccC类似基因。 tcaA和 tcaB基因编码的蛋白与开
放读码框 tcdA1编码的蛋白有一定的相似性, tcaC与
tcdB1、tcdB2 , tccC1与 tccC3同样具有较高的同源性。
这个基因岛与 nrgA基因相连, nrgA所编码的 4!磷酸泛
酰巯基乙胺基转移酶 ( 4!phosphoanteth einy l transfer
ase)是肠杆菌素合成所必需的酶, 该基因缺失后
Plum inescens不能支持其共生线虫的生长 [ 14] ,说明在
Plum inescens中致病基因与共生基因处在基因组中相
邻的位置。在 tc位点周围还常常有一些开放读码框与
gp13和 gp19两个噬菌体基因相似,这两个开放读码框
的编码蛋白又分别与沙门氏菌的溶菌酶和穿孔蛋白有
同源性。因此,W aterfield等 [ 15]认为 Plum inescensW14
的杀虫蛋白基因可能本身就是一个隐蔽原噬菌体 [ 16]
的一部分。
W aterfield等 [ 15, 17]对从 Plum inescensW14克隆到
的 tc杀虫基因的功能分析发现, Photorhabdus对昆虫的
口服毒性与多个基因的联合表达有关, 并且这些基因
中均有 3个明显的保守区,即 tcaAB或 tcdA 类似基因、
tcaC或 tcdB类似基因、tccC类似基因。这 3个保守区
的普遍存在说明其对口服毒性可能是必须的。经过进
一步的研究, tccC与 tcdA和 tcdB基因的联合表达对烟
草天娥 (M sex ta )有明显毒性,缺少 tccC的 tcdA与 tcdB
的重组质粒表达产物对烟草天娥 (M sex ta )无明显口
服毒性,说明 TccC在杀虫蛋白的口服毒性中起重要作
用。单独的 TcdA1蛋白本身就具有一定的杀虫活性,
这一点在转有 tcdA 1基因的植物所表现抗虫性状中已
经得到证实 [ 18]。Waterfield等实验证明,与 TcdA1蛋白
相似性较高的 TcaA、TcaB蛋白同样具有单独的杀虫毒
性,且与 TcdB1、TccC1或 TcdB2、TccC3蛋白混合或与
其基因联合表达, 能不同程度提高对烟草天娥
(M sex ta)的口服毒性。然而, Bow en将 Plum inescens
W14菌株中分离到杀虫蛋白基因 tc基因簇中 tc基因
分别转入大肠杆菌,诱导表达获得了目的蛋白,却无杀
虫活性。
除以上研究较深入的杀虫蛋白基因外, Brown
等 [ 5]从 12种 Photorhabdus菌株中分别分离 Txp40系列
的杀虫基因是独立的转录单位,并不是以基因簇的形
式存在的多个基因的中的一个组成部分, 这也是继
Plum inescensW14的 tc基因簇和 Xnematophilus中的
txp基因簇后,发现的又一类在众多Photorhabdus和X e
norhabdus的不同菌种中都存在的新型杀虫蛋白。
另外, D aborn等 [ 16] 从 P lum inescens W14 和
K122菌株中分离到了一个独立的杀虫蛋白基因 mcf
基因。m cf基因是 Photorhabdus中一类较大的独立
杀虫基因,转化有该基因的大肠杆菌能够在短时间
内毒杀昆虫。经过序列分析, m cf杀虫基因与其他
杀虫基因缺乏同源性,杀虫蛋白的空间结构分析表
明存在一个 BH3结构域,能够启动昆虫血细胞和中
肠上皮组织细胞的凋亡。Ensign等也发现发光杆菌
(P lum inescens )代谢物中有一种 40 kD的具有昆虫
毒性的胞外蛋白分泌物, 此毒素既无蛋白水解酶活
性, 也无磷酸脂酶活性, 这种蛋白由多亚基组成, 并
不具有胃毒活性,注射毫微克便可在 24 h内即可杀
死烟草天娥 (M sex ta )5龄幼虫 [ 19]。
3 Photorhabdus和 Xenorhabdus杀虫蛋白
的杀虫作用机制
目前, 国内外已陆续开展了关于昆虫病原线虫
杀虫蛋白杀虫作用机制方面的研究, 但多处于探索
阶段,有待进一步研究。
通过对 tc基因簇重组质粒在大肠杆菌表达后
形成的超分子结构进行 TEM观察, 发现只有 tcdA
和 tcdB的重组质粒在大肠杆菌中的表达物可形成
特殊的超分子结构,而 tccC与 tcdA 和 tcdB的重组质
粒在大肠杆菌中的表达产物对这种超分子结构没有
明显改变。W aterfield[ 15, 17]对这一现象的解释是, tc
dA和 tcdB基因所表达产物共同组成杀虫蛋白的运
输系统,而 tccC本身是一个通过这个运输系统运输
的具有活性的毒素。 B lackburn等 [ 20]观察注射或饲
喂 Tca后的烟草天娥 (M sex ta )的幼虫中肠的组织
变化发现,其病理特征与 Bt杀虫晶体蛋白相似 [ 21] ,
Tca蛋白对昆虫中肠有特殊的作用, 对昆虫的其它
组织没有影响,连续取食后, 昆虫中肠上皮膜迅速分
解脱落到肠腔中。当注射 Tca蛋白到昆虫体内时,
发生类似的中肠反应,细胞聚集并从上皮膜脱落,在
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2009年第 4期
上皮膜的边缘可检测到 Tca蛋白 [ 13]。进一步研究
发现, Tca杀虫蛋白对昆虫肠道的作用位点具有一
定的特异性, 首先作用于昆虫前中肠, 烟草天蛾
(M sex ta )在取食毒蛋白 3h后, 前中肠柱状细胞顶
端膨大成囊泡状,并被挤压进入肠腔,随着取食时间
的延长,囊泡与细胞基部脱离, 形成圆形或椭圆形的
泡状物进入肠腔,最后中肠只剩一层细胞,胞间出现
一定的距离, 形成一些空囊, 直至引起肠壁细胞的
死亡 [ 9, 21]。
B rown
[ 5]等从 X enorhabdus和 Photorhabdus中分
离到的 Txp40系列杀虫蛋白功能与许多其他的杀虫
蛋白类似,经初步的组织学研究表明该蛋白作用的
主要位置是昆虫的中肠。向棉铃虫幼虫体内注射
100 ng Txp40蛋白后 12 h, 棉铃虫幼虫中肠表皮细
胞分离并产生很大的间隙。注射 18 h后,大量肠道
表皮细胞开始脱落至肠腔中。24 h后, 棉铃虫幼虫
的中肠已被完全破坏, 基底膜已经开始被分解并且
延伸至前肠和后肠。
X nematophilus的菌毛亚基蛋白对幼虫血细胞
具有很强的细胞毒性, 能够引起昆虫血细胞发生凝
集反应,并使细胞质中乳糖脱氢酶释放到胞外 [ 8]。
4 结语
昆虫病原线虫共生细菌产生的杀虫蛋白是一类
新的杀虫物质,其编码基因可能是与 B t基因联合使
用的候选基因之一。杀虫蛋白与 Bt等在转基因植
物中的联合使用,可有效地延缓昆虫对一种杀虫物
质如 Bt产生抗性的进程。这对抗虫转基因植物的
更新换代、防止害虫对某种抗虫转基因植物产生耐
受性, 具有重要意义。
Pho torhabdus和 X enorhabdus的不同种或同种不
同菌株可产生多种杀虫蛋白,既有多样性又具有一
定的同源性, 已成为一类新的杀虫蛋白基因家族。
共生细菌产生的杀虫蛋白基因的分离、重组蛋白的
功能、转基因抗虫作物及杀虫蛋白的作用机制的研
究将促进此类新型杀虫微生物的开发利用。
昆虫病原线虫共生细菌大量的功能性基因仍然
知之甚少,共生菌产生的杀虫蛋白研究较晚,在杀虫
蛋白基因的功能和具体代谢机制上仍存在大量未知
的问题,相信随着研究工作的进一步深入和展开,昆
虫病原线虫共生细菌产生的杀虫蛋白必将成为害虫
防治的又一有效措施。
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