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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 11 期
农杆菌介导拒食蛋白 XnAFP2 转化
恢复系多系一号的研究
盛德鹏 玉山江·麦麦提 郭立华 曾洪梅 杨秀芬 袁京京 邱德文
(中国农业科学院植物保护研究所 农业部生物防治重点开放实验室，北京 100081)
摘 要: 拒食蛋白是从嗜线虫致病杆菌北京变种 CB6 菌株分离得到的对多种昆虫具有拒食、抑制生长发育作用的毒性
蛋白，通过根癌农杆菌介导转化法将极拒食蛋白基因导入 XnAFP2 多系一号基因组，获得了转基因水稻植株。通过 PCR、RT-
PCR和 Southern blot验证目的基因的整合和表达。
关键词: 根癌农杆菌 愈伤组织 拒食蛋白 XnAFP2 嗜线虫致病杆菌
Agrobacterium-mediated Transformation of
Duoxi 1 with XnAFP2 Gene
Sheng Depeng Yushanjiang Maimaiti Guo Lihua Zeng Hongmei Yang Xiufen Yuan Jingjing Qiu Dewen
(Key Laboratory for Biological Control，Ministry of Agriculture，
Institute of Plant Protection，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081)
Abstract: XnAFP2，a protein with insect Antifeeding activity and inhibitory action of the growth，is purified from Xenorhabdus
nematophila var． pekinggensis stain CB6． Antifeeding protein gene XnAFP2 was introduced into the genome of Duoxi 1 by Agrobacterium-
mediated method． And we confirmed the integration，and transcription by PCR，Southern blot，RT-PCR in transgenic rice．
Key words: Agrobacterium Callus Antifeeding protein XnAFP2 Xenorhabdus nematophila
收稿日期:2011-05-20
基金项目:转基因生物新品种培育重大专项(2009ZX08001-018B)
作者简介:盛德鹏，硕士研究生，研究方向:实验室转基因水稻;E-mail:shengdepeng@ 163. com
通讯作者:邱德文，研究员，研究方向:新型蛋白生物农药;E-mail:qiudewen@ caas. net. cn
昆虫病原线虫共生菌是一类在昆虫病原线虫侵
染期的幼虫肠道内发现的寄生细菌，包括发光杆菌
(Photorhabdus)和致病杆菌(Xenorhabdus)两个属，
分别与异小杆线虫(Heterorhabditis)和斯氏线虫
(Steinernema)共生。昆虫病原线虫共生菌与线虫互
惠共生，昆虫病原线虫进入昆虫体内以后释放共生
菌进入昆虫血腔，共生菌在生长繁殖过程中能够快
速杀死昆虫并分解昆虫组织，同时产生多种活性物
质，为线虫提供适宜的生长环境。自从 Ensign 等于
1990 年在光杆状菌(P． luminescens)中发现具有毒
性的胞外蛋白以来，科研工作者在多个菌株中发
现了具有口服毒性或者注射毒性的杀虫活性物
质，已证明有效的目标昆虫涵盖了鳞翅目、鞘翅
目、同翅目、膜翅目和双翅目。尤其是昆虫病原线
虫杀虫蛋白表现出的杀虫能力强、速度快等诸多
优点引起了人们的广泛关注和重视，目前已经在
发光杆菌和致病杆菌中发现了多种杀虫蛋白，而
且该类杀虫蛋白的杀虫谱比 Bt 蛋白更广，为研制
和开发新的生物杀虫剂和抗虫基因工程育种提供
了新的资源［1，2］。
嗜线虫致病杆菌 CB6(Xenorhabdus nematophila
var． pekinggensis stain CB6)是本研究室在北京郊区
土壤中分离的小卷蛾斯氏线虫(Steinernema carpocap-
sa)肠道内分离得到的具有高杀虫、抗病活性的昆虫
病原线虫共生菌［3 － 7］。研究表明，拒食蛋白
XnAFP2 是嗜线虫致病杆菌 CB6 的主要杀虫活性物
质，天然蛋白在浓度为 50 μg /mL 时拒食活性可达
95%以上。喂食拒食蛋白可以明显降低棉铃虫四龄
2011 年第 11 期 盛德鹏等:农杆菌介导拒食蛋白 XnAFP2 转化恢复系多系一号的研究
幼虫的重量、延长棉铃虫的幼虫期、减少蛹化和化蛾
的比例［8，9］。
多系一号是目前水稻育种中常用的杂交籼稻的
恢复系，作为父本培育出了多种优质高产杂交籼稻
品种。本研究通过诱导多系一号成熟胚获得愈伤组
织，在此基础上将 XnAFP2 基因转化多系一号，通过
分子生物学方法验证外源基因在水稻中的整合、转
录和表达，旨在获得具有优良抗虫性的转 XnAFP2
水稻恢复系多系一号。
1 材料与方法
1. 1 材料
拒食蛋白基因 XnAFP2 从嗜线虫致病杆菌 CB6
克隆得到;恢复系多系一号的成熟种子由中国水稻
所黄世文老师惠赠，本课题组繁殖、保存;大肠杆菌
DH5α、农杆菌菌株 LBA4404、均由本实验室保存;质
粒 pCMBIA2300-35S-OCS本实验室保存。
1. 2 方法
1. 2. 1 植物表达载体的构建 根据 XnAFP2 基因
序列设计一对扩增全长的特异性引物:P1:5-TACT-
GCAGATGTATAGCACGGCTGTATTA-3(下划线为
PstⅠ位点) ;P2:5-CGTCATGATTAAGAACGAATG-
GTATAGC-3(下划线为 XbaⅠ位点)。
以嗜线虫致病杆菌 CB6 基因组 DNA 为模板扩
增 XnAFP2 基因，PCR扩增程序:94℃预变性 5 min;
94℃ 1 min，58℃ 1 min，72℃ 2 min，35 个循环;最后
72℃延伸 10 min。纯化后的 PCR 产物连接到
pMD18-T载体。pMD18-T-XnAFP2 用 PstⅠ和 XbaⅠ
进行双酶切，将切下的片段连接到经 PstⅠ和 XbaⅠ
酶酶切的 pCMBIA2300-35S-OCS载体。
1. 2. 2 农杆菌介导的多系一号的遗传转化
1. 2. 2. 1 多系一号的组织培养 将成熟的种子剥
去颖壳，用 75%乙醇灭菌 2 min，用无菌水清洗 3
次;然后用 2%的次氯酸钠浸泡 30 min，用无菌水清
洗 3 次;再用无菌水浸泡 15 min，倒掉无菌水用无菌
滤纸吸干种子表面的水分。组织培养过程和培养基
参照 Heie［10］和 Qiu［11］的方法。
1. 2. 2. 2 根癌农杆菌的制备 将农杆菌接种于 2
mL YEB 液体培养基中，28℃、180 r /min 培养过夜。
转移培养液到 1. 5 mL的无菌离心管中 5 000 r /min
离心 3 min。弃去清，菌体重悬后加入 N6-As液体培
养基中，As(乙酰丁香酮)的浓度为 200 mg /L。测定
N6-As溶液的菌体浓度，要求 OD600达到 0. 4 － 0. 6
之间。
1. 2. 2. 3 农杆菌侵染愈伤组织 选取淡黄色、紧
凑的愈伤组织放入无菌的 50 mL 离心管，将制备
好的农杆菌菌液倒入离心管内，轻轻摇动10 min。
倒掉菌液，用无菌吸水纸吸干愈伤组织表面残留
的菌液，将愈伤组织转移到共培培养基上，22℃暗
培养 48 h。
1. 2. 2. 4 转化植株的获得 共培养后的愈伤组织
转移到无菌的 50 mL离心管中，用含有 500 mg /L卡
那霉素的无菌水冲洗 3 次，每次轻轻摇动 3 min;再
用含有 600 mg /L卡那霉素的无菌水清洗一次，倒掉
无菌水，用无菌吸水纸吸干愈伤组织表面的液体;然
后转移到恢复培养基，25℃光照培养 7 d 后转移到
筛选培养基，15 d 后更换一次培养基;筛选结束后，
愈伤组织转移到分化培养基，28℃光照培养 14 h，
25℃暗培养 10 h，30 d左右可以分化出抗性小苗，将
抗性小苗转移到生根培养基，待根系发达后移栽到
温室培养。
1. 2. 3 转基因水稻的鉴定
1. 2. 3. 1 转化植株的 PCR鉴定 DNA提取采用北
京全式金公司的植物基因组 DNA小提试剂盒，从再
生水稻植株叶片中提取总 DNA。设计合成两对引
物 P3、P4 和 P5、P6 验证 T-DNA 的整合。P3:5-
TCAGAAGAACTCGTCAAGAA-3;P4:5-ATGATTGA-
ACAAGATGGATT-3;P5:5-CAAACACGGGCATTG-
ATACT-3;P6:5-ACAAACCCACCAACGAGTTA-3。
1. 2. 3. 2 转化植株的 RT-PCR 鉴定 参考 Invitro-
gen 公司的 TRIZOL 法，从 PCR 阳性的水稻叶片中
提取总 RNA。使用全式金公司的反转录试剂盒合
成 cDNA，采用 1. 2. 3. 1 的方法 PCR 反应检测目的
基因的转录。
1. 2. 3. 3 植物基因组 DNA 大量提取和 Southern
blot鉴定 取 4 g 阳性的转基因植株新鲜叶片用
CTAB法提取 DNA，DNA 用 EcoRⅤ酶切，使用罗氏
的 PCR DIG Probe Synthesis Kit合成探针，具体 DNA
分子杂交操作参照 Coca［11］的方法。
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2 结果
2. 1 植物表达载体的鉴定
植物表达载体 pCAMBIA2300-35S-XnAFP2-OCS
的酶切、测序结果和预期完全吻合，用 XbaⅠ和 Pst
Ⅰ双酶切所得到的片段大小与理论值一致(图 1) ，
测序结果同样表明载体中含有目的基因 XnAFP2 并
且插入位点正确。
M． DL15000;1．双酶切质粒 pCMBIA2300-35S-XnAFP2-OCS
图 1 植物表达载体 pCMBIA2300-35S-
XnAFP2-OCS酶切示意图
2. 2 转基因植株的获得
多系一号成熟胚 25 d 后可以得到生理状态好
的愈伤组织。愈伤组织侵染后共培养 2 d、恢复培养
7 d、筛选培养 30 d后转移到分化培养基，大约 30 d
后出现抗性小苗。将小苗小心移栽到生根培养基，
生根后移栽到温室得到 T0 代的转基因植株(图 2)。
A．愈伤组织的诱导;B．共培养;C． 抗性苗的分化;D． 抗
性苗生根
图 2 转基因水稻的再生
2. 3 转基因植株的 PCR检测
以再生植株基因组 DNA 为模板进行 PCR 反
应，结果(图 3)显示，部分转化植株可扩增得到预期
大小的目的条带，而非转基因对照未检测到相应条
带，表明目的基因 XnAFP2 已经成功转化部分水稻
植株。
A．引物 P3 和 P4 的扩增结果;B．引物 P5 和 P6 的扩增结
果;M． DL2000;1 － 6．水稻转化植株;PC． 阳性对照;NT．
非转基因水稻
图 3 水稻再生植株的 PCR鉴定
2. 4 转基因植株的 PCR和 RT-PCR鉴定结果
RT-PCR结果(图 4)表明，部分转化植株可扩增
得到目的条带且和阳性对照一致，而非转基因对照
未检测到相应条带，表明目的基因 XnAFP2 已经成
功转入水稻并得到转录。
M． DL2000;1 － 6． PCR 水稻转化植株;PC．阳性对照;NT． 非转
基因水稻
图 4 转基因水稻的 RT-PCR鉴定
2. 5 转基因植株的 Southern blot鉴定
拒食蛋白基因特异的探针杂交结果(图 5)表
明，在转基因植株检测到了明显的杂交信号，从而进
一步说明 XnAFP2 基因已经整合到了转基因水稻基
因组中。
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2011 年第 11 期 盛德鹏等:农杆菌介导拒食蛋白 XnAFP2 转化恢复系多系一号的研究
1 － 3． XnAFP2 转化植株
图 5 转 XnAFP2 基因水稻的 Southern blot分析
3 讨论
水稻是世界上重要的粮食作物，采用传统的农
艺栽培措施进行病虫害防治的用工投入大，防治效
果十分有限，使用化学药剂防治又造成严重生态破
坏，培育优良抗性品种是解决上述问题最为经济有
效的方法。但是统育种方式品种选育周期较长，水
稻抗性资源缺乏，通过常规育种手段获得优良抗性
品种相当困难。利用基因工程技术改良水稻病虫害
抗性，培育优良抗性水稻品种是解决上述难题的有
效途径［14，15］。籼稻、粳稻和爪哇稻是水稻的 3 个亚
种，其中籼稻产量最大，但是在转基因技术研究中籼
稻愈伤组织的诱导、继代和植株的再生都较困难，而
且品种间差异较大。杂交水稻的抗性主要决定于父
本恢复系，通过转化杂交籼稻的恢复系获得转基因
籼稻是解决这一难题的有效途径。
目前利用基因工程手段，通过导入直接杀害或
制约病虫害发展的基因，已经获得了大量高产、优
质、抗病虫的农作物［14 － 16］。随着社会的发展和科
技的进步，农药残留成为了农业生产中的一个突出
问题，生物农药的出现对于缓解这一问题起到了关
键的作用。虽然昆虫病原共生菌的杀虫活性物质研
究历史较短，但是随着研究的深入和共生细菌新的
杀虫毒蛋白和杀虫基因的不断发现，为研制和开发
新的生物杀虫剂展示了良好的应用前景。拒食蛋白
正是来源于昆虫病原共生菌的杀虫蛋白，其杀虫活
性好，杀虫谱广，有望成为新型生物杀虫剂，是替代
Bt蛋白的候选。通过将拒食蛋白基因或者是联合
Bt基因转化植物对于延缓昆虫对单一毒素成分产
生抗性和转基因抗虫作物的更新换代具有重要的
意义。
4 结论
本研究中，水稻恢复系多系一号成熟胚愈伤组
织的诱导采用 N6 培养基，取得了良好的效果，通过
农杆菌介导法将 XnAFP2 基因转入多系一号，PCR、
RT-PCR和 Southern blot 验证的目的基因的整合和
表达，并且通过 Southern 杂交检测到了单拷贝的转
基因植株，能够较好地为水稻抗虫育种提供中间选
育材料。
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