全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2009年第 4期
嗜线虫致病杆菌 Xna基因同源重组载体的
构建及遗传转化体系的建立
魏明敏1, 2 邱德文 2 曾洪梅 2 黄建新 1 杨秀芬 2 袁京京 2
( 1 西北大学生命科学学院,西安 710069; 2中国农业科学院植物保护研究所,北京 100081)
摘 要: 构建嗜线虫致病杆菌 X na基因的同源重组载体和建立该细菌的遗传转化体系。扩增嗜线虫致病杆菌 XNA基
因的左右同源片段及质粒 PEASYT1上的卡那抗性基因Km; 利用重叠延伸引物 PCR法将这 3个片段连接起来,然后将其克隆
至自杀性载体 PJQ200。采用电激法将同源重组载体 DNA转化到供体细菌, 再利用二亲本结合转移方法将供体细菌中的载体
转化到受体细菌 CB6菌株。结果成功地扩增了 X na基因的左右同源臂及卡那抗性基因的全长融合片段、构建了 X na基因的
同源重组载体, 并建立了嗜线虫致病杆菌北京变种的遗传转化体系。
关键词: 嗜线虫致病杆菌 同源重组载体 重叠延伸引物 PCR法 结合转移
Construction ofHomologousRecombinant Vector ofXna Gene and
EstablishmentofGenetic Transformation System ofXenorhabdus nematophila
W eiM ingm in
1 Q iu Dewen2 Zeng hongm ei2 Huang J ianx in1 Yang X iufen2 Yuan Jingjing2
(
1
College of Life Sciences, N orthwest University, X i an 710069; 2Institute of PlantProtection,
ChineseA cademy of Agricultural Sciences, S tateK ey Laboratory for Biology of P lant D iseases and InsectP ests, B eijing 100081)
Abstrac:t Itw as to construct su ic ide vec to r o fX na gene o fX enorhabdus nem atoph ila and establish the genetic transfo rm ation sys
temF irstly, the left and right homo logous recom binant fragm ents ofX enorhabdus nematophila var Pekingens is and kanamycin resistance
gene of PEASYT1 vec to r were amp lified Secondly, the three fragm ents w ere assemb led tog ether and c loned in to su ic ide vec to r
P JQ200 F ina lly, the homo logous recomb inant vector w as introduced into donor bacter ia by electropo ration and then transformed into
X enorhabdus nematophila var pek ingensis by tw o paren t s con junc tionThe homo logous recom binant v ectorw as successfu lly constructed
and transform ation system o fX enorhabdus nema tophila var pek ingensis was also established
Key words: X enorhabdus nem atoph ila H om ologous recomb inant vec to r Over lap ex tension PCR Conjugation
收稿日期: 20080925
基金项目:中国农业科学院植保所基本科研业务费用专项资金资助项目
作者简介:魏明敏 ( 1983) ,男,甘肃兰州人,硕士研究生,主要从事应用微生物学研究; Em ai:l wmm 19831105@ 126 com
通讯作者:邱德文 ( 1959) ,研究员,从事药物蛋白研究与开发; Em ai:l dew enq iu@ hotm ail com
嗜线虫致病杆菌是一类存在于昆虫病原线虫肠
道内的共生细菌,在其代谢过程中会产生多种具有
生物活性的抗生素类物质 [ 1]。这些抗生素类物质
包括细菌素、几丁质酶、假肽类、二硫吡咯类等,它们
对很多植物病原真菌植物病原菌具有良好的抑菌效
果 [ 2]。因此研究这些抗生素的生物合成机制, 对于
研究致病杆菌与宿主线虫之间的共生关系以及预防
并控制植物病害都具有重要的理论和应用价值。目
前,对致病杆菌抗生素生物合成相关基因的研究尚
未见报道,本研究选取了嗜线虫致病杆菌中一个与
发光杆菌 PLU3531基因同源性很高的 Xna基因来
进行研究,文献中已经报道发光杆菌基因 PLU3531
基因参与抗生素杆菌肽的合成 [ 3] ,所以推测, Xna基
因也与抗生素合成有关。希望通过敲除嗜线虫致病
杆菌的 Xna基因并比较野生型与突变株的产抗生
素水平,研究 Xna基因在抗生素生物合成过程中所
起的作用。同时, 由于嗜线虫致病杆菌很难采用常
规的化学方法和电激转化, 从而限制了对于致病杆
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2009年第 4期
菌分子遗传操作,使目前国内对嗜线虫致病杆菌的
分子遗传方面的研究不能深入进行。采用双亲本结
合转移方法 [ 4]转化构建好的同源重组载体研究嗜
线虫致病杆菌的抗生素合成相关基因, 这在国内尚
未见相关报道。
1 材料与方法
11 材料
111 菌株和质粒 嗜线虫致病杆菌北京变种 (X e
norhabdus nematophila varp ek ingensis )、大 肠杆 菌
(E scherichia coli ) DH5、大肠杆菌 (E scherichia coli )
S171,质粒 PEASYT1均由本实验室保存; 质粒
PJQ200购自美国模式菌种保藏中心 (American Type
Collection centre, ATCC)。
112 培养基 LB培养基 ( g /L):酵母膏 5 g、胰蛋白
胨 10 g、氯化钠 10 g;固体培养基添加 15 g琼脂定容至
1 000m ,l抗生素工作浓度:氨苄西林 ( Amp) 100 mg /L,
链霉素 ( Sm ) 100mg /L,卡那霉素 (Km ) 50mg /L。
113 主要试剂和工具酶 各种限制性内切酶、
DNA聚合酶、dNTPs、T4 DNA连接酶购自大连宝生物
有限公司; DNA胶回收和质粒快速提取试剂盒购自
天根生物工程有限公司;其他试剂均为国产分析纯。
12 方法
121 嗜线虫致病杆菌染色体 DNA的提取 参照
参考文献 [ 5]。
122 同源重组线性 DNA片段的构建 (图 1)
1221 引物设计 本实验构建的同源重组线性
DNA片段由 3个片段融合构成,各片段扩增所用引
物及序列如表 1所示。大写序列为扩增片段的特异
性引物序列, 小写序列为相邻片段的互补序列。
A1, A6引物分别引入 Xma I酶切位点 (表 ! 下划线
部分表示 )。
1222 Xna基因左右同源片段及卡那抗性基因
的独立扩增 按照常规 PCR方法进行上述 3个目
的片段的独立扩增。3个目的片段扩增的反应条件
及扩增产物长度, 如表 2所示。扩增产物琼脂糖凝
胶电泳检测并切胶回收。
1223 卡那抗性基因的抗性验证 将上述从
PEASYT1扩增得到的卡那抗性基因切胶回收后连接
PMD18T载体,连接产物转化 DH5a态细胞, 涂布于
卡那浓度分别为 30, 40, 50, 60 g /m l的 LB平板上,
28∀ 倒置培养 12~ 16 h,观察细菌是否能够生长。
图 1 重叠延伸引物 PCR技术图解 [ 6]
表 1 3个目的片段扩增所用的引物
待融合片段 模板 引物 引物序列 ( 5 3 )
A ( Left arm ) CB6 genom ic A1 CACGCCCGGGCAGGTGATCGTGTTTACTG
A2 CTTTCTCTTTGCGCTTGCGTTTTCCCAGCATTGCCAGATTATTG
B( Km ) PEASYT1 vector B1 CGGCCAATAATCTGGCAATGCTGGGAAAACGCAAGCGCAAAGAGAA
B2 ATAATCCAACTTCCAACTTGTGATGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCA
C( righ t arm ) CB6 genom ic C1 TTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCATCACAAGTTGGAAGTTGGAT
C2 CACCCCGGGCCAGCATTGCCAGATTATTG
表 2 待融合片段扩增的反应条件及扩增产物长度
待融合片段 引物 反应条件 长度
A ( Lef t arm ) A1, A2
35个循环 ( 94∀ 40 s,
60∀ 30 s, 72∀ 2 m in) 600
B( Km ) B1, B2
35个循环 ( 94∀ 40 s,
60∀ 30 s, 72∀ 2 m in) 1 100
C ( R igh t arm ) C1, C2
35个循环 ( 94∀ 40 s,
60∀ 30 s, 72∀ 2 m in) 500
1224 重叠延伸引物 PCR法扩增全长融合片段
在 50 l体系中加入等摩尔的上述 3个回收后的各独
立扩增片段,不添加引物,用 Easypfu DNA Po lymerase
进行上述 3个片段的互补延伸, 以形成全长的融合
PCR产物,见表 3( 1)。反应结束后,以上述所得产物
为模板,进行融合片段的全长扩增, 见表 3( 2)。扩增
产物电泳检测,切胶回收并克隆 T载体进行菌落 PCR
92
2009年第 4期 魏明敏等:嗜线虫致病杆菌X na基因同源重组载体的构建及遗传转化体系的建立
鉴定,选取鉴定正确的阳性克隆测序。
表 3 融合 PCR反应条件及融合产物长度
融合产物 待融合片段 引物 反应条件
( 1 )ABC A, B, C 无 10个循环 ( 94∀ 20 s,
60∀ 20 s, 72∀ 5 m in )
( 2 )ABC ( 1)融合产物 P1, P6 35个循环 ( 94∀ 40 s,
60∀ 30 s, 72∀ 3 m in )
123 同源重组载体 PJQ200Xap的构建 Xma I酶
切自杀性载体 PJQ200和全长融合片段,胶回收其线
形化片段,然后用 T4 DNA连接酶连接载体 PJQ200和
全长融合片段回收产物,连接产物转化 E coli DH5a。
124 嗜线虫致病杆菌转化体系的建立及其优化
1241 同源重组载体转入供体细菌 S171 使
用 B ioRadX cell电击转化仪, 将构建好的同源重组
载体转化到供体细菌 Ecoli S17感受态细胞中。
1242 同源重组载体通过结合转移转入受体细菌
Ecoli S171菌株经过活化后以 1%接种量转接入
新鲜的 LB培养基 (Km 30 g /m l)中, 37∀ 振荡培养
至 OD为 04~ 06。同时将受体菌嗜线虫致病杆菌
28∀ 过夜活化后并以 1%接种量转接入 LB液体培养
基, 28∀ 培养至 OD为 04~ 06。将EcoliS171和嗜
线虫致病杆菌等体积混和, 室温 4 000 r/m in沉淀菌
体, 再用 100~ 200 l不加抗生素的 LB液体悬浮。将
所有菌体悬浮液铺在一张孔径为 045 m的硝酸纤
维素膜置于不含抗生素的 LB平板上, 再将该平板置
于 28∀ 下培养 8 h左右,然后用 200~ 1 000 l不含抗
生素的 LB液体培养基将细菌从膜上全部冲洗下来,
在每个含 Km ( 30 g /m l), Amp( 50 g /m l)的选择性
固体平板上涂布 100 l的菌液, 28∀ 培养 2~ 3 d, 筛
选结合子,结合转移频率 =结合子树 /供体菌数。
1243 PCR法鉴定接合子 由于同源重组载体
上携带有卡那抗性基因, 而野生型嗜线虫致病杆菌
染色体上不含有卡那抗性基因,因此扩增出同源重
组载体上的卡那抗性基因后,就可确定载体已经转
入受体菌中。鉴定所用引物及其扩增条件见表 2中
待融合片段 B。
1244 嗜线虫致病杆菌结合转移系统的优化
将结合时间设为 4, 6, 8, 10, 12 h 5个梯度,供体菌和
受体菌比例设为 1 /4, 1 /2, 1, 2, 4共 5个梯度来分别
考察结合时间, 供体细菌 E coli S171和受体细菌
嗜线虫致病杆菌菌数比例结合转移效率的影响。
2 结果与分析
21 Xna基因同源重组线形片段扩增结果 (图 2)
MDL2000M arker; 1X na基因左同源臂; 2X na基因右同源臂;
3.卡那抗性基因; 4.全长融合产物
图 2 PCR扩增结果
22 卡那抗性基因的抗性验证
含有扩增得到的卡那抗性基因的 PMD18T载
体转化 E coli DH 5a后, 转化后的细菌在含有卡那
浓度分别为 30, 40, 50, 60 g /m l的 LB平板上菌能
生长。说明扩增得到的卡那抗性基因功能正常, 能
用于后续的同源重组载体的构建及 Xna基因缺失
突变株的筛选。
23 同源重组载体 PJQ200Xna: Km的构建及鉴定
重组载体由 PJQ由 5 XnaKm3 XnaPJQ200构
成。用引物 A1, C2(表 1)对载体进行测序,测序结果
表明,同源重组片段构建正确,与预期的结果相符。
24 重组质粒转化鉴定
由于嗜线虫致病杆菌对卡那抗生素敏感, 同时
含有同源重组载体的 Eco li S171对 Amp敏感, 因
此 Amp和 Km双重筛选压力下生长起来的菌落可
初步判断为结合子, 采用菌液 PCR法扩增结合子,
琼脂糖凝胶电泳检测, 结合子都能扩增出 1 100 bp
的阳性条带。因此,可确定构建好的同源重组载体
已经进入嗜线虫致病杆菌中 (图 3)。
25 结合转移时间和供体受体菌比例对结合转移
频率的影响
实验结果表明,当供体菌和受体菌的比例为 2,
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结合时间为 8 h时结合转移频率最高, 1 # 10- 4。其
中,结合转移时间对转移效率影响最大,结合时间过
短或过长都使的结合转移效率急剧下降, 推测结合
时间过短使得融合质粒未能完全进入受体细菌;结
合时间过长,由于供体细菌生长速度明显高于嗜线
虫致病杆菌的生长速度, 受体细菌数目小于供体菌
数目, 从而降低了结合转移的频率 (图 4,图 5)。
MM arker DL2000; 1~ 4结合子
图 3 PCR扩增结合子的 Km基因
图 4 结合转移时间对转移频率的影响
图 5 供体菌和受体菌的比例对转移频率的影响
3 讨论
由于传统的同源重组载体的构建以限制性内切
酶和 DNA连接酶为基础,通过一系列的酶切连接反
应将各片段逐步连接起来。这种方法费时费力,不但
在连接过程中引入了不必要的酶切位点碱基序列,而
且对于长片段的连接有时难以找到合适的酶切位点。
采用重叠延伸引物 PCR法将具有互补末端的引物将
不同来源的扩增片段连接起来,为基因敲除中同源重
组片段的构建提供了快速简捷的途径 [ 7, 8 ]。
尝试采用自杀性载体 PJQ200构建产抗生素相
关基因 Xna的同源重组载体, 并运用基因敲除技
术 [ 9]来验证该基因的功能。但是载体 PJQ 200能够
在嗜线虫致病杆菌 CB6菌中自主复制, 所以拟采用
载体 PJQ200上含有的 sacB基因使载体上的卡那抗
性基因整合到嗜线虫致病杆菌染色体上 [ 10 ] , sacB基
因编码的果聚糖蔗糖酶能催化蔗糖水解成果聚糖,
后者对许多革兰阴性菌来说是一种致死性有毒化合
物。因此,将携带有同源重组载体的嗜线虫致病杆
菌北京变种转化菌株在 5%的蔗糖平板来筛选脱下
自杀质粒的卡那霉素敏感株, 即缺失株。对于 Xna
基因失活的嗜线虫致病杆菌的筛选工作目前正在进
行当中。
建立了嗜线虫致病杆菌的二亲本结合转移遗传
转化体系,通过该转化体系将构建好的同源重组载
体成功的转入了嗜线虫致病杆菌中, 并对该遗传转
化体系进行了初步的优化。同时 PJQ200XnaKm载
体的成功构建,为筛选嗜线虫致病杆菌 CB6菌株的
Xna基因缺失突变株, 及进一步研究 Xna基因在嗜
线虫致病杆菌抗生素生物合成 [ 11 ]中所起的作用奠
定了基础。
参 考 文 献
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(下转第 102页 )
94
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2009年第 4期
3 讨论
FMDV的毒力和抗原性都易发生变异,经过不
断的抗原 ∃漂移%过程,导致一系列亚型乃至型的产
生 [ 8~ 10]。FMDV VP1 基因的核苷酸序列是一个高
度可变区。分析这个高变区不仅对 FMDV遗传变
异的研究有指导意义, 而且对 FMD 的流行病学研
究、疫源的追踪、毒株型和亚型的分析, 为合理的选
择疫苗,甚至为诊断抗原的制备及新型疫苗的研制
提供理论指导 [ 11~ 14]。
历史上,我国发生的亚洲 1型口蹄疫仅限于云南
边境地区,内地从未有亚洲 1型疫情的报道 [ 4]。 2005
年以后,我国突然暴发牛亚洲 1型口蹄疫,疫情波及江
苏、宁夏、河北、北京、湖北、青海、甘肃、山东及新疆等省
市区,给我国口蹄疫防治工作带来极大挑战,国家口蹄
疫参考实验室即开展流行病学调查,从分子水平查明
我国牛口蹄疫亚洲 1型病毒的来源。从流行病学调查
情况来看,我国的牛口蹄疫亚洲 1型病毒分别属于 3
个相对独立的遗传群 [ 15] ,即云南保山 58谱系 ( Asia1/
YB /BSh /58/B )、香港 05谱系 ( Asia1/Hongkong /05/B )
和江苏 05谱系 ( F2为代表毒株 ),其中江苏 05谱系为
主要流行毒株 (图 2)。
云南保山 58谱系以 1958年云南保山毒为代表,我
国目前用于诊断的标准毒和亚洲 1型弱毒疫苗毒株均
为该毒株。我国云南边境发生亚洲 1型口蹄疫系由该
毒株引起,与 Asia1 / IND /63 /72同源性 919%,其来源
与东南亚国家常年流行的亚洲 1型口蹄疫关系较为密
切。香港 05谱系该毒株 2005年 4月在山东泰安引起
牛发病,并在新疆、宁夏、甘肃等地流行,说明该毒株已
跳跃性地扩散到了内地。通过与周边国家流行毒株的
VP1基因序列进行比对分析发现香港 05谱系与印度
1991~ 1999年间发生的部分亚洲 1型口蹄疫关系较密
切,属同一基因型。F1、Asia1/Hongkong /05/B与 2004
年间巴基斯坦流行毒株 (A sia1/PAK /1 /04/B )同源性
分别为 991/%和 986%,属高度同源。江苏 05谱系
毒株自 2005年引起口蹄疫大暴发以来,已散播到江苏、
宁夏、河北、北京、湖北、青海、甘肃等地区, 该谱系与
OIE公布的国外近 20年间出现的流行毒的遗传关系均
相距甚远,而与印度 20世纪 80年代初流行的某些毒株
具有高度的遗传衍化关系,因此可以推测,我国亚洲 1
型口蹄疫病毒是新近从国外传入。所以, 要有效防控
我国 Asia1型口蹄疫的发生,需内外兼顾,对内加大免
疫和监测,对外加强贸易流通监管,以建立真正有效的
防控体系。
参 考 文 献
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