全 文 ：健物杖术通报
· 研究报告 · 刀了口百付口工口 ! ∀ 年增刊
温度和 对橄榄蜡消化酶活性的影响
吴爱春‘ 张永普,
‘浙江广播电视大学永嘉学院 , 温州
贾守菊 廖美英 , 姜丽君
!∀ 温州大学生命与环境科学学院, 温州 咒 !
摘 要 采用酶学分析方法 , 测定 了温度和 对橄榄蜡蛋白酶 、淀粉酶 、纤维素酶活力的影响 。 结果表明
温度和 显著影响橄榄蜡蛋 白酶 、 淀粉酶和纤维素酶的活力 蛋 白酶、 淀粉酶和纤维素酶的最适温度分别为
℃ 、 ℃和 ℃ 一 ℃ , 最适 分别为 、 和 。 橄榄蜡 种消化酶活性大 小为淀粉酶 蛋白酶 纤维
素酶 。
关键词 橄榄蚜 蛋白酶 淀粉酶 纤维素酶
而
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消化酶活性是动物摄食 、营养条件 、生理状况的
良好指标 , 其活性的高低直接影响了动物对营养物
质的消化利用程度 , 进而影响动物生长发育的速度 ,
是动物营养学和和饵料学研究的主要内容 。 橄榄蜡
(Est el arc 。 。z俪cea) 隶属 于软体动物门 , 瓣鳃纲 , 列
齿 目 , 蜡科 , 橄榄蜡属 , 俗名为珠蜡 。 橄榄蜡生活在
潮间带和潮下带水深约 20 m 左右的泥沙质海底 , 分
布于菲律宾 、 日本和我国沿海〔‘〕。 通过对不同 pH
和温度条件下橄榄蜡蛋白酶 、淀粉酶和纤维素酶的
活性分析 , 探讨这三种酶的最适温度和 pH , 为橄榄
蜡消化生理研究和人工养殖的饲料筛选提供一定的
理论依据 。
1 材料与方法
1.1 材料
橄榄蜡于 2006 年 5 月取自浙江灵昆滩涂 , 材料
带回实验室后置于经暗沉淀二次砂滤的海水暂养
48h , 以排尽消化道中的内容物 。 将橄榄蜡置于冰盘
中 , 活体剖开 , 取出软体组织 , 用吸水纸吸干体表水
分后装袋 ,每 5 个个体为一袋 , 用电子天平称重 , 并
保存在 一 70 ℃的冰箱中。
1
.
2 方法
1.2 .1 样品制备 从冰箱中取出待测样品 , 于低温
下解冻 。 将材料置于冰盘上的研磨中 , 加 10 倍数体
积(W /v )冷重蒸水 , 研磨成匀浆 , 于高速冷冻离心
基金项 目:国家科技基础条件平台建设资助项 目(20 4 D K A 304 70 一 0 1 5 ) ,浙江省科技计划项 目(Zo 6C 320 ro ) , 温州市科技发展计划项 目
( S2 (X) 6A (X )2 )
通讯作者:张永普(1967一 ) ,研究员 ;zhan脚u88@ yah oo· c o m · c n
生物杖术通报 B to te ch noto 盯 2008 年增干IJ
机中(4℃ , 9 0 0 0 r/ m i n ) 离心 ZOm in 。 取上清液用作
蛋白酶、淀粉酶和纤维素活性测定的酶液 , 并在 0 -
4℃低温保存 , 于 24 h 内分析完毕。
1
.
2
.
2 消化酶活力测定方法 蛋白酶活性测定参
照文献〔’〕, 采用 Fo lin 一酚法进行。 蛋白酶酶活性定
义:在一定的温度和 pH 下 , 每 min 水解酪蛋白产生
1卜g 酪氨酸为 1个酶活性单位(林岁m in ) 。
淀粉酶活性测定参照文献[’1 , 用 3 , 5 一二硝基水
杨酸法进行 。 淀粉酶酶活力定义 :在一定温度和 pH
下 , 每 min 催化淀粉生成 1卜m ol 麦芽糖的酶量为一
个酶活性单位(卜m o F m in ) 。
纤维素酶活性测定参照文献[’] , 用 3 , 5 一二硝基
水杨酸法进行 。 纤维素酶酶活性定义为:在一定温
度和 pH 下 , 每 m in 催化滤纸生成 1卜m ol 葡萄糖的
还原糖为 1个酶活性单位(林m 0F m in ) 。
温度实验中 , 在 5℃ 一 65 ℃范围内 , 每隔 5℃设
一个梯度 , 共计 13 个梯度 , 蛋白酶 、淀粉酶和纤维素
酶分别在 pH 为 7.2 、6 . 9 和 5.5 时测定其最适 pH ,
每个梯度设 3 个平行样 。
p H 实验中 , 在 pH 2.8 一 9 . 2 范围内 , 每隔 0.8
设一个梯度 , 共 9 个梯度;蛋 白酶采用磷酸氢二钠-
柠檬酸缓冲液和硼砂缓冲液 , 以 2% 酪蛋 白溶液为
代谢底物 , 于温度为 30 ℃条件下测定蛋白酶在不同
pH 时的活性;淀粉酶采用磷酸氢二钠一柠檬酸缓冲
液和巴比妥钠 一盐酸缓冲液 , 以 1% 可溶性淀粉溶液
为酶反应的代谢底物 , 于 25 ℃下测定淀粉酶在不同
pH 时的酶活性 ;纤维素酶采用磷酸氢二钠一柠檬酸
缓冲液和巴比妥钠 一盐酸缓冲液 , 于 40℃ 下测定纤
维素酶在不同pH 时的活性 。
1
.
3 实验数据处理
采用 St at ist ic a 统计软件包中的单因子方差分析
(o ne一w 即 A N O V A )和 Tukey ’ S 多重比较处理相应
的数据 , 描述性统计值用 “平均值 土标准差 ”表示 ,
显著性水平设置为 a = 0.05 。
2 结果
2.1 温度对橄榄蜡消化酶活性的影响
温度显著影响橄榄蜡蛋 白酶的活性 (凡2, 2 。 =
2 7. 8 0
, 尸 < 0 .0 0 01 ) 。 在 5℃ 一 5 ℃范围内 , 随着温
度的升高 , 蛋白酶活性也逐渐升高;5 ℃ 一 60 ℃ 时 ,
酶活性迅速增大 , 蛋白酶的活性变化范围为 0.52 -
0.80 (U/g 湿组织);到60 ℃时达最高 , 随后酶活性
显著下降。 结果表明蛋白酶活性 的最适温度为
60℃(图 1一 A ) 。
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图 1 温度对橄榄蜡消化酶活性的影响
温度显著影响橄榄蜡淀粉酶的活性 (凡2, 2 6 =
32
·
18
, 尸 < 0 . 0 0 01 ) 。 在 5℃ 一 65 ℃范围内 , 橄榄蜡
淀粉酶的活性变化范围为 17 .65 一 29 . 90 ( U / g 湿组
织) ;随着温度的升高 , 淀粉酶的活性逐渐增大 , 到
40℃ 时达最高 , 随后显著下降。 T uk ey ’ S 检验表明 ,
4 0 ℃时的淀粉酶活性显著高于其它温度 , 说明淀粉
酶的最适温度为 40 ℃ (图 1一B ) 。
温度显著影响橄榄蜡纤维素酶的活性 (F 12, 2 。 =
37
.
68
, 尸 < 0 .0 01 ) 。 在 5℃ 一 65 ℃ 范围内 , 橄榄蜡
年增刊 吴爱春等:温度和 pH 对橄榄蜡消化酶活性的影响 399
纤维素酶的活性变化范围为0 .009 一 0 . 5 42 ( U / g 湿
组织) 。 随着温度的升高 , 纤维素酶的活性逐渐增
大 , 到 35 ℃时达最高 , 随后逐渐下降。 T uk ey ’ s 检验
表明 , 30 ℃ 一 4 0 ℃无显著差异 , 说明 30 ℃ 一 40 ℃温
度范围都是纤维素酶的最适温度(图 1一C ) 。
2
.
2 p H 对橄榄蜡消化酶活性的影响
p H 显著影响橄榄蜡蛋 白酶活性(F:, : 8 二 1 6 4.
6 5 , 尸 < 0 . 00 0 1 ) 。 在 pH 2.8 一 9 . 2 范围内 , 橄榄蜡蛋
白酶的活性为 0.50 一 0 . 8 ( U / g 湿组织) ;pH 3.6
时 , 蛋白酶活性最高(0.8 U /g 湿组织 ) , p H 大于 3.
6 时蛋白酶活性显著下降(图 2一 A ) 。 结果表明蛋白
酶活性的最适 pH 为 3.6 , 呈强酸性 。
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图 2 pH 对橄榄蛆消化酶活性的影响
pH 显著影响橄榄蜡淀粉酶活性(FS, , , 二 2 10 .
5 5 , 尸 < 0 .0 0 0 1 ) 。 在 pH 2.8 一 9 . 2 范围内 , 橄榄蜡淀
粉酶的活性为 13 .29 一 31 . 75 ( U / g 湿组织 ) 。 在
pH 2.2 一 9 . 0 范围内 , 橄榄蜡淀粉酶活性在 pH S.2
和 pH7 .6 出现了两个高峰 , 其酶活性分别为 27 .21
(U/g 湿组织 )和 31.75 (U / g 湿组织 ) , p
H7
.
6 时橄
榄蜡淀粉酶的活性最高;Tuk ey ’ S 检验 表明 , 除
pH S.2 和 pH7 .6 外 , 其它 pH 淀粉酶活性无显著差
异 ;pH 7.6 淀粉酶活性显著高于 pH S.2 (图 2一 B ) 。
结果表明淀粉酶的最适 pH 为5.2 和 7 .6 。
p H 显著影响橄榄蜡纤维素酶活性(F S, , : = % .
1 2
, 尸 < 0 .0 0 0 1 ) 。 在 pH 2.8 一 9 . 2 范围内 , 橄榄蜡纤
维素酶的活性为 0.036 一 1 . 0 3 ( U / g 湿组织 ) 。 随
着 pH 值的升高 , 纤维素酶活性总体呈上升趋势 , 至
pH 6 .0 时 , 橄榄蜡纤维素酶的活性最高 , 随后随着
pH 值升高 , 纤维素酶活性逐渐下降(图 2 一 C ) 。 结果
表明橄榄蜡纤维素酶的最适 pH 为6.0 , 呈弱酸性 。
3 讨论
3.1 温度对消化酶活性的影响
在一定的温度范围内 , 酶促反应速度随温度的
升高而加快 。 随着温度升高 , 橄榄蜡的三种消化酶
活力逐渐升高 , 但各种酶的最适温度不同 , 这一现象
普遍存在于海洋贝类〔‘一 8 ] 、 甲壳类[’一 川 、 棘皮动
物[” ]等。 不同种类 、 p H 、食性 、季节 、生长阶段等都
会影响同种消化酶的最适温度 , 一 ”」。 橄榄蜡淀粉
酶活性大于蛋白酶 、纤维素酶的活性 , 这与其适宜的
温度范围内机体主要以碳水化合物作为供能物质相
符合[13:。
3
.
2 p H 对消化酶活性的影响
p H 可能通过影响底物的解离状况 、酶分子活性
部位上有关基团的解离 、中间络合物 ES 的解离状
态来影响酶活力〔’‘〕。 根据蛋白酶对 pH 敏感性的
不同 , 可将海洋动物蛋白酶分为酸性 、中性和碱性蛋
白酶[”〕, 橄榄蜡蛋白酶应属于酸性蛋白酶 。 不同物
种的蛋白酶 、淀粉酶和纤维素酶最适 pH 存在着差
异 , 如缀蛙 (Sinono aeula 。o ns t ric t a ) 蛋 白酶的最适
pH 为 9.2[, 」, 紫贻则场tilus 心ul。)为 6.5 和 5.0 、
滨螺(Lirtorina 胡. )和 日本鳃(Charxb d钻 ]ar o n iea )分别为 7.0 和 7 .8[ ’6 〕;溢蛙淀粉酶的最适 pH 为 6.3
和 7.7 , 栉孔扇贝淀粉酶的最适 pH 6.5 [’] 。 同一物
生物杖术通报 B to te ch noto 盯 2008 年增干IJ
种不同部位消化酶最适 pH 也存在着一定的差异 ,
如南美白对虾(Pe nae us va n me i) 肝脏蛋 白酶最适
pH 为 8.5 一 9 . 0 , 肠道蛋 白酶最适 pH 为 7.5 一 8.
5[ ’] ;刺参(助os tic hoP o JaP on ic us )前肠和中肠蛋白酶
的最适 pH 分别为5.0 一 5 . 8 和 7.0 一 5 . 6 [”〕。
参 考 文 献
徐凤山.中国海双壳类软体动物.北京:科学出版社 , 1 9 97 , 3 .
北京大学生物系生物化学教研室. 生物化学实验指导 , 北京:高
等教育出版社 , 1 9 79 .
蒋传葵 , 金承德 , 吴仁龙 , 等. 工具酶的活性测定 IM 〕. 上海:上
海科学技术出版社 , 1 9 82 , 74 一 76 , 79 一 8 2 .
张硕 , 赵艳. 大连水产学院学报 , 1 9 97 , 12 ( 1 ) : 巧 一 20 .
范德朋 , 潘鲁青 , 肖国强 , 等. 海洋湖沼通报 , 2 o 3( 04 ) : 69 一 73 .
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8 杨蕙萍 , 童圣英 , 王子臣. 水产学报 , 19 98 , 2 2 ( 4 ) : 3 45 一 3 51 .
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1 0 潘鲁青 , 王奎琪. 水产学报 , 1 9 9 7 , 2 1 ( 0 3 ) : 2 4 6 一 2 5 0 -
H 魏华 ,赵维信. 水产学报 , 19 % , 20 ( 01 ) : 61 一 64 .
12 姜令绪 , 扬宁 , 李建 , 等.海洋与湖沼 , 2 0 7 , 38 ( 5 ) : 47 6 一 48 住
13 张媛 ,方建光 , 毛玉泽 , 等. 中国水产科学 , 2 0 7 , 14 ( 4 ) : 6 9 0 -
6 9 4
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14 王镜岩 , 朱圣康 , 徐长法 , 等编. 生物化学(第 3 版)(上册 ) , 北
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15 付雪艳. 海参(st ich叩。 ]aP an ic us )消化蛋白酶的初步研究「D 〕
中国海洋科学 , 2 侧〕4 .
16 刘万顺 ,李濒. 山东海洋学院学报 , 1 9 8 8 , 1 8 ( l ) : 5 3 一 5 7 .
( 上接第392 页)
表明 CA 进人了凝胶的网络结构中 , 不过凝胶
对 CA 溶液并没有浓缩作用 。 测定该纳米复合凝胶
固定化 CA 的酶活为 19 0 士 13 0 U / m g , 游离 C A 的
酶活为2273 士 1 30 U / m g , 固定化后酶损失只有 16.
4% 。 可见该纳米复合凝胶由于为 CA 提供了一个
不流动的水环境 , 和其它固定方法或者其它凝胶载
体相比 ,该凝胶固定化 C A 保留了非常高的酶活 。
复合凝胶 , 并用于碳酸配酶固定的初步研究 。 结果
表明 , 凝胶固定酶的活性保持了较高的活性 , 说明本
文制备的纳米复合凝胶是一种很好的酶固定化载体
材料 。
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0 .10
图6 CA 浓度和其在 280nm 吸光值的关系
参 考 文 献
1 张传梅 , 付建伟 ,庄银凤 , 等. 河南科学 , 2 0 6 , 2 4 ( 5 ) : 6 83 一 6 86 .
2 张蓬 , 李学军.生理科学进展 , 1 9 97 , 2 8 ( 4 ) : 3 59 一 3 62 .
3 T rac h te
n b e 嗯 M C , C e J J , C ow an R M , e t al
.
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N
a n o 玫t , 2 (X) 3 , 3 ( 6 ) : 7 8 9 -
7 9 3
.
8 杨飘萍 , 宿美平 , 杨肯微 , 等. 无机化学学报 , 2 0 3 , 19 ( 5 ) : 4 85 -
4 9 0
.
9 M i
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10 Fl o 汀 p J . Pti n eip les of p o lym er C h em ist卿 【M 〕. Corn ellU nivers ity
Pre ss: Ithac a , N e w Y o rk , 1 9 5 3 .
3 结论
成功制备了一种新型的聚丙烯酸/水滑石纳米