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RNAi技术研究新进展



全 文 :技术与方法
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 12期
RNAi技术研究新进展
周红建  黄松  王雄伟
(三峡大学第一临床医学院,宜昌 443002)
  摘  要:  RNA干扰 ( RNA i)是指双链 RNA在细胞内特异性地诱导同源互补的 mRNA降解,从而阻断相应基因表达的现
象。RNA i在生物界中广泛存在,其发生过程主要分为 3个阶段: 起始阶段、扩增阶段和效应阶段。它在维持基因组稳定、基因
表达调控等方面发挥重要生物学作用。随着人们对 RNA i研究的不断深入, 目前 RNA干扰技术作为基因沉默的一个工具,已
被广泛用于基因功能研究、疾病的靶点治疗和寻找新的药物靶标等方面的研究。
关键词:  RNA i 基因沉默  药物靶标
New Development of RNA iTechnology
Zhou H ongjian Huang Song W angX iongwei
(F irst Clinical College of China T hree Gorges University, Yichang 443002)
  Abstrac:t  RNA interference re fers to the doub lestranded RNA in ce lls spec ifically induce degradation of hom o logous mRNA
comp lem entary to the phenomenon of block ing the expression o f the correspond ing gene. RNA i is w idespread in the b iosphe re. The oc
currence o fRNA i pro cess is div ided into three stages: initial stage, the am plification stage, the effec t o f stage. It plays an important b i
o log ical ro le in the m a intenance o f genom e stability, gene expression and regulation. A s people study the deepen ing of the RNA ,i the
current interference RNA i gene s ilenc ing techno logy as a too l has been w ide ly used in gene function, disease trea tm ent and find a new
targ et fo r drug targe ts and so on.
Key words:  RNA i Gene silenc ing Drug targe t
收稿日期: 20100618
作者简介:周红建,男,在读硕士,研究方向:神经外科脑胶质瘤; Em ai:l kxz8309@ 163. com
通讯作者:王雄伟,男,副主任医师,研究方向:神经外科脑胶质瘤; Em ai:l w angx iongw e i11@ yahoo. com. cn
RNA干扰 ( RNA interference, RNA i)技术是当
前分子生物学和细胞生物学最热门的研究领域之
一。RNA i技术能够迅速、特异地抑制某个基因的表
达, 所以被作为一种简单、有效地代替基因敲除的
遗传工具。RNA i由长约 21 - 23个核苷酸的双链
RNA分子 ( small interfering RNA, siRNA ) [ 1]介导,以
序列特异的方式抑制同源基因的表达。 siRNA在基
因治疗方面的副作用很小, 且一经发现便很快发展
成为分析基因功能的有力工具。因此, 我们有理由
相信 RNA i在今后的疾病预防及基因治疗方面将发
挥重要的作用 [ 2]。RNA干扰技术的研究发展迅速,
现对其最新进展作一综述。
1 RNA i的发现过程及命名
20多年前, Jorgensen在对矮牵牛 ( petun ias)进
行的研究中发现,将色素基因置于一个强启动子后,
导入矮牵牛中,试图加深花朵的紫颜色,结果多数花
成了花斑的甚至白的,这是因为导入的基因及与其
相似的内源基因同时都被抑制所致 [ 3- 7 ]。后来发
现在其它许多植物中也有类似的现象。首次发现
dsRNA能够导致基因沉默的线索来源于线虫的研
究。 1995年康乃尔大学的 Guo和 Kemphues发现
正义 RNA与反义 RNA一样能够阻断 par1基因的
表达,他们对此难以理解。然而这个奇怪的现象直
到 3年后才被解开, 1998年华盛顿卡耐基研究院的
Fire和马萨诸塞大学癌症中心的 M ello首次将 dsR
NA 正义链和反义链的混合物注入线虫,结果表
现出比单独注射正义链或者反义链都要强得多的基
因沉默, 实际上这正是 dsRNA在起阻断基因表达的
作用。后来的试验表明在线虫消化道中注入 dsR
NA,不仅可以阻断整个线虫的同源基因表达, 还会
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导致其第 1代子代的同源基因沉默。他们将这种现
象称为 RNA i[ 8 ]。在随后的几年中, 研究者们发现
RNA i现象广泛的存在于真菌、水螅和斑马鱼等真核
生物中。目前, 哺乳动物中存在 RNA i的现象也已
经被发现并进入广泛研究中。
2 RNA i的分子作用机制
F ire等在 1998年发现 RNA i现象后,人们便开
始对 RNA i的机制进行深入研究。研究者们相继在
植物、锥虫、昆虫、青蛙以及小鼠等生物体的细胞中
进行试验并取得成功, 使得 RNA i的作用机制逐渐
被阐明。研究发现 RNA i包括两个重要步骤 (图
1) ,第一步: s iRNA的合成 [ 9]。生化研究表明, s iR
NA是由一个 5!磷酸末端和两个碱基冗余的 3!羟基
末端构成的长约 21- 23 nt的双链 RNA ( dsRNA )分
子 [ 10]。 siRNA段由 D icer酶从 dsRNA分子上切割
而来,是一个耗能过程, 需要 ATP的参与。 D icer是
RNase III核酸酶家族的成员, RNase III家族在进化
中非常保守,广泛存在于线虫、果蝇、拟南芥、真菌及
哺乳动物体内。D icer含有一个特殊结构, 包括一个
螺旋区和两个 RN ase III催化区。此外, D icer还包
括一个与 RDE1 /QDE2 /AGRONAUTE等蛋白相互作
用的区域 PIW I区 [ 11 ]。D icer能够产生两种功能不
同的小 RNA: m icroRNA ( m iRNA )和 siRNA, m iRNA
能干扰 mRNA的翻译。第二步: s iRNA与沉默复合
物 (R ISC)结合 [ 12] , 介导 R ISC对靶 mRNA的切割。
切割通常发生在与 siRNA同源部分的中点,离 siRNA
反义链 5!端 10个碱基处。而后 RISC中的 RdRP以
siRNA反义链作为引物,以靶 mRNA为模板合成新的
dsRNA,然后由 Dicer切割产生新的 siRNA,新 siRNA
再去识别新 mRNA, 又产生新的 siRNA, 经过若干次
合成 -切割循环,沉默信号不断放大 [ 13] ,甚至穿过细
胞界限,在不同细胞间长距离传递和维持。
图 1 RNA i的作用机制示意图
3 RNA i技术的应用
RNA i作为一种新的基因阻断技术, 具有特异、
高效、持久的特点, 能够简单、高效地抑制特定基因
的表达,适用于低等动物及高等动物。它不仅将是
研究基因功能分析的一种有力工具, 而且在特异性
的基因治疗方面也同样发挥着重要的作用。RNA i
干扰技术最有希望用于癌基因或抑癌基因的表达,
通过对这些基因功能的研究能给癌症治疗提供足够
多的药物作用靶点,从而为癌症的根治带来前所未
有的机遇。
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31 基因敲除
RNA i能使在体外培养的细胞达到基因敲除的
效果, 对于一些敲除后小鼠在胚胎时就会死亡的基
因,可以在体外培养的细胞中利用 RNA i技术研究
它的功能。如 V an Brock lyn[ 14]等应用 RNA干扰技
术敲低神经鞘氨醇激酶 ( SphK1)表达, 显著减少恶
性胶质瘤细胞系的增殖率; 而且, 在敲低 SphK2表
达时更能抑制恶性胶质瘤细胞系的增殖。同时,还
发现 SphK敲低 ( knock down)能使细胞停止在细胞
分裂周期的 G1期和增加凋亡。
32 基因功能分析
RNA i干扰作为反求遗传学的一种方法,为后基
因组时代的基因功能分析提供了一个可靠而又快速
的应用平台。因为传统的基因剔除、转基因等方法
要么技术要求苛刻,要么过程繁琐,令许多研究者望
而生畏。而 RNA i干扰恰恰克服了上述弱点, 其快
速、可靠、经济的特点受到越来越多的生物学家的关
注。RNA i干扰可用于结构基因的功能研究,除此之
外, RNA i干扰还可用于细胞周期调控、代谢、信号转
导、膜转运以及 DNA损伤反应、转录或甲基化等多
方面的基因功能研究。现研究者们已通过转染 siR
NA在哺乳动物细胞中诱发 RNA i干扰现象的发生,
故多数学者已开始将此方法应用于人类的疾病
治疗。
33 基因治疗
肿瘤的发生常由于原癌基因的异常激活而过度
表达, 为此人们常用反义 RNA进行基因治疗, 反义
RNA使用量大,抑癌效率低,但 RNA i具有选择余地
大和扩增放大效应,只需微量特异的 dsRNA即可产
生明显的抑癌效果, 这对于肿瘤的基因治疗意义重
大,将会获得临床应用。目前抑制基因表达常采用
反义技术或转入没有功能的突变体与该基因竞争。
这两种方法对基因表达的抑制都不如 RNA i高效、
特异、持久。作为基因治疗的工具, RNA i既高效特
异,又简便易行。RNA i在某个基因表达异常增高引
起的疾病中会非常有用, 如病毒感染、肿瘤等。近
来,人们把 siRNA技术引入到 cmyc功能的研究中,
通过体外合成的 cmycsiRNA抑制 COS1细胞内的
cmyc表达活性,成功地抑制了肝癌细胞的增殖 [ 15 ]。
CDK2是调控细胞周期的一个关键基因, 用以 CDK
2为靶目标的 dsRNA能阻断 997%的细胞中 CDK
2的表达, 而在对照中只有 02%的细胞中 CDK2
基因的表达降低 [ 16 ]。因而, 以 CDK2为靶目标的
dsRNA能治疗与细胞异常增殖相关的疾病。例如,
有学者在白血病和淋巴瘤的研究中, 应用 RNA i成
功阻止了慢性髓性白血病 ( CM L)和急性淋巴母细
胞瘤 ( ALL )瘤细胞的生长分化。 BCRABL基因是
导致 CML与 ALL发生的主要致病基因, 设计针对
BCRABL基因的 siRNA可有效抑制 BCRABL基因
的表达并导致瘤细胞凋亡。基于 siRNA的 BCR
ABL基因沉默将可能成为治疗 BCRABL基因阳性
肿瘤疾病的一种重要手段 [ 17]。 Purow等 [ 18]在多个
胶质瘤细胞系应用靶向 N otch1或 Delta1的 siRNA
均诱导细胞凋亡和抑制增殖。并用这些 siRNA预
处理人胶质瘤细胞,发现显著延长鼠类的脑肿瘤模
型的存活率。为此, 可以预测, RNA i技术在不久的
将来用于某种基因突变或过度表达所引起的疾病的
基因治疗具有广阔和光明的前景。
34 调控信号转导通路
siRNA有可能指导着细胞的定向分化。RNA i
已经被证实能引导植物干细胞的分化,因而研究者
们认为 RNA i也可能参与指导人的干细胞的分化。
由于 RNA i在基因表达调控中发挥重要的作用, 对
RNA i微小的干扰就可能导致肿瘤的发生。如 R a
ham an
[ 19]等通过 siRNA介导的白细胞介素13诱受
体 ( IL13Ra2)表达抑制证实: IL13R a2的表达能上
调 STAT3的活性; 并推断 IL13受体介导的 STAT3
信号传导通路可能通过调节抗细胞凋亡蛋白 Bcl2
家族的表达而在多形性恶性胶质瘤细胞的发病中发
挥作用。
35 病毒感染的治疗
RNA i技术可以干扰病毒的复制及相应蛋白质
的翻译。使用 dsRNA或 siRNA进行病毒感染的干
扰试验已在植物及低等生物中取得满意的结果, 研
究者们在人体细胞内的试验也已经广泛开展。最
近, Lee和 Coburn等 [ 20, 21]分别报道使用带有原病毒
DNA及 siRNA的表达载体共转染被 H IV1感染的
细胞株,结果能有效阻止 H IV 1 rev或 tat基因的转
录。上述结果提示, 应用 siRNA可能成为防止
H IV1感染的一种有效手段。 siRNA也在用于其它
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种类的病毒研究, 例如, B itko[ 22]等应用 siRNA成功
抑制了呼吸道合胞病毒 ( RSV )基因的表达, 为防止
RSV感染开创了新的途径。
4 展望
综上所述, RNA i作为一种新的基因阻断技术,
一经发现,便成为科学研究的一大热点,使得越来越
多的研究人员投身于 RNA i技术的研究之中, 尽可
能地了解 RNA i的作用的分子机制和有效的 siRNA
的特征。在不久的将来, RNA i将会给基因治疗的发
展带来新的曙光。尽管目前研究者们对这项功能强
大的技术已经有深入的了解,但在分子生物学技术
突飞猛进的今天,几乎每天都有新的发现。因而,我
们有理由相信, RNA i技术将在功能基因组学领域
掀起一场真正的革命, 并将彻底迅速加快这个领域
的研究步伐。对人类临床治疗而言, 在高度特异的
小分子抑制剂还未正式应用于临床之前, siRNA为
临床上特异性的基因干预治疗开辟了一条新通路。
参 考 文 献
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