全 文 ：华北农学报·2013，28(6) :65 -70
收稿日期:2013 － 07 － 24
基金项目:国家自然科学基金项目(31071807;31272168)
作者简介:张 怡(1985 －) ，女，河南汝阳人，实验师，在读硕士，主要从事植物与微生物互作研究。
通讯作者:李成伟(1972 －) ，男，河南民权人，教授，博士，主要从事植物与病原体互作和抗性分子育种研究。
蔊菜病毒诱导基因沉默体系构建
张 怡，徐克东，杨 松，李 豪，曹 鹏，魏 森，韦丹丹，李成伟
(周口师范学院 植物遗传与分子育种重点实验室，河南 周口 466001)
摘要:构建蔊菜的病毒诱导基因沉默(Virus induced gene silencing，VIGS)体系，旨在建立蔊菜的快速基因功能验
证的方法。通过 ＲT-PCＲ扩增出棉花、大豆、拟南芥的 1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶(Cloroplasto alterados，CLA)基因片
段，并将其分别构建到烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus，TＲV)介导的 VIGS载体，通过农杆菌 GV3101 侵染蔊菜并观
察蔊菜的表型变化。结果显示，3 种不同的 CLA基因所侵染的蔊菜均出现不同程度的白化现象，半定量 ＲT-PCＲ检测
显示 CLA的 mＲNA被显著降解，表明成功构建了蔊菜的 VIGS体系。
关键词:病毒诱导的基因沉默;蔊菜;CLA基因;烟草脆裂病毒
中图分类号:Q78 文献标识码:A 文章编号:1000 － 7091(2013)06 － 0065 － 06
Virus-induced Gene Silencing in Ｒorippa indica Hiern
ZHANG Yi，XU Ke-dong，YANG Song，LI Hao，CAO Peng，WEI Sen，WEI Dan-dan，LI Cheng-wei
(Key Laboratory of Plant Genetics and Molecular Breeding，Zhoukou Normal University，Zhoukou 466001，China)
Abstract:Virus-induced gene silencing system of Ｒorippa indica Hiern was constructed，which will be used in
functional analysis of Ｒ． indica genes． Cloroplasto alterados(CLA)gene fragments of cotton，soybean and Arabidop-
sis were obtained by using ＲT-PCＲ． The cloned CLA fragments were constructed into tobacco rattle virus vector
(pYY13)． The constructed vectors were transformed into Agrobacterium strain GV3101，which was used to inoculate
Ｒ． indica plants． All the infected plants showed photobleaching symptom with different degrees． ＲT-PCＲ of target
genes further confirmed the knock-down of CLA． The established VIGS system will contribute the further study of Ｒ．
indica genes in the future research．
Key words:Virus induced gene silencing;Ｒorippa indica Hiern;CLA gene;Tobacco rattle virus
ＲNA沉默是由 ＲNA介导的通过核酸序列特异
性相互作用抑制同源基因表达的现象，它在真核生
物中普遍存在，其中在动物中称为 ＲNA 干扰
(ＲNAi) ，真菌中称为消除作用，而在植物中则称为
转录后的基因沉默(Post-transcriptional gene silen-
cing，PTGS) ，包括病毒诱导的基因沉默(Virus in-
duced gene silencing，VIGS) ，它是一种利用植物病毒
载体介导的植物基因沉默方法［1 － 2］，当携带植物功
能基因的病毒侵染植物体后，可诱导植物启动 PTGS
机制防御外来基因的侵入，随着病毒基因组的复制
进而沉默掉这些功能基因，从而引起表型或一些生
理指标的变化，由此推测该基因的功能。目前，国内
外研究者已在茄科［3 － 6］、豆科［7］、十字花科［8］和禾
本科［9］等植物中建立了病毒诱导的基因沉默体系，
并成功应用于基因功能验证的研究工作中。
在植物类胡萝卜素的生物合成过程中，1-脱氧
木酮糖-5-磷酸合成酶 Cloroplasto alterados(CLA)基
因的表达与类胡萝卜素的积累密切相关［10］。在植
物中类胡萝卜素的作用主要是吸收光能和猝灭多余
的光能，当植物体内类胡萝卜素表达量下降时，植株
将出现白化现象，此表型通过肉眼很容易分辨，所以
γ脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因可以作为检验病毒
诱导的基因沉默载体系统是否有效的报告基因。
蔊菜为十字花科一年生或两年生草本植物，具
有广泛的药用和食用价值，在全国各地的分布较广。
与经典的模式植物—拟南芥(Arabidopsis thaliana)
相比，具有较强的环境适应性，易于栽培。虽然拟南
芥有其自身的优点，但拟南芥的栽培条件较难控制，
对于环境的变化比较敏感，所以在拟南芥的培养过
程中需投入大量的人力和物力。蔊菜因其本身的特
66 华 北 农 学 报 28 卷
点故而更有发展成为新型模式植物的潜力。
由于蔊菜的基因组未知，无法设计引物扩增其
CLA基因，因此本试验根据拟南芥的 CLA 基因构建
VIGS体系，同时也尝试构建与蔊菜亲缘关系较远的
棉花(Gossypium barbadense，Gb)和大豆(Glycine
max，Gm)的 CLA基因的重组载体，然后分别侵染蔊
菜并观察表型变化，探索同源性不同的 CLA 基因在
同一植物中 VIGS表型的差异，为 VIGS 体系提供新
的寄主植物。
1 材料和方法
1． 1 试验材料
大肠杆菌 DH5α为周口师范学院植物遗传与分
子育种重点实验室保存，pYY13 质粒由清华大学刘
玉乐教授提供。
蔊菜种子由周口师范学院杨同文博士提供。棉
花为海岛棉品种、大豆为中黄 13 品种、拟南芥为哥
伦比亚野生型品种。
主要试剂:ＲNA 提取液(ＲNAiso Plus)、Taq
DNA聚合酶和内切酶 PstⅠ购自宝生物(大连)工程
有限公司，T4DNA连接酶和 cDNA 合成试剂盒为北
京全式金生物技术有限公司;琼脂糖凝胶回收试剂
盒、普通 DNA产物纯化试剂盒均购自艾德莱生物科
技有限公司;其他常用试剂为国产分析纯。
1． 2 试验方法
1． 2． 1 棉花、大豆、拟南芥 ＲNA的提取及目的基因
的扩增 分别选取棉花、大豆、拟南芥 3 种植物的幼
嫩叶片为材料提取总 ＲNA，提取步骤按照试剂盒的
说明书进行操作。
cDNA的合成根据试剂盒操作说明书进行，合
成 cDNA第 1 链。根据 NCBI 上已发表的棉花 CLA
基因序列(GenBank登录号 EF051346． 1)、大豆 CLA
基因序列(GenBank 登录号 FJ830452． 1)和拟南芥
CLA基因序列(GenBank 登录号 NM-117647． 2) ，我
们选择了上述 3 个 CLA 基因的部分编码片段为目
标片段，棉花、大豆、拟南芥的克隆片段总长度分别
约为 500，434，504 bp。利用 Primer 3． 0 在线引物设
计软件分别对 3 种 CLA 基因设计引物(表 1) ，PCＲ
引物合成由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。
分别以棉花、大豆、拟南芥的 cDNA 为模板，进
行 PCＲ扩增，扩增条件为 94 ℃预变性 5 min;94 ℃
变性 30 s，55 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 30 s，30 个循
环;72 ℃再延伸 10 min。
表 1 CLA基因的扩增引物
Tab． 1 The primers used for amplifying CLA fragments
引物名称
Name of primers
引物序列(5→3)
Sequence of primers(5→3)
GbCLA-F GAGGAGAAGAGCCCTATGATGAGTAGATTGCAC
GbCLA-Ｒ CGACGACAAGACCCTCACAACATCGATGATTTAG
GmCLA-F GAGGAGAAGAGCCCTGAAAAGGTCGGCTTCATCAG
GmCLA-Ｒ CGACGACAAGACCCTGGTGGAACTGGCATGAATCT
AtCLA-F GAGGAGAAGAGCCCTCCCTTTGCCTTTGTCATA
AtCLA-Ｒ CGACGACAAGACCCTCTTACTGTGGCTCTTCATT
1． 2． 2 重组载体的构建与鉴定 PCＲ产物和用 PstⅠ
单酶切后的 pYY13 质粒经琼脂糖切胶回收试剂盒
纯化后，分别对目的基因和质粒进行 T4 DNA 聚合
酶的处理，反应条件:65 ℃ 30 min，75 ℃ 20 min。
将 pYY13 连上(dTTP)n，目的基因连上(dATP)n，然
后分别取上述处理过的质粒 1 μL 和目的基因 5 μL
混合(质粒的总量应大于目的基因总量的 5 倍) ，
22 ℃反应 10 min，75 ℃处理 2 min，完成连接反应。
将构建好的重组载体 pYY13-CLA 转入大肠杆
菌 DH5α中，操作依据《分子克隆实验指南》［11］。重
组质粒经 PCＲ 鉴定后送至南京金思瑞生物科技有
限公司进行测序。
1． 2． 3 病毒诱导的蔊菜基因沉默体系的构建 以
气候箱培养的四叶期蔊菜幼苗为试验材料，通过氯
化钙转化法把空载 pYY13(对照)和 3 种不同的
pYY13-CLA转入农杆菌 GV3101。用 5 mL 含有适
量卡那霉素的 LB培养基 28 ℃振荡过夜，挑取阳性
克隆于 5 mL的 LB培养基中，28 ℃振荡过夜。次日
用 50 mL含 10 mmol /L MES和 20 mmol /L乙酰丁香
酮的 LB培养基转接，28 ℃振荡培养菌液至 OD600值
约为 2． 0，离心收集菌体。用侵染缓冲液(液体1 /2
MS、10 mmol /L MgCl2、10 mmol /L MES 和 20 mmol /L
乙酰丁香酮)悬浮菌液，28 ℃振荡培养 2 h 后即可
侵染。用去掉针头的一次性注射器通过压迫法注射
蔊菜第 4 片真叶背面。
被侵染的蔊菜于 22 ℃黑暗条件下培养过夜，然
后在 22 ℃、湿度 30%和光 /暗周期为 16 h /8 h的人
工气候箱内培养，观察被侵染蔊菜的表型变化。
6 期 张 怡等:蔊菜病毒诱导基因沉默体系构建 67
1． 2． 4 ＲT-PCＲ 检测 CLA 基因沉默效果 根据说
明书提取对照蔊菜植株和 CLA 沉默蔊菜植株的总
ＲNA，并合成 cDNA 第一链。采用半定量 ＲT-PCＲ
方法检测沉默植株中 CLA基因 mＲNA的沉默效果，
以拟南芥 CLA基因引物扩增 CLA基因，PCＲ扩增程
序同上(1． 2． 1)。选用拟南芥 Actin 基因(GenBank
登录号 NM_179953． 2)作为内参，利用 Primer 3． 0 在
线引物设计软件对 Actin 基因设计引物，上游引物
5-GAGACAGCCAAAACCAGCTC-3和下游引物 5-
TGAACAATCGATGGACCTGA-3。PCＲ 扩增条件为
94 ℃预变性 5 min;94 ℃变性 30 s，60 ℃退火 45 s，
72 ℃延伸 45 s，30 个循环;最后 72 ℃延伸 10 min。
以合成的 cDNA为模板，对内参基因和目的基因分
别进行 20，25，30 和 35 个循环的 PCＲ 扩增，1． 2%
琼脂糖凝胶电泳检测。
1． 2． 5 蔊菜 CLA基因的克隆与 GbCLA、GmCLA、At-
CLA基因的同源性比较 将 1． 2． 4 得到的蔊菜 CLA
基因的部分片段构建至克隆载体 pMD18-T 载体中，
送至南京金思瑞生物科技有限公司进行测序，并利
用 DNAman 软件将其序列与 GbCLA、GmCLA、AtCLA
序列进行同源性分析和构建系统发育树。
2 结果与分析
2． 1 棉花、大豆、拟南芥总 ＲNA 的提取及目的基
因的检测结果
分别以棉花、大豆、拟南芥的幼嫩叶片为材料提
取其总 ＲNA，得到质量较高的 ＲNA。以总 ＲNA 为
模板进行 ＲT-PCＲ，再分别以其相应的 CLA 基因的
特异引物进行 PCＲ扩增目的基因，结果表明已成功
扩增出 3 个目的基因(图 1)。
1． AtCLA的 PCＲ产物;2． GmCLA的 PCＲ产物;
3． GbCLA的 PCＲ产物;M． DL2000。
1． PCＲ product of AtCLA fragment;2． PCＲ product of GmCLA
fragment;3． PCＲ product of GbCLA fragment;M． DL2000．
图 1 CLA基因片段 PCＲ产物
Fig． 1 The PCＲ products of CLA fragments
A． AtCLA基因片段;B． GmCLA基因片段;C． GbCLA基因片段。
A． AtCLA;B． GmCLA;C． GbCLA．
图 2 重组质粒的部分测序结果
Fig． 2 The sequencing results of recombinant vector pYY13-CLA
A ～ C．分别为 AtCLA、GmCLA、GbCLA基因侵染后的表型(细箭头为对照，粗箭头为沉默植株)。
A － C． Ｒepresent the phenotype of Ｒ． indica 20 days after inoculation with pYY13-AtCLA，pYY13-GmCLA
and pYY13-GbCLA respectively (Thin arrow was control，thick arrow were silencing plants)．
图 3 被病毒载体侵染 20 d后蔊菜的表型变化
Fig． 3 The phenotypic changes of Ｒ． indica 20 days after inoculation
2． 2 重组载体的鉴定结果
将 3 个目的基因和病毒载体 pYY13 分别进行
加 A、T 处理后，通过 T4 DNA 聚合酶的连接构建重
组载体 pYY13-CLA，重组质粒经 PCＲ鉴定后送至南
京金斯瑞公司进行测序，通过单向测序结果证实，3
个目的基因均成功插入到 pYY13 载体中，说明
68 华 北 农 学 报 28 卷
VIGS载体构建成功(图 2)。
2． 3 接种后蔊菜的表型观察结果
3 种沉默载体浸染的植株，接种 15 ～ 20 d 后发
现新长出的叶片均出现了不同程度的光漂白现象，
而阴性对照植株没有白化现象的出现(图 3) ，表明
成功构建了蔊菜的 VIGS体系。
2． 4 病毒诱导基因沉默的 ＲT-PCＲ检测结果
采用 ＲT-PCＲ检测沉默后及对照的植株 CLA基
因的表达情况，经琼脂糖电泳检测发现，3 种 CLA基
因沉默植株叶片的 CLA 基因表达量均显著低于对
照植株(图 4) ，在分子水平上进一步说明蔊菜 VIGS
体系构建成功。
2． 5 AtCLA、GbCLA、GmCLA 和 ＲiCLA 基因的同
源性分析
将克隆的蔊菜 CLA基因(ＲiCLA)的部分片段测
序后，采用 DNAman软件对 ＲiCLA、AtCLA、GbCLA、
GmCLA进行同源性分析，结果显示 AtCLA、GbCLA、
GmCLA和 ＲiCLA 的同源性分别为 95%，77%，78%
(图 5) ，系统发育树显示 AtCLA和 ＲiCLA的同源性较
高聚在一支上，GbCLA、GmCLA聚在另一支上(图 6)。
20，25，30，35 表示 PCＲ 循环数;Actin 作为内参对照;CK． 对照植株;
1． AtCLA沉默的蔊菜植株;2． GmCLA 沉默的蔊菜植株;3． GbCLA 沉
默的蔊菜植株。
20，25，30 and 35 stand for cycles of ＲT-PCＲ;Levels of Actin transcript
were determined as internal controls;CK． Negative control plant;1． Ｒ． in-
dica of AtCLA silencing;2． Ｒ． indica of GmCLA silencing;3． Ｒ． indica of
GbCLA silencing．
图 4 蔊菜 CLA基因沉默的 ＲT-PCＲ分析
Fig． 4 ＲT-PCＲ analysis to show the effect of VIGS
on CLA gene in Ｒ． indica plants
图 5 AtCLA、GbCLA、GmCLA和 ＲiCLA基因的同源性比较
Fig． 5 The homologous comparisons of AtCLA，GbCLA，GmCLA and ＲiCLA
图 6 AtCLA、GbCLA、GmCLA和
ＲiCLA基因的系统发育树
Fig． 6 The phylogenetic tree of AtCLA，
GbCLA，GmCLA and ＲiCLA
3 讨论
20 世纪 90 年代末期，来自美国和英国的 3 位
学者［12 － 14］分别采用带有八氢番茄红素脱氢酶基因
的不同病毒载体侵染本氏烟，导致了目的基因的沉
默，从而开创了 VIGS 技术在研究植物基因功能的
先河。
本试验所用的病毒载体为烟草脆裂病毒载体
pYY13，经 pYL170 和 pYY12 改造而成。该载体含
有 2 个 linker接头，便于外源基因的插入，且在 2 个
接头之间插入了 1 个 ccdB 自杀基因，含 ccdB 基因
的载体只能在 DB3． 1 这种特定的菌株中存活，不能
够在普通的大肠杆菌中存活，因此可高效的回收连
有目的基因的阳性克隆［15］。TＲV-VIGS载体与其他
病毒载体相比具有插入目的基因长、诱导基因沉默
6 期 张 怡等:蔊菜病毒诱导基因沉默体系构建 69
的效率高、持久性长、能侵染植株的大部分组织以及
对宿主不会造成明显的伤害等优点，已经成为研究
基因沉默的最常用载体［16 － 17］。同时 TＲV载体拓展
了宿主范围，据报道，TＲV 的宿主范围包括单子叶
植物在内的 12 个属 50 多个物种，还可以应用到比
较重要的农作物，由此可见，TＲV 载体应用的广泛
性和实用价值。
研究发现，用 400 ～ 500 bp 基因片段重组的病
毒沉默载体侵染植株，基因沉默效果显著［18］。本研
究的试验结果也印证了这一理论。有效的基因沉默
不仅与插入片段的大小有关，还受环境条件的影
响［19］。首先，不同时期的植物对病毒的侵染具有不
同的敏感性，株龄过低的植株对病毒的防御能力较
低，且侵染时也不易操作;株龄过高，则会降低植株
对沉默载体的敏感性。因此，适宜的侵染时期对于
侵染效果有重要的影响。本研究选择蔊菜的四叶
期，这一时期的植株对于沉默载体的敏感性最为适
宜，且容易对植株操作。其次，温度是影响病毒在植
物体内传播的另一重要因素，不同病毒在不同植物
体内的传播速度是不同的，因此，植物所需的有效沉
默温度，对于不同的载体也不相同。研究表明，TＲV
侵染番茄，在 22 ℃或者更低的温度下可诱导较好的
沉默表型的发生。低温低湿的条件有利于有效的延
长沉默时间以及增强沉默强度［20］。然而，也有人在
用 TＲV-VIGS载体侵染烟草时发现，合适的沉默温
度是 25 ℃左右［21 － 22］。因此，对于温度及湿度的控
制在一定程度上影响了沉默效果。试验发现，在温 /
湿可控的光照气候培养箱中进行基因沉默效果显
著，而在人工温室和试验田中进行基因沉默的效果
不明显。此外，不同的侵染方法也可以对基因沉默
的效果产生影响［23］，目前较理想的侵染方法是通过
按压注射将转有重组病毒载体的农杆菌注入植物体
内，这种侵染方法可使农杆菌高效的侵入植株体内。
由于目前对蔊菜的研究较少，因此本试验利用
转化有 AtCLA、GbCLA、GmCLA基因的 TＲV对蔊菜进
行沉默，结果发现，上述 3 种沉默载体均能使蔊菜出
现光漂白现象，且肉眼观察和半定量 ＲT-PCＲ 的结
果显示，采用 AtCLA 基因侵染的沉默植株白化程度
较其余 2 种稍强，说明了不同物种的 CLA 基因同源
性不同可以导致 VIGS 的效果差异，同为十字花科
的蔊菜和拟南芥的 CLA 基因的同源性更高，产生的
VIGS效果较好。进而本研究利用 AtCLA 基因扩增
的引物对 ＲiCLA 进行扩增并测序，序列比对显示，
AtCLA、GbCLA、GmCLA 和 ＲiCLA 的同源性分别为
95%，77%，78%，由此推断，序列间的同源性在
77%以上均可引起相同的沉默效果，Holzberg 等［24］
学者的研究认为，85%以上的同源性就能引起有效
的沉默，本试验为 VIGS 同源片段的扩增提供了新
的理论依据。
本试验所使用的研究材料———蔊菜，是我国的
一味传统中药，据《本草纲目》记载，它具有祛痰止
咳、解表散寒、活血解毒、利湿退黄的功效。其价值
不仅体现在药用和食用价值上，蔊菜还具有抗旱、耐
渍、耐瘠薄、抗菌核病、结实率高等优异性状［25］，说
明蔊菜在科研领域具有潜在的研究价值。同时，蔊
菜病毒诱导基因沉默的成功，在实践上也表明了它
作为新型模式植物的前景与潜力。相信在不久的将
来，蔊菜将作为新型模式植物为生物学的研究和发
展做出巨大的贡献。
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