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生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 10期
紫外线胁迫麦长管蚜 DNA变异的 AFL P分析
赵永田　赵惠燕
(西北农林科技大学植物保护学院 ,杨凌 712100)
　　摘 　要 : 　在 6个不同时间段对不同体色、世代和寄主条件下的麦长管蚜进行紫外胁迫 ,应用 AFLP技术对麦长管蚜基因
组变异进行分析。研究结果表明 :处理时间与变异频率之间存在正相关 ( r = 0. 9466) ;不同体色型的蚜虫和不同抗性寄主饲养
条件下的蚜虫对紫外胁迫表现出不同的抗性 ,红色型蚜虫的变异较强 ,高抗寄主上的蚜虫变异较弱 ; F1代可累代遗传。
关键词 : 　紫外胁迫 　麦长管蚜 　AFLP
AFLP Analysis of Genome Var iation of S itobion avenae
( Fabr ic ius) Under UV Stress
Zhao Yongtian　Zhao Huiyan
( College of P lant Protection, N orthw est A & F University, Yangling 712100)
　　Abs trac t: 　Experiments were carried out about S itobion avenae ( Fabricius) of different colors, generations and hosts under UV
stress of 6 different periods. Genome variation of S itobion avenae ( Fabricius) was analyzed with the AFLP technology. The results showed
that there was a positive correlation ( r = 0. 9466) between the p rocessing time and variation frequency. Resistance of aphids to UV stress
were varied among different body colors and feeding conditions of different host resistance types. Variation of the red type aphid was evi2
dent, variation on host of highly resistant to aphid was weak, and variation can be transm itted since F1 generation.
Key wo rds: 　UV stress　S itobion avenae ( Fabricius) 　AFLP
收稿日期 : 2009204221
基金项目 :国家自然科学基金项目 (39970112, 30470268) ,中德农业合作项目 [ 2006 /2007 (04) ]
作者简介 :赵永田 (19822) ,男 ,硕士研究生 ,研究方向 :昆虫生态与害虫综合治理 ; E2mail: zyttian@163. com
通讯作者 :赵惠燕 ,女 ,教授 ,博士生导师 ,研究方向 :昆虫生态与害虫综合治理 ; E2mail: zhaohy1983@ yahoo. com. cn
　　随着人类工业的发展和生活水平的提高 ,大量
氯氟烃类气体释放到大气中 ,导致大气臭氧层变薄 ,
臭氧层变薄导致的直接结果是太阳辐射中到达地面
的紫外线辐射增加 ,并有继续增强的趋势 [ 1 ]。增强
的紫外线辐射对生物的影响已成为全球生物学研究
的热点领域之一 ,而紫外线照射导致生物体变异已
是不争的事实 [ 2～4 ]。
蚜虫是一类重要的农业害虫 ,个体小、繁殖快且
孤雌生殖。为了生存和繁衍 ,蚜虫必须产生相应的
遗传进化和抗性机制以应对环境变化。姚建秀
等 [ 5 ]用 RAPD技术对紫外线连续辐射诱导一代麦
长管蚜产生的 DNA多态性进行了分析 ,证实紫外线
是诱导蚜虫变异的条件之一。都二霞等 [ 6, 7 ]利用
SSR技术分析了不同剂量紫外线诱导下桃蚜的
DNA变异 ,结果表明 F1代桃蚜产生可遗传的变异致
使 F2代的 DNA发生变异。同时对紫外诱导桃蚜线
粒体基因 CO I2II进行测序可知 , 15 W 紫外诱导 2 h
处理桃蚜的线粒体基因 CO I2II发生单碱基突变 ,而
45 W紫外诱导 6 h处理桃蚜的线粒体基因 CO I2II突
变位点达 9个。这些研究为紫外线对蚜虫的诱变机
理提供了分子生物学证据 ,但未对胁迫时间、寄主、
蚜虫体色和世代等方面进行系统研究。
扩增片段长度多态性 ( amp lified fragments length
polymorphism, AFLP)是将 RFLP的可靠性与 PCR技
术的快捷方便结合起来的方法 ,其重复性好 ,结果可
靠 ,不需了解样本基因组序列即可对其进行检测 ,是
较为理想的一种检测基因组差异的方法。
本研究以麦长管蚜 S itobion avenae ( Fabricius)
为材料 ,运用 AFLP技术综合分析不同处理条件下 ,
包括不同胁迫时间、寄主条件下、体色间和世代样品
2009年第 10期 赵永田等 :紫外线胁迫麦长管蚜 DNA变异的 AFLP分析
间基因组的遗传变异 ,从而为紫外胁迫蚜虫的分子
生态遗传与进化机理提供理论依据。
1　材料与方法
1. 1　材料
1. 1. 1　供试虫源 　供试的麦长管蚜由德国联邦农
林生物研究中心 (BBA , B raunschweig, Germany)室饲
养 ,饲养条件 :温度 ,白天 /夜晚 = 20℃ /18℃;光照 ,
白天 /夜晚 = 16 h /8 h;湿度 (60 ±5) %。
1. 1. 2　供试小麦品种 　小麦品种分别为小偃 - 22
和 A stron。小偃 - 22是我国黄淮流域主栽的综合抗
逆品种 , A stron为德国育成的专性抗蚜小麦品种。
分别经过两种孔目 (4目 , 8目 )的筛子筛选后取中
间颗粒大小一致的小麦种子 ,再经过 1‰的电子天
平称量 ,最后选取重量在 0. 0556 mg左右的 A stron
及 0. 0458 mg左右的小偃 - 22 小麦种子种在
9 cm ×9 cm ×10 cm的塑料盆中 ,单株 /盆。放入人
工智能控制温室内生长 ,所有条件严格统一。生长
条件 :土壤 ∶沙 ∶腐殖质 ∶黑壤土 = 1∶3∶3;温度 : 20℃;
光周期 :白天 /夜晚 = 16 h /8 h;相对湿度 : ( 48 ±
5) % ;按需等量浇水。
1. 1. 3　蚜虫处理 　采集若干头红、绿麦长管蚜成蚜
接种于小麦 A stron和小偃 - 22上 ,待其产子后留若
虫饲养。待其发育为成虫后 ,一组作为对照 ,一组进
行紫外线处理。照射处理时间分别为 1 h、2 h、3 h、
4 h、6 h、8 h。处理方法 :将培养皿外表用滤纸包裹
(保湿 ) ,倒置在紫外光源下 30 cm处 ,成蚜放在培
养皿上进行紫外照射。为防蚜虫逃脱 :将放置培养
皿的托盘 (8 cm ×12 cm ×2 cm )盛满水 ,再放入到
30 cm ×50 cm ×3 cm的大盘内 ,大盘也盛满水 ,双重
防护。照射后的成蚜单头单株小麦饲养。待成虫产
仔后 ,收集成虫 ( F0代 ) ,继续饲养若虫。将成虫用
80%酒精浸泡 ,保存于 - 60℃备用 ;待若蚜发育至成
蚜后继续照射 ,待其产仔后 ,收集成蚜 ( F1代 ) ,保存方
法同上 ;继续饲养若蚜 ,待其发育为成虫 ( F2代 )后同
样方法保存。
1. 2　DNA的提取及 DNA池的构建
1. 2. 1　总 DNA的提取及检测 　单头蚜虫总 DNA
的提取方法参考安瑞生等 [ 8 ]和杨子祥等 [ 9 ] ,并作进
一步修改。所得 DNA经氯仿 /异戊醇 ( v / v = 24 /1 )
抽提一次。用紫外可见光光度计测定 A260、A280 ,计
算其浓度和纯度 ,并用 0. 6%琼脂糖凝胶电泳检测
所提取的总 DNA的完整性。
1. 2. 2　DNA池的构建 　随机选取 10头处理 1 h的
蚜虫的 DNA进行等量混合 ,构建其 DNA池。用同
样的方法构建其余各处理样品的 DNA池。
1. 3　AFLP反应体系
AFLP反应参考 Vos等 [ 10 ]的方法。
1. 3. 1　酶切反应体系 　采用 EcoR I和 M se I双酶切
目的 DNA , EcoR I(10 U /μl) 0. 5μl, M se I( 10 U /μl)
0. 5 μl, Tango Buffer 4 μl, DNA ( 250 ng/μl) 2 μl,
ddH2 O 33μl, 40μl酶切体系 37o C酶切 3. 5 h,于
80o C 20 m in,灭活内切酶。
1. 3. 2　连接反应体系 　在酶切产物中加入 T4 DNA
连接酶 ( 5 U /μl) 1 μl, EcoR I adap ter ( 5 pmol/L )
1μl,M se I adap ter ( 5 pmol/L ) 1μl, T4连接酶 buffer
1μl, ddH2 O 6μl, 16℃连接过夜 , 70℃灭活 15 m in。
连接产物作为预扩增反应的模板。
1. 3. 3　预扩增与选择性扩增 　预扩增采用 E + 0 /
M + 0引物组合 , EcoR I + 0 oligo ( 10 pmol/L ) 1μl,
M se I + 0 oligo ( 10 pmol/L ) 1 μl, 10 ×PCR Buffer
2μl, dNTP (2. 5 mmol/L ) 1. 6μl,Mg2 + (25 mmol/L )
1. 6μl,连接产物 5μl, rTaq酶 ( 10 U /μl) 0. 2μl,
ddH2 O 7. 6μl, 20μl的预扩增反应体系的扩增条
件 : 94o C 30 s , 56o C 30 s, 72o C 1 m in,共 25个循环 ,
最后于 72o C下延伸 5 m in。将预扩增产物稀释 20
倍留作选择性扩增模板。
选择性扩增采用 E + 3 /M + 3引物组合 ,反应体
系同预扩增 ,扩增条件 : 94o C 2 m in, 94o C 30 s, 65o C
30 s, 72o C1 m in,以后每个循环复性温度减 0. 7o C,
共 13个循环 ,然后 94o C 30 s, 56o C 30 s, 72o C 1 m in,
再进行 23个循环 ,最后于 72o C下延伸 5 m in。所用
AFLP选择扩增引物序列表 1。
表 1 所用 AFL P选择扩增引物序列
E1
E2CTA E2E2ATC E3E2ACC E4E2ATG E5E2AGA E6E2AGG
M1
M2ATG M2M2CAG M3M2ATT M4M2ATC M5M2AGT
1. 3. 4　聚丙烯酰胺凝胶电泳 　选择性扩增结束后 ,
每管中加入等体积的 Loading缓冲液 ( 98%甲酰胺 ,
341
生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 10期
10 mmol/L EDTA , 0. 025%溴酚蓝 , 0. 025%二甲苯
氰 FF)。将其置于 PCR 仪 95o C 5 m in, 4o C 5 m in
后 ,冰浴待用。 50 μl 6%变性聚丙烯酰胺凝胶
+ 200μl 10%过硫酸铵 + 50μl TEMED凝固 2 h以
上 , 80 W恒功率预电泳 1 h,取 4μl变性后的扩增
产物于 55 W恒功率下电泳 2～3 h,至二甲苯氰 (淡
蓝色 )电泳至下侧旋纽时 ,停止电泳。将凝胶于 10%
醋酸中震荡直至二甲苯晴条带消失 ;用 ddH2 O洗凝
胶 2次 ,每次 2 m in;移至染色液 (冻 2 L水 ,加 2 g Ag2
NO3 , 3 m l 37%甲醛 ,用前 5 m in配制 )中轻摇 30 m in;
捞起快速竖直控水 ;迅速放入预冷的显影液 (冻 2 L
水 ,加入 60 g Na2 CO3 , 3 m l 37%甲醛 , 400μl Na2 S2 O3 ,
用前 5 m in配制 )中振荡 ;当显影清晰后 ,于 10%醋酸
中固定 3～5 m in;用 ddH2 O洗玻璃板 2 m in即可。立
放 ,胶干后可进行摄影、记数等其它操作。
2　结果与分析
2. 1　总 DNA提取分析
本研究提取的麦长管蚜基因组 DNA经紫外分光
光度计测定 ,OD260 /OD280值界于 1. 8～2. 0之间 ,表明
其纯度较高 ,无蛋白等杂质。从图 1电泳结果可知 ,
DNA主带清晰 ,无拖尾降解现象 ,可用于 AFLP分析。
1～7. 为基因组 DNA;M. Marker 2000
图 1　麦长管蚜基因组 D NA的检测结果
2. 2　预扩增与选择性扩增
预扩增起着承上启下的作用 ,既反映连接是否
成功 ,又直接影响选择性扩增电泳结果。经检测
(图 2) ,可看出其弥散带分散均匀且连续成一片 ,图
谱的范围界于 100～1 000 bp之间 ,稀释后可以作为
选择性扩增的模板。
M1Marker; 1～71预扩增产物
图 2　麦长管蚜预扩增琼脂糖检测结果
2. 3　F1、F2代 DNA变异的 AFLP分析
选取 30对引物组合对 F1、F2代处理和对照进
行 AFLP分析 ,发现差异主要有以下两种情况 :第
一为扩增产物的带型无多态性差异 ,如图 32a引物
组合 E2AGA /M 2CAG;第二为扩增带型的增加或减
少 ,如图 32b引物组合 E2ACC /M 2ATC 和 E2AGG/
M 2AGT。
a. 引物组合 E2AGA /M2CAG;
b. 引物组合 E2ACC /M2AT和 AGG/M2AGT
图 3　扩增产物在 6%聚丙烯
酰胺凝胶电泳后银染结果
统计小偃 222和 A stron品种红、绿色型蚜虫 F1、
F2 代 DNA差异条带的数目 ,计算不同处理的变异
频率 (表 2)。
表 2　品种小偃 222和 A stron红绿色型 F1、F2 代蚜虫 D NA的变异频率
处理时间
( h)
小偃 222 A stron
F1 F2 F1 F2
红色型 绿色型 红色型 绿色型 红色型 绿色型 红色型 绿色型
CK 0 0 0 0 0 0 0 0
1 0 0 0 0 0 0 0 0
2 0 0 0 0 0 0 0 0
3 0. 037 0 0 0. 037 0 0 0 0 0 0
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2009年第 10期 赵永田等 :紫外线胁迫麦长管蚜 DNA变异的 AFLP分析
续表
处理时间
( h)
小偃 222 A stron
F1 F2 F1 F2
红色型 绿色型 红色型 绿色型 红色型 绿色型 红色型 绿色型
4 0. 066 7 0. 043 5 0. 057 1 0. 043 5 0. 037 7 0. 040 0 0. 034 5 0
6 0. 068 1 0. 061 2 0. 060 6 0. 050 0 0. 050 8 0. 045 5 0. 043 5 0. 038 5
8 0. 071 4 0. 064 5 0. 064 5 0. 060 0 0. 070 4 0. 065 2 0. 055 6 0. 048 8
　　紫外处理时间的长短对蚜虫遗传发育的影响差
异极显著 ( P < 0. 01)。处理时间与变异频率之间存
在正相关 ( r = 0. 946 6)。随着处理时间的增加 ,蚜
虫 DNA变异频率不断增加。
蚜虫在 F1代和 F2代均发生了不同程度的 DNA
变异 , F2代蚜虫 DNA的变异频率总体均略低于 F1
代 ,表明经诱导的蚜虫 DNA变异在 F2代有可能恢
复 ,这可能与蚜虫体内的 DNA 损伤修复机制
有关。
红、绿色型蚜虫对紫外处理的反应存在差异 ,红
色型蚜虫在受到照射后 DNA变异频率明显高于绿
色型 ,在小偃 222上表现的尤其明显 ,差异显著 ( P =
0. 048)。说明紫外处理对红色型蚜虫遗传进化的
影响程度比对绿色型蚜虫的影响更强。
紫外处理对不同品种寄主蚜虫遗传变异影响存
在差异。总体表现为品种小偃 222上蚜虫的 DNA变
异频率强于 A stron品种上的蚜虫 ,在红色型蚜虫上
表现的尤其明显 ,差异显著 ( P = 0. 031)。说明相对
于综合抗逆品种小偃 222,专性抗蚜品种 A stron上的
蚜虫可以直接或间接地发展其对不利环境的抗性 ,
而这种抗性在某种程度提高了其紫外处理的适应
能力。
3　讨论
相关分析表明处理时间与变异频率之间存在正
相关 ,这是因为本试验中的紫外剂量主要由辐射时
间来决定。国外已有报道 [ 11 ] ,成纤维细胞经紫外照
射后 ,立刻能观察到 DNA断裂 ,且损伤程度与紫外
剂量呈正相关 ,与本研究结论基本一致。
紫外胁迫造成了蚜虫 F1代、F2代 DNA的变异 ,
但生物机体对其有一定的抗性 ,无论是直接还是间
接作用造成的损伤 ,机体都有一定的修复和再生能
力。但损伤超过一定程度 ,机体不能修复和再生 ,这
就导致细胞的死亡或在 DNA中留下潜在的变异基
因 [ 12 ]。试验中不论是不同寄主上还是不同体色的
蚜虫 , F2代的变异程度均弱于 F1代 ,与上述观点
吻合。
绿色型麦长管蚜表现出对紫外线较强的抗
性。由此可知 ,控制蚜虫体色的某些基因参与了
对紫外诱导的响应机制 ,但具体机制还有待进一
步研究。
不同抗性寄主上的蚜虫也表现了对紫外的不
同抗性 ,专性抗蚜品种上的蚜虫对紫外的抗性更
强。已有研究表明 ,抗药性不同的蚜虫对寄主的
利用存在差异 [ 13 ] 。由此推测不同抗性品种会影响
蚜虫对紫外的抗性 ,可能有以下两方面原因 : ( 1 )
寄主植物中的次生物质诱导激活蚜虫体内与抗紫
外代谢相关的修复酶系 ,引起蚜虫体内的修复酶
系在质 (结构 )或量 (酶量 )上发生变化 ,导致蚜虫
对紫外产生抗性 ; ( 2)不同抗性品种中营养组成的
差异 ,对蚜虫体内生理代谢功能产生较大影响 ,使
之生长发育状况等发生变化 ,提高对紫外线的抵
抗力。
本研究经紫外线诱导处理后 ,麦长管蚜的 DNA
发生变异 ,并且这种变异在蚜虫体色、寄主、世代以
及胁迫时间上表现出很大差异 ,这对进一步深入研
究紫外胁迫蚜虫的分子生态遗传与进化机理和防治
麦长管蚜提供了一定的理论依据 ,对备受关注的全
球气候变化对于地球生物的影响也具有重要的
意义。
致谢 :感谢联邦德国农林生物研究中心 (BBA ) Udo. Heimbach博
士和生物检测实验室 Thomas Thieme博士共同参与实验设计 ,并在
研究实施中提供的便利。 (下转第 155页 )
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2009年第 10期 王继雯等 :抗菌肽 hepcidin融合蛋白在大肠杆菌中表达条件的优化
乏症和慢性病贫血的防治也具有重要价值。由于
hepcidin化学合成非常困难 ,构建用于 hepcidin蛋白
表达的基因工程菌株 ,并对融合蛋白表达条件加以
研究显得颇为重要。
本试验构建了用于 hepcidin基因表达的载体
pET2hec,将其转化至 E. coli BL21中诱导表达 ,分别
研究了诱导温度、诱导时机、诱导时间和诱导剂用量
对重组融合蛋白 H is2hepcidin表达量的影响。结果
表明 ,在 25℃条件下 ,融合蛋白有较高的表达量 ,原
因是在低温度下更有利于重组蛋白的诱导表达。在
工程菌株培养至 OD600为 016时进行诱导可以增加
重组蛋白的表达量 ,原因可能是菌体培养至 OD600为
016时 ,大肠杆菌进入对数生长期 ,新陈代谢加快 ,
加快了重组蛋白的表达。本试验之所以得出最佳诱
导剂浓度为 012 mmol/L,是因为诱导剂浓度对重组
蛋白的表达影响不大 ,从经济角度看 ,选用 012
mmol/L IPTG为最佳诱导剂浓度更加合适。以 8 h
作为最佳诱导时间 ,是考虑到虽然延长诱导时间可
获得较多的表达蛋白 ,但诱导时间超过 8 h后 ,融合
蛋白就不再有明显增加 ,本研究为 hepcidin的大量
生产和临床应用打下了基础。
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