全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第 6期
收稿日期：2008-05-05
基金项目：国家科技部科技支撑计划和福建省重大科技专项（2004NZ02-2）
作者简介：赵巧阳（1981-），男，硕士生，研究方向：园艺植物生物技术；E-mail：qiao992@163.com
通讯作者：赖钟雄（1966-），男，博士，研究员，博导，研究方向：园艺植物生物技术与遗传资源；E-mail：Laizx01@163.com
农杆菌介导的遗传转化方法自 1983 年被首次用于烟草基因转化以来，已经广泛应用于高等植物的转
化。目前，由农杆菌介导的转基因植物已扩展到经济作物、粮食作物、蔬菜、花卉、药用植物、水果、树木及牧
草等，有些已经实现了商品化，在改良植物的遗传性状方面发挥了重要作用 [1]。 农杆菌介导法可直接用不
同的植物组织进行基因转移，方法简单易行，能使被转化的外源基因稳定地整合到植物基因组中，可以转
移较大片段的 DNA 且转移的外源基因常为单拷贝整合，很少会发生甲基化和基因沉默，不易导致外源基
因的失活等。 因此，成为植物遗传转化中的一种重要方法。
在利用农杆菌介导的转化过程中，有许多因素都对其转化效率和外源基因的表达有影响。 Dandekar 等 [2]
在对胡桃的研究中和 Martin 等 [3]在对葡萄的研究中认为，影响转化效率的两个重要因素为用于转染的农杆
菌菌株和目标植物受侵染的部位。 而实际上影响这两个重要因素的方面又很多，如农杆菌菌株、受体基因
型、侵染过程、受体状态、转化条件以及对转化植株的筛选程序等；有许多化合物可以诱导农杆菌 Vir 基因
的活化，如乙酰丁香酮（AS)、羟基乙酰丁香酮、儿茶酚等可以提高农杆菌的转化效率 [4]。 此外，低 pH 值的培
养基 [5]、葡萄糖 [6]等也有助于 T-DNA 的转移，从而提高转化率。 以香蕉“天宝蕉”品种新株系“TY3”为材料，
研究脯氨酸、硝酸银对农杆菌介导的香蕉转化的影响，以期提高单子叶植物香蕉的遗传转化效率。
脯氨酸和硝酸银对农杆菌转化香蕉的影响研究
赵巧阳 赖钟雄
（福建农林大学园艺植物生物工程研究所，福州 350002）
摘 要： 如何提高转化效率是植物遗传转化中的一个关键问题。已经发现有许多物质如乙酰丁香酮（AS) 等许多
酚类化合物、葡萄糖等能够促进农杆菌介导的遗传转化。试验在农杆菌转化香蕉茎尖薄片的过程中附加化合物脯氨酸、
硝酸银，通过对 GUS基因表达的分析发现，这2种化合物均能明显地提高香蕉茎尖薄片的转化率，其中浓度为2mg·L-1的
脯氨酸及2mg·L-1的硝酸银效果最佳。
关键词： 香蕉 农杆菌 遗传转化 脯氨酸 硝酸银
The Effects of Proline and Silver Nitrate on Agrobacterium-
mediated Transformation in Banana（Musa spp.）
Zhao Qiaoyang Lai Zhongxiong
（Institute of Horticultural Biotechnology，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou 350002）
Abstract： How to improve transformation frequency is a key problem in plant transformation mediated by
Agrobacterium tumefaciens，and substances such as phenols compounds （acetosyringone) and glucose can promote
Agrobacterium-mediated transformationin in plants.In this experiment，the effects of two compounds of proline and silver
nitrate on banana transformation of the thin cross-sections viaAgrobacter um tumefaciens，were c mpared. TheGUS gene
expression indicated that the two compounds could improve transformation frequency obviously and the best
concentration was 2mg·L-1for proline or 2mg·L-1f silver nitrate.
Key words： BananaAgrobacterium tumefaciens Genetic transformation Proline Silver nitrate
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2008年第 6期
1 材料与方法
1.1 材料
试验材料为香蕉“天宝蕉”品种新株系“TY3”（Musa spp.，AAA 类群）吸芽，采自福建农林大学园艺植物
生物工程研究所田间试验地。植物表达载体为 pBI121，含有 gus 报告基因、抗性筛选基因和 ACS 反义基因。
1.2 培养基
1.2.1 诱导芽培养基 MS[7]基本培养基+6-BA 4.0mg·L-1+ NAA 0.5mg·L-1；
1.2.2 丛生芽增殖培养基 MS 基本培养基+6-BA 3.0mg·L-1+ NAA 0.3mg·L-1；
1.2.3 重悬菌液的培养基 1/2 MS 基本培养基+蔗糖 100g·L-1，不加琼脂；
1.2.4 共培养培养基 MS 基本培养基+6-BA 1.0mg·L-1+ NAA 0.1mg·L-1，培养温度为（25±2)℃；
1.2.5 筛选培养基 MS 基本培养基+6-BA 1.0mg·L-1+ NAA 0.1mg·L-1 + Cef （Cefotaxime) 300mg·L-1+ Kan
（Kanamycin) 100mg·L-1。
以上培养基以及培养条件如不加以说明均附加蔗糖 3%，琼脂 0.6%，pH5.8，暗培养，培养温度为（25±
2）℃。
1.3 农杆菌菌液制备
挑取农杆菌单菌落接种于含 100mg·L-1 卡那霉素的 YEB 液体培养基，28℃，120r/min 振荡培养至对数
生长期，将培养好的菌液在 4 500r/min（TGL-16C 普通离心机，转子型号为 F1010）4℃下离心 10min 收集菌
体，后将农杆菌重悬于 1/2MS+100g·L-1 蔗糖的液体培养基中，使其菌液浓度达到 OD600= 0.8～1.0 备用。
1.4 香蕉横切薄片与农杆菌共培养
1.4.1 香蕉茎尖横切薄片的制备 将田间采回的天宝蕉新株系吸芽置于自来水下冲洗 3~4h，以洗清外表
的杂质，后于超净工作台上用体积分数为 75%（v/v）的乙醇、0.1％的升汞进行表面消毒，无菌条件下将吸芽
切成 1.5cm 见方大小接种到芽诱导培养基中培养，每 20d 继代一次；之后转接在丛生芽增殖培养基上进行
增殖。
参照张妙霞 [8]横切薄片的方法，选取生长健壮的香蕉植株，在无菌条件下将香蕉试管苗叶片及假茎切
除，仅留顶芽和有分化成芽的组织，将其横切成 1~2mm 的薄片备用。
1.4.2 香蕉茎尖横切薄片的侵染 将茎尖横切薄片移入重悬后的菌液中， 在 28℃，120r/min 条件下振荡
10~15min。倒掉菌液，将外植体移入铺有无菌滤纸的培养皿中，吸干多余菌液，然后将外植体置于共培养培
养基上于 26℃下暗培养 4d。
参照张妙霞 [8]洗菌的方法，共培养 4d 后，将薄片组织转入预先高压好的空三角瓶中，用无菌水冲洗 3~
5 次，最后 1 次用头孢霉素无菌水（含 300mg·L-1 头孢霉素）冲洗并静置 1h，让黏附于薄片上的农杆菌充分
扩散到水中，再用头孢霉素无菌水（含 300mg·L-1 头孢霉素）冲洗 1 遍，置于无菌滤纸上吸干表面附着的水
分后进行 GUS 染色过夜。 酒精脱色，对呈蓝色的薄片组织进行统计分析，比较不同处理对转化率的影响。
1.5 GUS 组织化学检测
取经转化的薄片于微量离心管中，加适量的 X-Gluc 工作液（参照傅荣昭等 [9]的方法，并略有改动。 ），置
于 37℃黑暗条件下保温过夜，用无水酒精脱色，镜检观察 GUS 基因表达的蓝斑。
瞬时表达率（%)=（GUS 基因瞬时表达的外植体数/总外植体数)×100%。
借助对 GUS 基因表达情况的分析，研究了在共培养中分别添加脯氨酸、硝酸银对农杆菌介导香蕉转
化中的影响。以每个香蕉茎尖薄片为单位，统计呈现蓝色斑点的薄片个数，计算其所占的百分率。每个处理
重复 3 次，算出其平均值后作图。
2 结果与分析
2.1 脯氨酸对农杆菌介导转化香蕉的影响
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在香蕉转化试验过程中，在共培养培养基中加入不同浓度的脯氨酸，观察到一定浓度的脯氨酸能明显
提高香蕉的转化效率（图 1)。 从图 1 中可以看出当脯氨酸浓度在 2mg·L-1 时，明显地提高了 GUS 基因的表
达效果，其 GUS 基因表达率为 66.7%；当脯氨酸浓度在 0mg·L-1～2mg·L-1 时，GUS 基因表达率随着脯氨酸浓
度的增加而提高；当脯氨酸浓度在 2mg·L-1～5mg·L-1 时，GUS 基因表达率随着脯氨酸浓度的增加而下降。 另
外表明，当脯氨酸浓度大于 5mg·L-1 时 GUS 基因表达率趋向于零，说明过高的脯氨酸浓度反而不利于 GUS
基因的表达。
2.2 硝酸银对农杆菌介导香蕉转化的影响
在香蕉新株系“TY3”的转化中，在共培养培养基中加入不同浓度的硝酸银，发现低浓度的硝酸银对提
高香蕉横切薄片的转化率具有明显效果 （图 2)。 结果表明 2mg·L-1 的硝酸银最有利于香蕉的转化， 其中
GUS 基因表达率达到 61.73%。
图 1 脯氨酸浓度对香蕉转化率的影响 图 2 硝酸银浓度对香蕉转化率的影响
以香蕉茎尖横切薄片为外植体，研究了加入脯氨酸、硝酸银分别对农杆菌转化效率的影响，并发现在
共培养培养基中分别附加一定浓度的以上 2 种化合物对香蕉的转化都有促进作用。 抗性香蕉茎尖薄片的
生长以及 GUS 基因的表达情况见图 3，GUS 基因在不同生长时期均有表达， 表明 GUS 基因已稳定整合到
了香蕉基因组中。
注： A~D：转化香蕉茎尖薄片的生长 ；E~F：转化薄片的 GUS 瞬时表达检；G~H：转化再生植株叶片的 GUS 稳定表达检测
赵巧阳等：脯氨酸和硝酸银对农杆菌转化香蕉的影响研究
试验发现农杆菌介导的许多横切薄片经 GUS 染色呈蓝色，但大多数长势弱，长成正常的植株较为困
难，只有为数不多的抗性芽能正常生长。在染色呈蓝色的横切薄片中，蓝色的深浅也不同，有的整个薄片均
图 3 转化香蕉茎尖薄片的生长及 GUS 基因的表达
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呈蓝色，而有的薄片仅在边缘呈现蓝色，这可能是 GUS 基因的表达强度不同。
仅对脯氨酸、硝酸银单独作用进行了研究，对脯氨酸、硝酸银的作用是否存在基因型的不同而存在差
异及两者共同使用是否具有加性效应还有待进一步研究。
3 讨论
3.1 脯氨酸、硝酸银可以明显提高香蕉的遗传转化效率
农杆菌 Ti 质粒上 Vir 区编码产物负责接受外界信号、T-DNA 的加工、转移及整合等功能，所以该区对
菌种的侵染力起决定性作用。 因此，农杆菌 Vir 基因的表达及表达水平的高低直接影响到转化，这也是到
目前为止对农杆菌的研究热点仍然集中在 Vir 基因及其编码产物上的原因 [10]。植物受伤细胞分泌的某些酚
类化合物对农杆菌 Vir 基因的表达有诱导作用。 目前广泛使用乙酰丁香酮、羟基乙酰丁香酮等来诱导农杆
菌，提高了转化效率 [11，12]。 此外，其它一些物质如如肌醇 [13]、脯氨酸等 [14]对 Vir 基因也有诱导促进作用。 在共
培养培养基中附加一定浓度的脯氨酸，可以明显提高香蕉的遗传转化效率，这与脯氨酸 [14]对 Vir 基因有诱
导促进作用，从而提高转化效率相一致。
在遗传转化中加入硝酸银可以明显地提高转化效率 [15]。 陈永文 [16]的研究表明，在甘薯的遗传转化中，
预培养基中附加硝酸银不利于进行转化，而在共培养基中加硝酸银则对转化有促进作用。 刘金华等 [17]研究
发现硝酸银对提高大豆的转化率具有明显效果，且 2mg·L-1 的硝酸银最有利于大豆的转化，其中 GUS 表达
率达到 68.1%。 钟名其等 [18]在抗性筛选培养基中添加 2mg·L-1 硝酸银，桑叶盘褐化死亡率减少 7.2%，抗性
芽分化率增加 3.9%，外源基因转化频率增加 9.6%。 黄玉吉 [19]在农杆菌介导香蕉转化的试验中表明，在筛
选培养基中附加 2mg·L-1 硝酸银，香蕉抗性芽分化率增加 7.00％。 本试验在共培养培养基中附加一定浓度
的硝酸银，可以明显提高香蕉的遗传转化效率，这与蓝海燕 [15]认为在遗传转化中加入硝酸银可以明显地提
高转化效率相一致。
3.2 脯氨酸、硝酸银促进农杆菌介导的遗传转化的作用机理
对脯氨酸、硝酸银促进遗传转化的作用机理研究现在大多倾向于认为，脯氨酸可能诱导了农杆菌 Vir
区基因的活化促进了 T-DNA 的转移，从而提高了转化率；在试验中发现，经硝酸银处理后的香蕉横切薄片
分化出的丛生芽较多且长势旺，这与大多数人研究认为硝酸银促进了芽的分化，使转化植株的再生频率提
高，从而提高了转化率是一致的。
农杆菌作为植物基因工程的载体，给外源基因导入植物带来了极大方便，受到了广泛的应用。 人们一
方面力求扩大农杆菌的侵染范围另一方面也努力建立一个简便、高效的遗传转化体系 [17]。 虽然利用农杆菌
介导的方法已将许多具有实际应用价值的外源基因导入植物中， 利用农杆菌介导的某些种属植物的遗传
转化体系已渐趋成熟，但要获得稳定高效的遗传转化程序还有许多方面的工作要做 [17]。 随着植物分子生物
学和植物基因工程技术的迅速发展，这些问题的解决指日可待。
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鉴定分离自杭子梢、 菜豆和决明根瘤、 处于 Agrobacterium 分支的菌株的结瘤性。 但在以 S.meliloti USDA
1002T 的 nodA 作探针进行斑点杂交试验时 ， 在严谨洗膜条件下该探针只能与 S.meliloti USDA1002T、S.
meliloti 102F28（图 1）杂交，与其它种属根瘤菌及土壤杆菌均无阳性印记，或印记极淡。 根据此结果初步推
断，在一定的实验条件下，nodA 探针能很好地区分种内菌株与其他种属根瘤菌及土壤杆菌，即只能在种内
而不能在种间鉴定菌株的结瘤性，这与覃筱婷的报告结果一致 [12]。
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