全 文 ：位物杖术通根
技 术与方法 刀健口r E乙阴叭儿刀心 Y B U L L E Z I N 2 (X 为 年增 刊
药用蛋白质乳腺生物反应器的制作技术及新方法进展
吴应积 张学明 杨东山 罗奋华 旭 日干
(内蒙古大学哺乳动物生殖生物学及生物技术教育部重点实验室 ,呼和浩特 01 0 21)
摘 要: 用乳珠生物反应器生产人类珍稀的药用蛋白已经构成了现代生物技术的一个重要领城与其他的生物工程方
法比起来 ,用乳旅生物反应器生产人类珍稀的药用蛋白具有更多的优点这一生物技术的实际应用依箱于基因的时空表达调
撞操作和可布的转基因动物制作方法 综述了这一技术的优点,概括描述了了乳膝生物反应器表达载体的构建方法 ,及特基因
动物的制作方法 讨论了这些方法的优缺点及技术改进的发展方向,特别是介绍了最近出现的 有研究和应用价值的用精原干
细胞制作转基因动物的方法
关. 询: 乳旅 生物反应器 载体构建 转基因技术
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K ey wo rdS : M am lna 斗砂功d Biore ac tor v ector eonstru etion C ran 缝孵ni c :eehn olo 盯
1 前官
蛋白质在人类个体的生长发育与健康生活方
面扮演着及其重要的角色 所有人的绝大部分蛋白
质水平几乎是相同的 , 估计约有 0.2% 的调节蛋白
质可能有差别 这几十个调节蛋白质在人的生命活
动中起粉重要的作用 ,对人的神经系统 血液循环
系统 消化代谢系统 免疫系统等的正常活动发生
重要的影响 这些调节蛋白质由于遗传 环境或年
龄等因素引起基因突变 缺失 或表达不正常 ,就会
导致人类疾病 因此这些蛋白质成了治疗这类治病
的不可缺少的药物 然而 ,这些天然蛋白质往往含
量极低 ,提取极其困难 ,价格非常昂贵 ,令人望而生
畏 例如 ,美国红十字会两年前公布的用于治疗血
友病的蛋 白药物 Faeto r vi n (FS) l 价值每克为
收稿 日期 二2以拍一02 一26
作者简介 :吴应积 (l 94 6一).男 ,内蒙古大学哺乳动物生殖生物学及生物技术教育部重点实验室特聪教授 ,研究方向:精原干细胞基
因工程 ;E 一M ail :wu 刃121 1@ 163 .co m
2 X为 年 增 刊 吴应积等:药用蛋白质乳腺生物反应器的制作技术及新方法进展
2例X),以刃美元 ,这也许是地球上最贵的物品 Fac -
to : ix (四) 约为每克 40 侧X)美元 大多数人类调节
蛋白的市场价格平均为每克 1(X 刃美元 ,作为药物 ,
每一种人类调节蛋白的世界市场销量估计可达到
10~50 亿美元lzj 社会需求激发了对生产这类蛋白
的技术研究 乳腺生物反应器由于具备较多的优
点 ,在各类生产技术中脱颖而出 ,成为生产这类药
用珍稀蛋白的首选方法 过去将近二十年来对乳腺
生物反应器的研究已积累了许多方法和经验 ,并在
研究中产生了约 10 种药物的乳腺生物反应器13
已取得的研究成果使药物学革命处在一个新的开
端 欧洲药品局 2创拓年 6 月初批准了第一个用乳
腺生物反应器生产的药品 A场 n( 抗凝血酶)在欧盟
上市 l4] , 为这一轮新的药物革命吹响了冲锋号 ,将
推动乳腺生物反应器的研究和应用进人一个新的
高潮 本文叙述了乳腺生物反应器用于药用蛋白生
产的优点 , 回顾了重要的乳腺生物反应器研制方
法 ,介绍了近来出现的新方法 ,并对各种方法存在
的优缺点做了评述
2 乳腺生物反应器生产药用蛋白的优点
动物乳腺生物反应器是 目前为止开发得最为
成功的动物生物反应器之一 , 大量的研究表明 ,各
种各样的重组蛋白都可以通过此途径获得 ,其中包
括一些相当复杂的蛋白分子15~91 选择乳腺表达动
物主要考虑产奶量 繁殖周期 外源基因的表达难
易等因素 小鼠是研究得比较多的转基因模式动
物 ,但小鼠分泌的乳汁量太少 ,并不适合商业化生
产 ,因此一般把小鼠作为模型来检测外源基因的表
达 家兔由于繁殖周期短 性成熟快 后代多 ,因此
适合用来生产需求量较小的药物蛋白 从生物维持
成本和产奶量的角度来看 ,用以食草为主的乳用型
家畜动物进行转基因乳腺生物反应器研究比较理
想 概括起来 ,利用家畜动物乳腺生物反应器生产
药用蛋白具有以下优点 :
1)乳腺可以不断分泌奶汁 ,长期收集不会对动
物造成伤害 ;
2 )对动物的生理活动影响小 ,药物蛋白限制在
乳腺内生产 ,分泌到乳汁中 ,不会进人血液 ,不会对
转基因动物的正常生理活动造成影响;
3 )生物活性高 ,家畜乳腺可对表达的蛋白质进
行糖基化 醋化 磷酸化和形成多具体等一系列翻
译后加工 ,产品接近天然提取物 ,活性高 ,不易产生
抗药性
4 )产量大 ,易提纯 动物乳腺每年产奶量多 ,因
而 目的蛋 白表达量多 如一头牛每年可产奶 8
侧X卜10 (XX) L ,奶中蛋白含量占 3.2% 一3.6% ,则一
头牛一年可生产蛋白近 30 kg; 一只羊产奶 以x -
so L ,可生产纯蛋白 20 一 30 kg; 一只家兔也可以产
Zk g 纯蛋 白 药用蛋白基因在乳腺中的表达效率
高 ,可达到每升几克到几十克 乳汁中含有的其他
蛋白质成分比较明确 ,目的蛋白纯化工艺相对较为
简单容易
5 )设备简单 ,无环境污染 转基因动物只需饲
养在洁净的环境 ,并不需其它特殊设施 ,基本上是
一个畜牧业过程 ,不会造成环境污染 ;生产的药用
蛋白为纯生物制品 ,避免了化学试剂及生物毒素的
污染
6)开发周期短 目前一种新药从研制开发到上
市约需 巧 至 20 年 如果技术成熟后利用动物乳腺
来生产 ,仅需 5 年左右 如以转基因动物研制的周
期来计算 , 转基因羊从显微注射到泌乳的周期是
18 个月 ,也就是说 18 个月即可以进人生产阶段
7 )生产成本低 ,经济回报丰厚 用转基因动物
乳腺反应器生产药用蛋白是新型朝阳产业 据测
算 , 用传统的细胞培养生产 l克基因工程药物 ,平
均成本为 10 一1 (X )美元 ,而利用动物乳腺反应器
生产成本仅需 ro 一25 美元 美国 D & M D 公司的市
场分析报告显示 , 2025 年仅美国的生物药品的需
求量就将达到每年 860 亿美元
3 蛋白质药物乳腺生物反应器的制作技术
及新方法进展
乳腺生物反应器的制作技术分为两个大的部
分 其一是乳腺生物反应器表达载体的构建 ,其二
是通过生殖系统细胞操作将表达载体导入胚胎以
产生转基因动物 表达载体的类型对目的基因在染
色体中的整合方式 表达调控模式及表达效率等有
直接的影响 生殖系统细胞操作则是产生转基因动
物的关键步骤 病毒类表达载体由于 自身的局限
性 , 在乳腺生物反应器的制作中应用价值不大 ,在
这里不加以讨论
性物杖术通稚丑白翻chno 城盯 2 (洲为 年 增 刊
3.1 家畜乳腺生物反应器表达载体的构建
外源基因在动物乳腺中高效表达有两个前提 :
一是选用的调控成分能够指导目的基因在乳腺中高效 特异地表达 ,并且表达产物能分泌到乳汁中
乳汁中含有大量的蛋白质 ,理论上认为乳蛋白在乳
腺中特异 高效表达并能随乳汁分泌到体外是由其
特异的调控序列控制 ,因此乳蛋白基因及其表达调
控序列的研究成为热点 ;二是整合到动物染色体组
中的表达载体(调控序列+外源基因)要处于一个开
放和活跃转录的状态 这两个前提在设计和构建表
达载体时是必须考虑的 常用的乳腺生物反应器的
表达载体分为下列三类 : 普通质粒的表达载体 人
工染色体的表达载体 基因打靶表达载体
3.1.1 基于普通质粒的表达载体 构建乳腺反应
器普通质粒表达载体的一般思路是将乳蛋 白基因
的 5 , 端上游启动区与外源基因构建成一个融合基
因 ,以利用乳蛋白基因启动子及其调控序列指导外
源基因在乳腺中的特异表达 表达构件主要由 3 部
分构成 :乳汁蛋白基因 5 端及其上游区 目的基
因 含州必 信号的基因3 端及下游区 为了促进
外源基因在乳腺中的高效 特异表达 ,有研究者认
为应尽可能获得足够的 5 端启动区及其上游的调
控区 基于普通质粒的外源基因随机整合到宿主基
因组中 ,往往产生位置效应 ,影响外源基因的高效
表达 为了提高外源基因的表达效率 ,研究者采用
位点控制区I卜l2] 和核基质吸附区I31 等绝缘子元件
来消除位里效应 , 但 由于外源基 因插人位置的
D N A 环境对其表达作用十分复杂 , 绝缘子只能在
某些环境中起作用 ,而在另一些环境中不能发挥作
用 ,因而 ,随机插人导致的位置效应不能完全避免
3.1.2 基于人工染色体的表达载体 基于普通质
粒的表达载体常常将乳蛋白的一些调控元件人为
地拼凑在一起 ,而这些调控元件之间的序列并非毫
无作用 ,并且可能还有一些调控元件未被发现 普
通质粒的容量有限 , 不可能将整个区域都包含进
去 为了保持表达调控序列的天然状态 ,减少人为
的组装 ,就有必要利用整个区域的调控序列来表达
外源基因 要克隆整个区域 ,就需要醉母人工染色
体 (ye as t art ific ial chro mo so m e,Y AC )或细菌人工染
色体 (bac terial art ifieial cho m oso m e, BA C )这样的大
容量载体 应用人工染色体所建立的转基因动物 ,
绝大部分已证实具有位置独立效应 组织特异性
发育时序性和拷贝数依赖性 ,且有与内源性基因相
当的表达水平 19 7 年 , Fuj i~ 等Il4j 构建了 21 0kb
包含有人 a一乳白蛋白基因的 YA C 载体并制作了
转基因大鼠 , 乳汁中 , 人 a一乳白蛋白浓度为 2一
3. 4m 岁回 ,表达仅限于乳腺组织并且没有观察到位
置效应的影响 为进一步分析人 a一乳白蛋白基因
调控元件的位置效应 , 19 9 年 , Fuj iwa ra 等I5]又分别
构建了含有不同大小人 a一乳白蛋白基因的 Y A C
载体用于制备转基因大鼠 ,结果发现 ,含有 50 kb 大
小的人 a一乳白蛋白基因的 Y A C 载体的转基因大
鼠的表达模式是不依赖于位置效应的 , 而 20 kb 大
小的载体还是依赖于位置效应 此外 , 他们还将
210肠 包含有人 a一乳白蛋白基因的 Y AC 载体中的
人 a一乳白蛋白基因启动子用牛 p一酪蛋白启动子
置换后制备了转基因大鼠 ,结果外源基因的表达模
式是依赖于位置效应的 这说明不同基因的调控元
件的表达模式对位置效应的依赖性是有差异的 ;
20 3 年 , Fuj iw ar Y 等116 又构建了 130k b 含有人 a -
乳白蛋白基因的 BA C 载体 ,制备了转基因大鼠 ,结
果发现外源基因的表达模式是依赖于拷贝数而不
依赖于整合位置 20(抖年 ,我国的任立明等 l7]构建
了可以在动物乳腺中高效表达外源基因的 Y A C 载
体系统 以上这些结果提示 ,用整个乳蛋白独立转
录单位的调控序列构建人工染色体表达载体 ,使外
源基因表达不受随机插人位置的影响 ,是将来的发
展方向之一
但人工染色体尚有一些难以避免的缺陷 ,如
Y A C 易发生嵌合体现象 ,克隆的片段不稳定 ,易发
生缺失 虽然 ,Y A C 已在基因克隆中得到了广泛的
应用 , 但在用作乳腺生物反应器表达载体方面 ,还
处于初步阶段 ,因而在实际工作中的应用还有待进
一步研究
3.1.3 基于基因打靶的表达载体 基因打靶是通
过同源重组将外源基因定点整合到靶细胞基因组
某一确定的位点 ,以达到定点修饰改造染色体 卜某
一基因为目的的一种技术118 基因打靶能对基因整
合位点与整合的拷贝数进行有效的控制 , 因而 ,随
着体细胞核移植技术的成功 ,用体细胞基因打靶制
2以为 年 增 刊 吴应积等:药用蛋白质乳腺生物反应器的制作技术及新方法进展
备家畜乳腺反应器便成为研究的热点 打靶载体通
常是由两个与基因组靶序列同源的片段组成 ,在两
片段间插人与基因组靶序列非同源的外源基因 通
常的打靶载体分为插人型载体和置换型载体 ,二者
的区别在于载体线性化的位置不同 ,发生同源重组
的交换次数不同 因而打靶的效率也不同 在打靶
位点的选择上 ,乳蛋白基因座 自然成为制备乳腺反
应器的首选基因座 早在 19 2 年 H en ni gh au sen [19l 提
出在乳蛋白基因座或者允许基因可控表达的基因
座 ,应用 C re /肠xP 重组系统导人外源基因 ,实现外
源基因的高效表达 , 制备乳腺生物反应器 ;19 9
年 , Kol b A F 等侧对 p一酪蛋白基因进行基因插人的
研究 ,在体外培养的乳腺上皮细胞中验证了中靶序
列的表达比随机插人提高了 10 倍 非乳蛋白基因
座的外源基因靶向插人不仅在小鼠获得成功 ,而且
在羊也获得成功 20( X) 年 ,英国 PPL 公司的科学家
利用体细胞基因打靶一核移植技术体系将人 A AT
(Al pha 一1抗胰蛋白酶 ) 基因定点到绵羊胎儿成纤
维细胞的原胶原基因座上 ,获得了世界上首例基因
打靶家畜 , 其乳中 A A T 蛋白含量达到了 65 0m gl ,
远远高于显微注射绵羊 的最高水平(18mg l ZIJ
动物体细胞基因打靶效率远比小鼠 E S 细胞打
靶效率要低 ,且体细胞体外存活时间有限 ,因此 ,如
何合理构建打靶载体 提高体细胞打靶效率 减少
体细胞传代次数成为使用体细胞基因打靶一核移植
技术制备乳腺生物反应器的重要课题
3. 2 通过生殖系统细胞操作将表达载体导入胚
胎以产生转基因动物
用于乳腺生物反应器制作的生殖系统细胞操
作技术比较成熟的有原核显微注射法和核移植法
自从 20 世纪 80 年代以来 ,原核显微注射法一直是
制作转基因动物的主导技术 ,为了克服转基因动物
研究中出现的大量问题 ,研究者们不断地对这一技
术加以改进 ,并一直在努力尝试新的转基因动物技
术以替代原核显微注射法 19 7 年克隆羊多莉
(Dol y ) 的诞生为转基因动物的制作引进了新的思
路和方法 ,将核移植与转基因技术结合起来形成了
新的转基因动物制作方法一转基因克隆法 随着精
原干细胞辜丸移植方法的发明 ,精原干细胞体外培
养及遗传修饰等方法的出现 ,现在正在形成一套崭
新的雄性生殖系统细胞操作方法 这套方法在转基
因动物制作中的应用已经崭露头角 ,将在乳腺生物
反应器的制作中发挥重要影响 这里介绍这些方法
的要点 优缺点及其研究进展
3. 2.1 原核显微注射法 原核显微注射法(Pro nu -
elear M iero inj eetion) 是指通过显微操作仪把外源基
因注人受体动物的受精卵原核 ,外源基因整合到受
体细胞染色体组上 ,发育成转基因动物的技术 这
是发展最早 目前使用最为广泛的方法 ,已经生产
出了转基因小 鼠及兔 绵羊 猪 牛 鱼和鸡等各种
转基因动物 但该方法操作技术复杂 ,设备昂贵 ;导
人外源基因的拷贝数无法控制 , 而且整合率极低 ,
在小鼠上所获得转基因动物仅是注射卵的 3% ,在
大家畜和其他动物更低 1997 年 , K upriyanov 等I刀]
报道用小鼠进行双原核注射实验 ,总体上可提高小
鼠转基因效率约 60 % ,效果明显 但是 ,该方法应用
于牛羊等大动物则遇到了困难 1997 年 , Th kad a 等
侧 报道采用转录延长因子 E F一la 的启动子驱动
G FP 基因表达 ,显微注射小鼠胚胎 383 个 , 3巧 个用
于进一步培养 , 148 个发育到囊胚 ,囊胚中有 59 个
有 C即 表达 ,移植后代中 70 % 为转基因鼠 ,提高了
转基因鼠的制作效率
由于显微注射法的盲 目性 , 需要大量的供 受
体动物 ,导致费用增高 ,对于家畜这一缺点更为明
显 此外 ,显微注射法不能控制外源基因的整合位
点 , 造成外源基因在宿主染色体上的随机整合 ,基
因的表达和遗传稳定性得不到保证 由于位置效应
可导致外源基因的非正常表达或不表达 ,而且常导
致宿主 D N A 染色体序列丢失或重排 , 造成严重的
生理缺陷 ,甚至死亡 因此 ,原核显微注射法多用于
转基因小鼠的制作 ,在家畜乳腺反应器上应用价值
不大
3. 2. 2 核移植法 19 7 年 D ol y 的诞生 ,掀起了核
移植研究的热潮 19 7 年 6 月 , W il m ul 研究小组I州
等人报道了用胎儿细胞为核供体 ,获得了表达治疗
人血友病的凝血因子 ix 的转基因克隆绵羊 他们
的工作表明直接以胎儿体细胞为转基因受体细胞 ,
继而以转基因的体外培养细胞为核供体制作转基
因克隆动物是一条可靠的转基因动物制作路线 ,为
转基因动物研究注人了新的活力
坡物技术通摧丑白翻动肋城盯 2 (X 为 年 增 刊
体细胞核移植技术将卵母细胞 的核 D N A 去
除 ,并代之以供体细胞的核物质 在这个过程中 ,重
构的卵母细胞通过体外激活来启动胚胎发育的进
程 如果被移植到合适的受体体内 ,这个重构胚或
称为克隆胚就可以发育产生后代 利用体细胞核移
植技术制作转基因动物的优点在于供体细胞可以
在体外进行筛选 这种对转基因供体细胞的预筛选
有助于保证产生的动物为转基因动物 圈 来 自胚
胎 胎儿以及成体组织的细胞都可以通过化学的
(如 ,脂质体 磷酸钙等 ) 以及物理的 (如 ,电穿孔
基因枪 直接注射等 )方法进行基因转染 基因转染
后 ,外源基因整合人基因组合适位点的转基因细胞
单克隆被筛选出来 ,建立起一个稳定整合有转基因
的细胞系 这种细胞系也可以来自利用其他方法已
经获得的转墓因动物的活体组织分离培养 由于在
核移植中 ,卵母细胞的核 DN A 被供体细胞所代替 ,
因此得到的后代其核遗传物质完全是来 自于这个
供体细胞的 ,从而避免了嵌合体的问题 因此 ,利用
转基因体细胞经核移植技术得到的所有后代都是
转基因动物 目前利用体细胞核移植技术已经获得
了多种动物的转基因后代l解一侧与原核显微注射法
的低效率相比 ,这一技术大大提高了转基因动物的
制作效率 而且 ,经过对供体细胞系合适的筛选和
鉴定 , 大多数产生的转基因动物能够表达外源基
因 这就明显的减少了制作一头转基因动物所需的
动物个体数阱侧 ,大大地降低了转基因动物的制作
成本
基因打靶 (Ge ne tar geting )已经在小 鼠 ES 细胞
上获得成功 , 并获得了基因敲除的转基因小鼠后
代 但是大家畜的 E S 细胞 目前还难以分离建系 ,而
体细胞的基因转染已经是很成熟的技术 ,可以将体
细胞基因转染后在体外培养的条件下筛选得到定
点整合的转基因细胞系用于核移植 ,因而有望通过
体细胞核移植技术产生基因打靶的大家畜 ,这是传
统的转基因制作方法无法实现的 2 X ) 年 , M c-
Cre at h 等l2] 采用转基因体细胞核移植的方法得到了
外源基因定点整合的转基因绵羊 ,首次实现了大动
物的基因打靶
尽管采用核移植的方法可以大大提高转基因
动物的制作效率 ,但是这一方法同样面临体细胞核
移植技术所面临的问题 这些问题包括 ,核移植来
源的胚胎进行移植后妊娠率偏低 ,流产率高以及出
生后死亡率高等国 研究表明 ,不同物种间 ,这些指
标是有差别的I27, 周有证据表明 ,在牛和小鼠中 ,供
体细胞来源 ,遗传背景 ,及其在体外接受的处理都
会影响核移植的效率和后代的发育能力13一划有理
由相信 ,通过家畜胚胎干细胞系培养成功以及其他
技术改进 ,与核移植有关的这些问题将会得到改善
甚至彻底解决
转基因克隆动物技术降低转基因动物制作的
技术难度和投人成本 , 将成为 21 世纪制作转基因
动物的主导性技术 ,对该技术的研究有望迅速实现
乳腺生物反应器的应用推广和产业化
3. 2. 3 精原干细胞移植法制作转基因动物 这是
一套正在形成的新的转基因动物制作方法 2(X) 5年吴应积等 洲 对这一方法已有评述 19 4 年由
Brinste r等人l3S, 翔创立了精原干细胞移植法 这一方
法实现了在受体小鼠辜丸中发生供体精原干细胞
的精子分化过程和单倍体的生殖遗传 ,不仅为精子
发生过程的研究提供了有力的工具 ,也为转基因动
物的制作指出了可能实现的新途径 在这个方法的
基础上产生了一系列相关的新方法 与精原干细胞
培养方法相关的研究成果不断涌现 , 一火精原干细
胞的转基因技术已初见成效142]; 精原干细胞的冷冻
保存方法已经建立l3 书]; 辜丸移植受体的制备方法
不断改进完善晰一刘;家畜肇丸移植的方法已经成功
闪一划以上所述的新近发展起来的相关技术 ,正在
形成以精原干细胞移植技术为核心的新的转基因
动物制作方法冈 根据精原干细胞的供体与受体的
差异将这一方法划分为两类 :同种异体移植法和同
体移植法洲
3. 2. 3.1 同种异体移植法 同种异体移植指在同
种动物的不同个体之间进行的精原干细性胞移植
用性不成熟的受体进行精原干细胞的同种异体移
植 ,不用对受体进行免疫抑制处理 ,在小鼠国 大鼠
阅 ,猪刚 ,羊148 和牛l51] 中都取得成功 这类动物就可
以用同种异体移植法制作转基因动物 由于这个方
法的供体和受体是同种动物的不同个体 ,实验安排
比较灵活方便
3. 2. 3. 2 同体移植法 有些大动物 (如牛 )在同种
2 O( 为 年 增 刊 吴应积等:药用蛋白质乳腺生物反应器的制作技术及新方法进展
异体移植实验中发现对植人的精原干细胞有免疫
排斥倒 这些动物在用精原干细胞移植法制作转基
因动物时 ,用同体移植法是最优选择 因为大动物
辜丸较大 , 一个辜丸就满足制备精原干细胞的需
要 更重要的是同体移植无免疫排斥 ,大大简化了
受体制作的过程 同体移植法与同种异体移植法大
同小异 不同点在于同一个动物的一侧辜丸作为供
体用于制备精原干细胞 ,而另一侧肇丸作为受体
精原干细胞的本质特征 ,决定了用精原干细胞
移植法制作转基因动物有较多的优点 根据十年来
对精原干细胞移植的研究结果 , 将优点陈述如下 :
l) 移植操作比原核显微注射法和核移植法简单 ;2)
移植成功率高 ,从鼠类到大家畜如牛 ,用上述三种
移植方法中的任一种 , 移植成功率低者可达 25 % ,
高者将近 70% 刘;3) 供体的遗传特性通过生殖系遗
传 ,无嵌合体 ,后代的生理异常尚无报道;4) 不需要
假孕母体 ;5) 大大降低了制作转基因家畜的成本
这来自两个方面 , 由于成功率高减少了工作时间 ;
而不需假孕母体 ,对一胎两胎生的家畜来说 ,其制
作成本的节省就更加明显
至今为止 ,用精原干细胞移植法制作转基因小
鼠已获得成功 一541 最近用 A A V 病毒载体转导精
原干细胞结合精原干细胞移植法注射受体山羊辜
丸 , 经过受体内精子发生过程产生转基因精子 ,已
经获得了表达绿荧光蛋白转基因精子阴 这套方法
很快就会得到改进和推广应用 这套方法的优点是
成功率较高 ,不用假孕母羊 ,操作相对简便 ,研究成
本较低 然而 ,用精原干细胞移植法制作转基因大
动物 ,尚存在较多问题 主要问题是大动物精原干
细胞长期培养方法还没有建立 消除大动物受体内
源的精原干细胞 目前多用 x一射线或 galn lna 一射线
局部照射 ,还没有更简便的解决方法 病毒载体对
插人的 D N A 片段大小有限制 , 怎样消除这一限制
也需要解决 这些问题一旦解决 ,用精原干细胞移
植法制作乳腺生物反应器就指日可待了
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