全 文 ：《食品工业》2015 年第36卷第 8 期 178
研究探讨
肾茶提取物对奶牛乳腺上皮细胞的保护及抗炎活性
王钦博，杭锋，穆海菠，于华宁，朱军伟，齐晓彦
乳业生物技术国家重点实验室，光明乳业股份有限公司（上海 2004 36）
摘 要 奶牛乳腺炎的发生导致牛奶体细胞增多, 严重影响乳品品质。肾茶作为日常饮品安全性已得到广泛证
实。采用肾茶叶柄花等副产物进行水提, 通过研究其自由基清除作用、对LPS诱导的RAW264.7释放NO的抑制作
用、TNF-α产生的影响及炎症相关因子表达及对体外培养的乳腺上皮细胞的保护作用。结果表明, 肾茶副产物提
取物能有效清除DPPH自由基, 降低LPS诱导的RAW264.7细胞NO及TNF-α产生, 下调IL-1β、IL-2表达, 上调IL-10
表达, 对IL-4无影响; 能提高氧化应激下乳腺上皮细胞的活力, 同时结果显示肾茶副产物提取物有一定的促进上皮
细胞活力作用, 且与作用浓度密切相关。肾茶副产物提取物可以作为一种添加剂解决奶牛的乳腺炎问题, 为解决牛
奶中体细胞增多问题提供新的思路。
关键词 肾茶副产物; 抗氧化; 抗炎; 乳腺上皮细胞
Mammary Epithelial Cells Protect and Anti-inflammatory Effects of
Orthosiphon aristatus by-Product Extract
Wang Qin-bo, Hang Feng, Mu Hai-bo, Yu Hua-ning, Zhu Jun-wei, Qi Xiao-yan
State Key Laboratory of Dairy Biotechnology, Bright Dairy & Food Co., Ltd. (Shanghai 200436)
Abstract The occurrence cause of mastitis in dairy cows milk somatic cells increase, seriously affecting the
quality of dairy products. Orthosiphon aristatus also called renal grass. Its safety has been widely confi rmed. Use
Orthosiphon aristatus extract to study on the free radical scavenging effect, and the production of NO and TNF-
alpha of RAW264.7 cells induced by LPS, expression of inflammation related factors and protective effect on
cultured mammary epithelial cells. The results show that orthosiphon extract can effectively scavenge DPPH free
radical, reduced the RAW264.7 cells NO and TNF-alpha induced by LPS, and down regulation of IL-1 and IL-2
expression, up regulation of IL-10 expression, but had no effect on IL-4; It also can improve mammary epithelial
cell activity in the condition of oxidative stress, and the results show Orthosiphon aristatus extract can promote
epithelial cell vitality certain effect, which is closely related with the effect of concentration. Extracting Orthosiphon
aristatus can be used as an additive to solve the problem of dairy cow mastitis, and provide a new idea for solving
the problem of milk somatic cell number.
Keywords Orthosiphon aristatus by-product; antioxidantion; anti-infl ammatory effects; mammary epithelial cells
基金项目：十二五科技支撑计划（2013BAD12B08）南方大城市奶
牛健康养殖生产技术集成及产业化示范
正常的乳腺分泌物除了非细胞成分外，还包括淋
巴细胞、上皮细胞等体细胞。正常状态下，这些体细
胞在维系乳腺本身功能、使初生动物获得免疫等方面
具有重要作用。而当动物乳房炎发生时，乳腺分泌物
中体细胞数量（Somatic cell count, SCC）会急剧上升，
严重影响乳品品质。SCC也是评价奶品质量的一项重
要指标，通常将[1]奶品依据体细胞数的高低把奶分为
三个等级：优（＜100 000 mL-1）、中 （100 000~
300 000 mL-1）、差（＞100 000 mL-1）。
解决乳品中体细胞数量的关键在于控制乳房炎的
发病情况。一项研究表明，全世界奶牛中1/3患有多
种类型的乳房炎，而我国奶牛乳房炎患病比例则更
高[2]。传统解决乳房炎的方式往往是采用抗生素治疗
的方式，但是随着目前人民群众对牛奶品质的日益提
高以及抗生素滥用带来的严重后果的日渐明显，仅仅
依靠抗生素治疗的方法也受到越来越多的质疑。
肾茶（Orthosiphon aristatus）是一种生长在热
带、亚热带地区的唇形科肾茶属植物。在东南亚国家
如印尼、马来西亚等广泛分布，我国的海南、广西、
云南等也有分布[3]。肾茶提取物已被证实具有自由基
清除、抗菌、抗肿瘤和抗炎症等多种生物活性[4]，其
独特的肾脏保健功能更是为马来西亚等国人民喜爱，
被用作日常茶饮品[5]。目前肾茶人工种植及快繁技术
已日渐成熟[6-7]，因此，对于肾茶相关产品的研究开发
在成本方面得到了保障。同时，肾茶生产还会有大量
副产物，如粗老叶片、叶柄、花等，往往只能丢弃，
未能充分利用。
因此，研究充分利 用肾茶副产物的利用也十分有
价值，试验旨在证实肾茶副产物提取物的抗炎症能
力，以期初步明确肾茶副产物的抗炎机理，为使用肾
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茶副产物作为奶牛饲养的添加成分，解决奶牛乳腺炎
问题奠定基础 。
1 材料与方法
1.1 主要试剂及肾茶副产物水提物制备
1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、胰岛素、
脂多糖（LPS）、噻唑蓝（MTT）、皮质醇、表皮生
长因子（EGF）：Sigma公司；TNF-α检测ELISA试剂
盒及角蛋白18一抗、FITC标记二抗：上海源叶生物
科技有限公司；细胞培养基DMEM/F12：Hyclone公
司；血清FBS：Gibco公司；荧光定量试验所用各种
试剂：大连宝生物（Takara）公司；超氧化物歧化酶
（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-px）、过氧化
氢酶(CAT) 及丙二醛（MDA）含量试剂盒：南京建成
生物有限公司；其它试剂均为国产分析纯。
试验用肾茶副产物购自云南西双版纳，为农户采
摘挑选后丢弃的肾茶叶柄、粗老叶片、凋谢花瓣等，
采摘时间为2013年，购买时已经晒干处理。1 kg肾茶
副产物经清水漂洗一次后，粉碎为8目左右大小，加
入到10 L 60 ℃纯净水中，保持60 ℃浸提24 h。浸提液
趁热经80目尼龙网过滤，滤液由经喷雾干燥，搜集干
燥所得肾茶副产物水提物粉，常温干燥保存。
1.2 总酚含量的测定
样品中总酚含量的测定参照GB/T 8312—2002方
法进行。
1.3 肾茶副产物水提物的体外DPPH自由基清除能力
测定
配置0.2 mmol/L的DPPH（乙醇溶解），溶液呈
蓝紫色，反应时将1 mL DPPH溶液与1 mL待测样品混
合，混合体系25 ℃孵育30 min，在517 nm条件下测定
反应混合液体系的吸光度，并与空白样品进行比较，
维生素C用作阳性对照。采用公式（1）计算清除率。
DPPH清除率= =
Acontrol-AOS
Acontrol
×100% （1）
式中：Acontrol-阴性对照的吸光度；Aos-肾茶副产
物水提物的吸光度。
1.4 肾茶副产物提取物对巨噬细胞的NO及TNF-α产
生影响
采用LPS诱导的RAW264.7细胞构建细胞模型。
小鼠腹膜巨噬细胞RAW264.7采用含10% FBS的DMEM
培养基，37 ℃，5% CO2环境培养。脂多糖（LPS）由
PBS配制成4 μg/mL储备液，-20 ℃保存。造模时调整
细胞密度至1×105 cell/mL，采用96孔培养板铺板，每
孔添加180 μL细胞，培养12 h待细胞贴壁后。将终质
量浓度为200 ng/mL的 LPS以及不同浓度的肾茶副产物
提取物共同加入刺激细胞24 h。取上清，Griess法测定
NO[8]，酶标仪550 nm处读取光吸收值，亚硝酸钠标准
曲线用于计算样品中实际亚硝酸根的量；ELISA法测
定肿瘤坏死因子α（TNF-α）的含量，操作方法遵照
说明书提示进行。
1.5 肾茶副产物提取物对巨噬细胞炎症相关基因表达
的影响
构建LPS诱导的RAW264.7细胞构建细胞模型。选
取200 μg/mL肾茶副产物提取物为肾茶副产物处理组
作用浓度。分别采用RNAiso试剂和cDNA合成试剂盒
提取总RNA和合成cDNA，采用SYBR法进行荧光定量
PCR反应。
反应所用引物由上海生工生物工程有限公司合
成，序列见表1。反应条件：预变性30 s，然后95 ℃
5 s，60 ℃ 30 s，40个循环，反应在ABI step-one荧光
定量PCR仪上进行，反应结束后进行熔解曲线测试。
持家基因GAPDH被用作参照基因，采用2-ΔΔCt法计算
基因相对表达[9]。
表1 试验所用引物
基因 引物(5’→3’) 参考文献
IL-1β F：C AACCAACAAGTGATATTCTCCATGR：GATCCACACTCTCCAGCTGCA [10]
IL-10 F：GGTTGCCAAGCCTTATCGGAR：ACCTGCTCCACTGCCTTGCT [10]
IL-2 F：GCACCTGGAGCAGCTGTTGR：AGGTTCCTGTAATTCTCCACCTG [11]
IL-4 F：GGAGAGGATGTGCCAAACGR：GCACCTTGGAAGCCCTACAG [11]
GAPDH F：CTTCACCACCATGGAGAAGGCR：GGCATGGACTGTGGTCATGAG [12]
1.6 牛乳腺上皮细胞的分离培养
参照Ylva Strandberg等[13]的方法，无菌采取5~10 g
健康初生牛乳腺组织，剪碎后采用胶原酶37 ℃消化
4 h，采用密度梯度离心法分离上皮细胞[14]。分离得到
的细胞采用含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素，100
μg/mL链霉素，100 μg/mL卡那霉素，500 μg/mL胰岛
素，100 μg/mL皮质醇，1 μg/mL表皮生长因子的1︰1
DMEM/F12培养基于37 ℃，5% CO2环境下培养。根据
生长情况换液和消化传代。约7 d后进行试验。
1.7 牛乳腺上皮细胞的鉴定
通过免疫荧光法检测培养的细胞的标志性蛋
白——角蛋白18来初步验证所培养细胞的上皮细胞特
性：正常培养的乳腺上皮细胞以1×105/孔的密度接种
于6孔板中，37 ℃正常培养12 h以使其贴壁。洗去培养
基后，PBS漂洗细胞两次，加入1 mL 4%多聚甲醛，室
温孵育20 min，弃去多聚甲醛，PBS洗3次，加入1 mL
含1% BSA的PBS，37 ℃孵育1 h，弃去PBS，不洗。加
入500 μL稀释好的角蛋白18一抗或PBS，湿盒中4 ℃
孵育过夜，PBS洗5次除去一抗，加入稀释好的二抗或
PBS，37 ℃孵育1 h，PBS洗5次除去二抗，加入少许抗
荧光猝灭封片剂封片，荧光显微镜下观察并拍照。
1.8 肾茶副产物对过氧化氢诱导的牛乳腺上皮细胞损
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伤的保护作用
用培养液将细胞沉淀调整至终密度为1.0×105 cell/
mL，肾茶副产物处理组加入终质量浓度为200 μg/mL
的肾茶副产物提取物于96孔板或6孔板中在37 ℃，
5% CO2培养箱中共孵育12 h，而后氧化应激组及肾茶
副产物处理组加入终浓度为1 mmol/L的过氧化氢，共孵
育1 h[15]。弃去培养液，采 用MTT法测定细胞活力。简
言之，用培养液将细胞沉淀调整至终密度为1.0×105
cell/mL，与10%胎牛血清、青霉素-链霉素双抗及相
应浓度的肾茶副产物提取物于96孔板中在37 ℃，5%
CO2培养箱中共孵育12 h，反应体系体积为100 μL。而
后弃去培养基，PBS洗两次，每孔加入10 μL MTT溶液
（5 mg/mL），孵育4 h，然后每孔加入100 μL 10% SDS，
过夜反应。采用酶标仪于570 nm下检测吸光度。
在6孔板中培养的细胞采用胰酶消化后收集，超
声波破碎，3 500 g 10 min离心取上清，采用南京建成试
剂盒测定细胞匀浆液中超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱
甘肽过氧化物酶（GSH-px）及过氧化氢酶（CAT）。
1.9 统计分析
利用SPSS 17.0软件对数据进行ANOVA单因素方
差分析，采用LSD法进行组间多重比较，p＜0.05表示
差异显著，所有数据采用平均值±标准误表示。
2 结果与分析
2.1 肾茶副产物提取物的性质及多酚含量
10 kg肾茶副产物经水提、过滤、喷 雾干燥后，
搜集得到提取物粉末(68.2±2.7) g（n=3），得率
为6.82%±0.27%。提取物为棕褐色粉末，易吸收
空气中的水 分。经测定，提取物中总多酚含 量为
5.82%±0.34%。
2.2 肾茶副产物提取物的DPPH自由基清除能力
如图1所示，肾茶副产物提取物有一定的DPPH自
由基清除能力，且随浓度的升高而清除能力增强，
IC50=184 μg/mL。与阴性对照比较，所有试验浓度均
具有显著差异（p＜0.05）。而10 μg/mL VC阳性对照
的DPPH自由基清除能力为86.48%±1.04%。
图1 肾茶副产物提取物体外清除DPPH自由基的能力
2.3 肾茶副产物提取物的体外抗炎能力
LPS诱导的RAW264.7细胞模型测试肾茶副产物提
取物的抗炎活性。NO和TNF-α均具有介导细胞免疫和
炎症反应的作用。图2显示了肾茶副产物提取物对LPS
诱导的RAW264.7细胞NO和TNF-α的调节作用。结果
表明，低质量浓度（＜30 μg/mL）的肾茶副产物提取
物对NO不具有抑制作用，且NO浓度还略有上升，但
高质量浓度（＞100 μg/mL）的肾茶副产物提取物 能
显著降低NO的。低浓度的肾茶副产物提取物对TNF-α
产生无显著作用，但随着肾茶副产物提取物浓度的升
高，TNF-α的浓度则一直降低，当肾茶副产物提取物
质量浓度高于（含）75 μg/mL 时，能显著降低培养液
中TNF-α的浓度。
*与LPS+，肾茶副产物提取物浓度为0组别比较具有显著差异
（p＜0.05）
图2 肾茶副产物提取物对LPS诱导的RAW264.7细胞
上清中一氧化氮(NO)及肿瘤坏死因子-α（TNF-α）
的调节作用
2.4 肾茶副产物提取物对LPS诱导的RAW264.7免疫
相关基因表达的影响
图3显示LPS诱导能显著激活免疫相关因子IL-
1β、IL-2的表达，对IL-4表达无影响，其中LPS
诱导的RAW264.7细胞IL-10基因表达高于对照组
（p=0.12），但不显著。肾茶副产物提取物能显著降
低IL-1β、IL-2的表达，提高IL-10的表达，但对IL-4
表达无影响。
OS，肾茶副产物提取物；每种基因不同字母表示存在显著差异
（p＜0.05）
图3 肾茶副产物提取物对LPS诱导的RAW264.7免疫
相关基因表达的影响
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2.5 分离培养细胞的上皮细胞特性鉴定
角蛋白是上皮细胞的标志性蛋白之一，常常用来
对上皮细胞进行鉴定。采用免疫荧光法对所培养的
细胞进行角蛋白18鉴定，结果表明（图3），所培养
的细胞能表达上皮细胞标志性蛋白——角蛋白18[图
3（a）]，二抗与细胞无非特异性结合[图3（b）]，初
步判定所分 离得到的细胞为乳腺上皮细胞。
（a）角蛋白一抗+FITC标记二抗； （b）PBS+FITC标记二抗
图4 免疫荧光观察培养细胞的角蛋白18表达情况
2.6 肾茶副产物添加对牛乳腺上皮细胞细胞活力的
影响
如图4所示，在不添加过氧化氢时，较低质量浓
度肾茶副产物提取物（10~1 000 μg/mL）处理能提高
牛乳腺上皮细胞的活力，其中200~800 μg/mL的肾茶
副产物提取物处理与未添加组比较有显著差异。而高
质量浓度（1 500 μg/mL）则表现出抑制作用，但不具
有显著作用。采用1 mmol/L过氧化氢处理1 h后，细胞
活力显著下降（p＜0.05），肾茶副产物提取物添加对
过氧化 氢造成的牛乳腺上皮细胞活力下降有减弱，当
添加量达到200 μg/mL时，与未造模组（未添加肾茶
副产物提取物）吸光度一致。对于过氧化氢造模组，
当添加量为800 μg/mL时，细胞活力达到最高值，随
后缓慢下降。事实上，在采用更高质量浓度的肾茶副
产物提取物（2 000~3 000 μg/mL）试验时，对牛乳腺
上皮细胞有显著的抑制作用，但由于采用更高浓度肾
茶副产物提取物试验时，会有部分物质析出，因此结
果并不稳定，在结果中未予采用。
*与阴性对照（未添加肾茶副产物提取物）比较有显著差异
（p＜0.05）
图5 肾茶副产物添加对牛乳腺上皮细胞活力的影响
2.7 肾茶副产物添加对牛乳腺上皮细胞细胞抗氧化能
力的影响
表2表明，肾茶副产物添加能显著提高乳腺上皮
细胞抗氧化酶SOD、GSH-Px活力的表达。能提高CAT
表达，但不显著。
表2 肾茶副产物添加对牛乳腺上皮细胞细胞抗氧化
酶活力的影响
项目 对照 H2O2 H2O2+OS
SOD/(U/mg蛋白) 28.10±4.05a 15.29±0.51c 19.04±0.61b
GSH-Px(U/mg蛋白) 9.08±0.46 a 5.22±0.21 b 6.04±0.54 b
CAT(U/mg蛋白) 12.13±0.45a 8.47±1.14b 10.67±1.03ab
注: 同一行不同字母间表示有显著差异(p<0.05)。
3 讨论
大量研究表明，肾茶副产物的提取物包括黄酮
类、酚酸类、萜类、烷基糖苷类[3]。其中酚类物质被
认为是许多生物活性如抗氧化、抗炎的关键。因此，
试验对肾茶副产物提取物中酚类物质的含量进行了
测定。
巨噬细胞是一类重要的免疫细胞，巨噬细胞能识
别异物，使自身活化，活化后产生诱导型一氧化氮合成
酶（inducible nitric oxide synthase，INOS），在还原型辅
酶Ⅱ（NADPH）或四氢生物喋呤（tetrahydrobiopterin）
存在条件下，催化精氨酸与氧分子反应，生产胍氨
酸和一氧化氮，产生杀菌作用，也诱发炎症[16]。而
TNF-α是巨噬细胞释放的一种重要的细胞因子，在炎
症反应、细胞免疫等过程中发挥关键作用[17]。结果表
明，LPS诱导显著提高了 细胞中NO和TNF-α的表达，
产生了炎症。而肾茶副产物提取物的添加则显著降低
了NO和TNF-α的含量，这可能由于肾茶副产物提取
物中酚类物质含量较高，具有很强的抗氧化效果（图
1），能清除巨噬细胞RAW264.7受到LPS诱导后呼吸
爆发产生的自由基，同时NO也是一种自由基和信号
分子，诱导炎症反应的发生。因此肾茶副产物提取物
的添加显著降低NO和TNF-α的含量。而在低浓度肾茶
副产物提取物添加时，NO含量反而上升，这可能是
由于肾茶副产物本身也是一种异物，会引起巨噬细胞
的免疫反应，这一结果与Hsu等[18]是一致的。
IL-1β、IL-2是典型的促炎症因子，IL-4和IL-10
则被认为是抗炎性细胞因子[19]。研究表明，LPS诱导
显著上调了RAW264.7细胞中促炎症因子IL-1β、IL-2
的表达，但抗炎性因子IL-10也略有增加，这可能是
RAW264.7细胞在呼吸爆发后启动了负反馈调节机
制[20]。而肾茶副产物提取物的添加则显著降低了促炎
症因子的表达，提高抗炎性细胞因子的表达，这提示
肾茶副产物提取物能有效的减轻机体的炎症反应。
炎症反应中巨噬细胞和中性粒细胞呼吸爆发产生
大量自由基，能起到消灭病原菌的作用，但也会引起
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周边组织的凋亡和坏死。研究采用密度梯度离心法分
离得到荷斯坦奶牛乳腺上皮细胞，并验证了其角蛋白
18的表达，证实成功分离了乳腺上皮细胞。MTT试验
结果（图5）显示在氧化应激胁迫下，肾茶副产物提
取物能提高乳腺上皮细胞的抗氧化酶活性（表2），
帮助细胞恢复氧化平衡，并能提高乳腺上皮细胞活
力，提示肾茶副产物提取物能在炎症诱导的氧化应激
中保护乳腺上皮细胞。而高浓度肾茶副产物提取物对
乳腺上皮细胞的抑制也提示在使用肾茶副产物添加时
要对使用量进行摸索。
奶牛乳腺炎的发生导致牛奶体细胞增多，严重影
响乳品品质。目前采用的单一抗生素治疗弊端逐渐显
现，因此寻找一种有效、合理的天然成分作为防治奶
牛乳房炎显得十分必要。肾茶是流行于马来西亚、菲
律宾等东南亚国家的一种保健饮品，其安全性已得到
了广泛的证实[3]。肾茶副产物提取物已被证实具有自
由基清除、抗菌、抗肿瘤和抗炎症等多种生物活
性[4]，且人工栽培和快繁技术的成熟[21]为肾茶的成本
降低奠定了基础。
4 结论
采用肾茶副产物粗提物，研究其抗炎症及对乳腺
上皮细胞的保护作用，结果表明肾茶副产物提取物有
良好的体外抗炎症效果，能保护乳腺上皮细胞减轻其
氧化应激损伤，且与作用浓度密切相关。提示肾茶副
产物提取物可以作为一种添加剂解决奶牛的乳腺炎问
题，为解决牛奶中体细胞增多提供新的思路。
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